一种新型的MAP4K4活性药物抑制剂能够减轻与代谢紊乱相关的脂肪性肝炎症状

《JHEP Reports》：A novel pharmacological inhibitor of MAP4K4 activity attenuates metabolic dysfunction-associated steatohepatitis

　　费利克斯·安帕杜 | 尼基尔·帕蒂尔 | 文卡特斯瓦拉罗·伊达 | 乌莉娅·鲁斯 | 韦恩乔尔·钟 | 哈桑·M·阿布·舒凯尔 | 安扎·阿里 | 尤里亚娜·阿吉拉尔-桑切斯 | 太圭·奥 | 维布胡杜塔·阿瓦斯特希 | 阿迪蒂亚·D·乔希
美国德克萨斯A&M大学兽医生理学与药理学系，学院站，德克萨斯州77843

**摘要**
**背景与目的**
代谢功能障碍相关的脂肪性肝病（MASLD）是一种进行性疾病，是全球肝病相关发病率的主要驱动因素。其晚期形式——代谢功能障碍相关的脂肪性肝炎（MASH）的特点是肝脂肪变性、炎症、肝细胞膨胀和纤维化。本研究旨在确定MAP4K4（丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶4）作为治疗靶点的重要性，并评估一种新型小分子抑制剂——葡萄糖基吡咯并嘧啶酮（GPPD）在缓解MASH中的作用。

**方法**
通过免疫组化方法量化了健康个体（n=5）和MASLD患者（n=20）肝活检样本中的MAP4K4表达水平。在用人源原代肝细胞、小鼠肝类器官、HepG2细胞和AML12细胞（经油酸处理）中评估了GPPD的体外效果及基因沉默MAP4K4（siRNA）的效果。为了进行体内验证，小鼠被喂食高脂肪/高果糖/高胆固醇饮食，并用GPPD处理30周（每组n=8只）。通过单核RNA测序分析肝脏，以确定GPPD介导的肝保护作用分子机制。数据使用ANOVA模型进行分析，结果以均值±标准差（SD）表示，p<0.05的差异视为显著。

**结果**
与健康对照组相比，MASLD患者的肝MAP4K4表达显著升高，且这与疾病严重程度相关。在多个体外模型中，基因沉默和GPPD处理均显著减少了脂肪变性。在体内实验中，预防性使用GPPD可降低体重增加和脂肪堆积，同时保护肝脏免受脂肪变性、炎症和纤维化的损害。机制上，虽然GPPD直接抑制MAP4K4活性，但其肝保护效应与抑制CaMK2（钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II）有关。

**结论**
我们的研究表明，葡萄糖基吡咯并嘧啶酮通过调节MAP4K4-CaMK2轴来减轻伴有纤维化的脂肪性肝炎。进一步研究GPPD有望将其发展为一种有效的MASH治疗策略。

**影响与意义**
本研究发现MAP4K4-CaMK2信号通路是MASH发病机制中的关键通路。通过证明GPPD对该途径的抑制可以减轻MASH的主要特征（包括脂肪变性、炎症和纤维化），我们的发现为未来的治疗干预提供了机制框架。此外，针对MAP4K4可能解决目前批准治疗方法不适用的患者的重要需求。总体而言，这项研究为开发旨在恢复整个疾病过程中代谢稳态的下一代小分子药物奠定了转化基础。

**引言**
代谢功能障碍相关的脂肪性肝病（MASLD）是最常见的慢性肝病类型，影响约25%的美国人，常与肥胖和糖尿病相关[1]。其表现形式从简单的脂肪变性到严重的脂肪性肝炎（MASH）不等，后者可能进展为肝硬化乃至肝细胞癌[2]。MASH是一种以肝脂肪变性、细胞膨胀、炎症和纤维化为特征的致残性疾病[3]。由于复杂的多种因素影响，MASLD的精确发病机制尚未明确[4]。最近，甲状腺激素受体β激动剂resmetirom和GLP1激动剂semaglutide获得了FDA的加速批准，仅用于治疗中度至重度纤维化[5][6][7]。因此，寻找新的靶点并开发能够治疗MASH所有形态和代谢表现的小分子药物具有重要意义。
丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶4（MAP4K4）属于Ste20样激酶家族[8]，参与多种病理生理过程，包括恶性肿瘤、心血管疾病、炎症和代谢性疾病[8][9]。最近发现，肝MAP4K4表达与临床MASLD活动评分的严重程度呈正相关[10]。此外，在油酸处理的肝细胞中，MAP4K4过度表达会加剧脂肪变性，而MAP4K4沉默则可减少脂肪变性和脂毒性[10]。尽管在临床前研究中显示出潜力，但第一代抑制剂未能获得良好的安全性，这为下一代小分子药物的研发创造了机会。
在本研究中，我们在MASLD患者、体内诱导的MASH小鼠模型及体外MASH模型中确认了肝MAP4K4表达的上调。首先验证了这一靶点，随后研究了新合成的MAP4K4抑制剂葡萄糖基吡咯并嘧啶酮（GPPD）的预防潜力[11]。GPPD可保护肝细胞免受脂毒性，并减轻MASH的脂肪堆积和病理特征，其肝保护效应与抑制MAP4K4调控的钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（CaMK2）信号通路有关。

**材料与方法**
关键生化试剂的来源见补充材料CTAT表格。

**细胞培养和体外处理**
AML12细胞在含有10%胎牛血清（FBS）、1% 100倍胰岛素-转铁蛋白-硒、40 ng/ml地塞米松和1% 100倍青霉素-链霉素溶液的DMEM:F12培养基中培养。AML12细胞源于小鼠肝细胞，具有代谢活性，常用于体外MASH模型[12][13][14][16]。HepG2细胞在含有10% FBS和1% 100倍青霉素-链霉素的MEM培养基中生长。小鼠原代肝细胞通过胶原酶灌注法分离，并在含有10% FBS和1% 100倍青霉素-链霉素的Williams E培养基中培养[17][18]。冷冻保存的人源肝细胞解冻后接种在胶原包被的孔板上。冷冻保存的小鼠肝类器官在HepatiCult生长培养基中的Matrigel包被板上生长。所有细胞均在37°C、5% CO2的潮湿环境中培养。

**MAP4K4敲低**
使用METAFECTENE? FluoR试剂将AML12细胞转染50 nM MAP4K4 siRNA和非靶向siRNA（NT siRNA），孵育24小时。对于过表达研究，小鼠原代肝细胞同样转染Camk2b/pCMV-SPORT6质粒24小时。细胞用500 μM BSA-油酸（OA）复合物或相应的BSA对照组处理。必要时，加入100 μM GPPD共处理24小时。GPPD的合成方法如前所述[11]。二甲基亚砜用作GPPD处理的溶剂对照。

**动物和体内处理**
根据机构动物护理和使用委员会指南，使用8周大的雄性C57BL/6J小鼠（杰克逊实验室）。小鼠饲养在塑料笼中，铺有玉米芯垫料，置于气候/温度控制的环境中，遵循标准的12小时光照/黑暗周期。适应一周后，随机分配到三个饮食组（每组n=8只）：对照组（CD）、MASH饮食组（MD）和MD+GPPD组（每组n=8只），持续30周。MD饮食组包含40 kcal%脂肪、20 kcal%果糖和2%胆固醇，自由进食。MD+GPPD组的小鼠每周一、周三和周五接受10 mg/kg（体重）GPPD腹腔注射。CD组和MD组的小鼠则接受0.2% DMSO的溶剂对照。GPPD的剂量根据之前的14天急性毒性研究确定最大耐受剂量（MTD）。简而言之，C57BL/6小鼠（n=6）接受单剂量的GPPD（20至1,000 mg/kg，腹腔注射），并监测死亡情况和临床症状。在剂量高达200 mg/kg时未见死亡或显著体重下降；但在≥400 mg/kg时出现死亡。因此，GPPD的MTD确定为200 mg/kg。在30周的预防性研究中，给予10 mg/kg（MTD的1/20）剂量以确保高安全边际和持续的系统暴露。
在整个研究期间，每周测量体重和食物摄入量。第28周后，从CD组随机选择4只小鼠，从MD组和MD+GPPD组各选择6只小鼠（使用Graphpad’s QuickCalcs模块和Dotmatics）进行体质成分分析和间接热量测定。第30周结束时，使用异氟醚过量安乐死小鼠并取出重要器官。切除腹股沟白色脂肪组织和肝脏并称重，并从血液样本中分离血清。

**体质成分和间接热量测定**
使用Echo MRI全身成分分析仪（Echo Medical Systems）评估体质成分。使用Promethion Core代谢系统（Sable Systems）进行代谢表型分析（能量消耗、O2消耗、CO2产生和身体活动）。小鼠单独饲养在代谢笼中，适应48小时后测量72小时的活动量。

**脂质滴可视化**
根据制造商说明，使用Oil Red O Stain Kit或BODIPY染色细胞以显示脂质积累，并使用Echo Revolve荧光显微镜（Discover Echo）成像。对于小鼠肝类器官，切片用SlowFade? Gold Antifade与DAPI（4′,6-二氨基-2-苯基吲哚）处理以染色细胞核，然后用SP8共聚焦显微镜（Leica）成像。

**组织病理学、免疫组化和免疫细胞化学**
小鼠肝脏和白色脂肪组织用10%中性缓冲福尔马林固定，石蜡包埋，切片（4 μm），并用苏木精-伊红（H&E）或picrosirius red染色。对于F4/80染色，石蜡包埋的切片脱蜡、重新水化，并使用IHCeasy Ready-To-Use IHC试剂盒进行抗原恢复。30分钟封闭后，用抗F4/80抗体（1:4,000）孵育1小时，接着用多抗体HRP-兔抗鼠（1:5,000）孵育。使用SlowFade? Gold Antifade作为封片介质。图像使用Echo Revolve显微镜捕获，组织学分析结果盲法处理。

**人类肝组织微阵列**
来自仅有肝脂肪变性且无饮酒史的男性和女性捐献者（n=20；13名男性和7名女性）以及健康对照组（n=5；3名男性和2名女性）的肝组织用4%戊二醛固定，用0.2% TritonX-100渗透处理，并封闭1小时。切片用抗MAP4K4抗体（1:200）在4°C下孵育过夜，然后用Alexa Fluor 488标记的兔抗鼠IgG（1:200）二次染色。使用SlowFade? Gold Antifade处理后，用Echo Revolve显微镜成像。同样，HepG2细胞、AML12细胞和小鼠原代肝细胞也进行固定、染色和成像。

**甘油三酯、胆固醇和游离脂肪酸（FFA）的测定**
使用Triglyceride-Glo Assay、Cholesterol/Cholesterol Ester-Glo Assay和FFA assay kit分别测定培养细胞裂解液和组织匀浆中的甘油三酯、胆固醇和FFA含量。FFA摄取量测定使用QBT脂肪酸摄取试剂盒（Molecular Devices），方法如前所述[13][19]。荧光/发光测量使用Synergy 2微孔板读数仪（Agilent，加州圣克拉拉）。

**丙氨酸氨基转移酶（ALT）**
使用ALT活性测定试剂盒（abcam）测定血清ALT。

**RNA分离和定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）**
使用TRIzol试剂提取总RNA。使用iScript cDNA合成试剂盒从1 μg总RNA合成第一条链cDNA。使用基因特异性primers（补充材料CTAT表格）和PowerUp SYBR Green Master Mix在CFX Opus实时PCR系统（Bio-Rad）上进行定量RT-PCR。相对表达水平以18S核糖体RNA为参考进行归一化。

**Western blotting**
蛋白质通过SDS-PAGE电泳分离后转移到低荧光PVDF膜上（使用Trans-Blot Turbo系统，Bio-Rad）。使用针对MAP4K4、CaMK2、phospho-CaMK2、Akt、phospho-Akt、JNK和phospho-JNK的特异性抗体进行检测。使用荧光二级抗体在ChemiDoc MP系统（Bio-Rad）上成像。

**MAP4K4活性**
为了测定GPPD的抑制浓度，在不含细胞的激酶测定中使用了0.5 nM重组MAP4K4（缓冲液：54 mM HEPES pH 7.5、20 μM ATP、1.2 mM DTT、0.012% Brij-35、1%甘油、0.2 mg/ml BSA、0.5 mM EGTA、10 mM MgCl2、15 μM CSox sensor AQT0135；AssayQuant Technologies）。GPPD浓度在3倍范围内变化，加入1% DMSO。反应在30°C下孵育240分钟，使用Synergy Neo 2微孔板读数仪连续读数（Ex/Em = 360/485 nm）。

**组织和细胞裂解液中的MAP4K4活性**
使用抗MAP4K4抗体免疫沉淀MAP4K4，沉淀物悬浮在激酶测定缓冲液（25 mM Tris-HCl pH 7.5、5 mM β-甘油磷酸盐、2 mM dithiothreitol、0.1 mM sodium orthovanadate、10 mM MgCl2）中，其中含有20 μM ATP?S和1 μg Myelin basic protein（MBP）。激酶反应在30°C下进行20分钟，如前所述[20]。然后用p-nitrobenzyl mesylate烷基化2小时后，样品在5x SDS加载染料中煮沸5分钟，通过SDS-PAGE分离，并用抗-phospho(Ser195)-MBP抗体染色。相对激酶活性通过phospho-MBP与免疫沉淀MAP4K4条带的强度比值确定[21]。

**GPPD对细胞内Ca2+的影响**
在4室滑片上培养的小鼠原代肝细胞中研究GPPD对细胞质Ca2+的影响。处理500 μM OA和100 μM GPPD 24小时后，让细胞恢复到室温，然后将培养基替换为Tyrode溶液（140 mM NaCl、5.3 mM KCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、0.33 mM NaH2PO4、10 mM HEPES、10 mM葡萄糖，pH 7.4）。每孔加入400 μl 4 μM Cal-520 AM处理30分钟，然后用Tyrode溶液漂洗30分钟。细胞图像是用Carl Zeiss公司的LSM 780共聚焦显微镜拍摄的，Cal-520信号（Ex/Em 469/525 nm）通过Fiji/ImageJ软件进行量化处理，背景值从无细胞区域测量后从每个视野中减去。单个核RNA测序（snRNA seq）来自CD、MD和MD+GPPD组的肝组织样本（20 mg）被合并后进行snRNA测序（Novogene公司）。制备了单个核悬浮液（Chromium Single Cell 3’ Reagent Kits v3，10x Genomics），并将其加载到Chromium Controller中以分割成Gel Bead-in-Emulsions（GEMs）。在GEMs内进行逆转录以生成条形码标记的全长cDNA，随后进行回收和扩增。cDNA被酶切片段化、末端修复、加A尾，并与Illumina兼容的测序接头连接。文库经过索引和Qubit dsDNA高灵敏度测定后，使用AATI Fragment Analyzer进行大小检测。最终文库被标准化并合并。按照10x Genomics的建议，在Illumina NovaSeq X Plus（PE150模式）上进行测序。原始测序数据使用Cell Ranger（10x Genomics）进行处理。质量控制步骤包括根据线粒体基因含量和UMI阈值过滤掉低质量细胞。使用Seurat进行归一化、降维和聚类。采用UMAP进行可视化分析。为了计算差异表达和模块评分，量化了Camk2a、Camk2b、Camk2d和Camk2g的表达水平。通过使用Seurat的AddModuleScore函数计算Camk2相关模块的评分来评估通路活性。数据可视化使用ggplot2和Seurat绘图功能完成。

**统计分析**
动物和样本数量是根据我们之前的观察结果以及使用G*Power统计软件套件（α = 0.05和β = 0.80）[3]、[22]确定的。数据使用GraphPad Prism（Dotmatics）中的单变量ANOVA模型进行分析。在总体F检验显著后，对预先指定的组进行Dunnett程序的后续多重比较。所有结果表示为平均值±标准差（SD），差异在p < 0.05时被认为是显著的。

**结果**
1. **MASLD患者中MAP4K4表达上调**
20例无酒精使用史的MASLD患者（具有脂肪变性）和5例健康对照者的肝活检样本进行了免疫荧光分析以评估MAP4K4表达水平。我们观察到MASLD患者的MAP4K4表达水平高于健康个体（图1A）。此外，我们还在模拟MASLD特征的OA处理的HepG2细胞、AML12细胞和小鼠原代肝细胞中检测了MAP4K4表达。在所有OA处理的细胞类型中，MAP4K4表达显著升高（图1B）。

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**图1. MASLD患者中MAP4K4表达上调。** A）含有20例MASLD患者（13名男性和7名女性）和5名健康个体（3名男性和2名女性）的肝活检样本的肝组织微阵列，用anti-MAP4K4抗体进行检测。展示了健康和MASLD肝脏中MAP4K4表达的代表性图像以及平均荧光强度。B）HepG2细胞、AML12细胞和小鼠原代肝细胞在500 μM油酸（OA）处理24小时后，用anti-MAP4K4抗体检测MAP4K4表达（比例尺 = 170 μM；绿色表示MAP4K4，蓝色表示DAPI）。数据表示为平均值±SD（Welch’s t-test * p <0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001，与健康个体或溶剂组相比）。

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**图1. MASLD患者中MAP4K4表达上调。**

2. **MAP4K4沉默可减少OA处理肝细胞中的脂肪变性和脂质生成**
为了研究MAP4K4在MASLD中的重要性，我们在AML12细胞和小鼠原代肝细胞中使用RNA干扰技术减弱了MAP4K4表达，然后检查OA处理后的脂质积累情况。在AML12细胞中，qRT-PCR证实了MAP4K4的敲低（补充图1A）。OA处理增加了 scramble（NT-siRNA）转染细胞的脂质积累（通过Oil Red O染色显示），而MAP4K4 siRNA转染细胞则表现出减少的OA诱导脂肪变性（补充图1B）。为了进一步研究MAP4K4对长链脂肪酸移动性的影响，我们测量了荧光脂肪酸类似物BODIPY-十二烷酸的细胞内摄取情况。MAP4K4下调导致FFA摄取减少（补充图1C）。因此，与对照组相比，OA处理和MAP4K4沉默细胞的FFA和三酰甘油含量分别减少了约40%和约65%（补充图1D-E）。这些结果表明MAP4K4在肝细胞脂质代谢中起重要作用，这与先前的体外研究发现一致，即MAP4K4 siRNA减少了由内质网或氧化应激引起的人类肝细胞中的脂肪变性和凋亡[10]。此外，MAP4K4沉默显著降低了促进肝细胞长链脂肪酸摄取的CD36基因，以及参与从头脂质生成的Scd1、Srebp1和Gpat1基因（补充图1F）。在MAP4K4沉默响应中，参与线粒体β-脂肪酸氧化的肉碱棕榈酰转移酶1（Cpt1）的表达显著上调。MAP4K4敲低还减少了促炎单核细胞趋化因子蛋白（MCP1）和含有EGF样模块的黏蛋白样激素受体1（F4/80）（补充图1F）。同样，在OA处理的小鼠原代肝细胞中，MAP4K4沉默也减少了脂肪积累，这与AML12细胞中的观察结果一致（补充图2）。

**GPPD在体外减轻MASLD的特征**
鉴于MAP4K4在MASLD中上调，并且在体外敲低能够防止脂毒性，我们评估了我们新合成的MAP4K4抑制剂GPPD在体外和体内MASLD模型中的保护效果。GPPD（图2A）是一种通过无催化剂方法合成的小分子抑制剂[11]，在15 nM浓度下显示出50%的激酶活性抑制（IC50）（图2B）。为了研究GPPD对MAP4K4表达和活性的影响，OA处理的HepG2细胞用100 μM GPPD处理24小时。Western印迹显示OA增加了MAP4K4表达，而GPPD对OA诱导的MAP4K4水平没有影响（图2C）。然而，GPPD显著降低了OA处理和对照细胞中的MAP4K4激酶活性（图2D）。接下来，我们研究了GPPD在OA处理的HepG2细胞、人类原代肝细胞、AML12细胞和小鼠肝类器官中防止脂毒性的能力。同时使用GPPD处理显著减少了BODIPY493/503荧光测量的OA诱导脂肪变性（图2E）。GPPD处理的HepG2细胞中OA诱导的FFA摄取、细胞内FFA和甘油三酯含量也显著降低，表明GPPD干扰了脂质的摄取和代谢（图2F-H）。因此，GPPD处理显著降低了暴露于OA的HepG2细胞中参与脂肪酸摄取和合成的基因（CD36、GPAT1、DGAT1、SREBP1、SCD1）和炎症相关基因（MCP1和F4/80）的表达（图2I）。

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**图2. 葡萄糖基吡咯并嘧啶酮（GPPD）在体外MASLD模型中减轻脂肪变性的特征。** A）GPPD的结构。B）重组MAP4K4在不同GPPD浓度下的激酶活性。C）HepG2细胞在用溶剂、油酸（OA，500 μM）、GPPD（100 μM）和OA+GPPD处理24小时后的MAP4K4表达。展示了MAP4K4表达的代表性图像，并进行了相对于肌动蛋白加载对照的量化。D）通过使用anti-MAP4K4抗体免疫沉淀MAP4K4并使其磷酸化MBP底物来确定MAP4K4活性。使用anti-phospho-MBP抗体通过Western印迹监测反应混合物中的phospho-MBP水平。直方图显示了phospho-MBP和免疫沉淀MAP4K4的相对条带强度比。E）HepG2细胞、人类肝细胞和小鼠肝类器官在BODIPY 493/503（绿色）和DAPI（蓝色）染色下的代表性图像。显示了BODIPY 493/503的平均荧光强度。F）HepG2细胞用溶剂或GPPD（100 μM）处理24小时，然后用BODIPY-十二烷酸测量FFA摄取1小时。G）HepG2细胞中的FFA含量。H）甘油三酯含量。I）使用qRT-PCR测量参与FFA摄取、从头脂质生成和炎症的基因的mRNA水平，并相对于18S rRNA进行标准化。数据表示为平均值±SD（n = 6，* p <0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001，与溶剂组相比）。

**GPPD在饮食诱导的MASH模型中减轻脂肪变性**
基于体外疗效数据的可靠性，我们检查了GPPD在C57BL6小鼠上服用MASH饮食30周的预防效果。与对照组（CD）相比，服用MASH饮食（MD）的小鼠体重明显增加（图3A-B）。GPPD处理显著减少了体重增加和肝脏质量（图3A-E）。身体成分分析显示GPPD处理的小鼠脂肪质量减少，瘦质量显著增加（图3F）。GPPD处理还减少了腹股沟白色脂肪组织（iWAT）和iWAT/体重的比例（图3G-H）。组织学上，MD+GPPD小鼠的脂肪细胞面积减少（图3I）。因此，我们发现细胞色素c氧化酶亚单位IV（COX IV）的表达增加，表明GPPD处理后线粒体活性和可能的产热增加（图3J）。这些有益效果，包括体重增加和脂肪减少，与食物摄入量的改变无关，因为MD和MD+GPPD组之间的热量消耗没有显著差异（图3K）。GPPD处理显著增加了能量消耗，表明GPPD的给药增强了代谢率，这可能与其抗肥胖效果有关（图3L-M）。此外，GPPD处理增加了氧气消耗（VO2）和二氧化碳产生（VCO2）（图3N-Q）。最后，我们还测量了运动活动以确定GPPD对能量消耗的影响是否部分归因于体力活动的增加。然而，MD和MD+GPPD组之间的运动距离没有显著差异（图3R）。

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**图3. GPPD在体内饮食诱导的MASH模型中防止体重增加并防止脂肪变性。** C57BL/6J小鼠分别服用对照饮食（CD）、高脂肪、高果糖、高胆固醇饮食（MASH饮食（MD）以及每周一、周三和周五通过腹腔注射10 mg/kg GPPD的MD+GPPD组（MD+GPPD）30周。A）体重。B）相对于原始体重的标准化体重。C）30周结束时的体重。D）30周结束时的肝脏重量。E）第30周时肝脏重量占体重的百分比。F）通过Echo-MRI测定的瘦质量和脂肪质量的百分比组成。G）研究结束时的腹股沟白色脂肪组织重量。H）第30周时腹股沟白色脂肪组织占体重的百分比。I）H&E染色的腹股沟白色脂肪组织切片的代表性图像（比例尺 = 170 μm）。同时使用ImageJ软件和ATAT v1.1.27插件确定了平均白色脂肪细胞面积（每只小鼠40-400个细胞）。J）量化COX IV表达并相对于肌动蛋白标准化后的直方图，以及iWAT中COX IV表达的Western印迹。K）根据平均每周食物摄入量计算的日均食物摄入量。L）24小时内的平均能量消耗。M）24小时内的总能量消耗。N）24小时内的总氧气消耗。O）24小时内的总二氧化碳产生。P）24小时内的总二氧化碳产生。R）小鼠在笼内的移动距离。数据表示为平均值±SD（n=8，除CD组为n=4，MD和MD+GPPD组为n=6，* p <0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001）。

**GPPD处理减轻MASH模型中的脂肪变性**
基于体外疗效数据，我们检查了GPPD在C57BL6小鼠上服用MASH饮食30周的预防效果。与对照组（CD）相比，服用MASH饮食（MD）的小鼠体重显著增加（图3A-B）。GPPD处理显著减少了体重增加和肝脏质量（图3A-E）。身体成分分析显示GPPD处理的小鼠脂肪质量减少，瘦质量显著增加（图3F）。GPPD处理还减少了腹股沟白色脂肪组织（iWAT）和iWAT/体重的比例（图3G-H）。组织学上，MD+GPPD小鼠的脂肪细胞面积减少（图3I）。因此，我们发现细胞色素c氧化酶亚单位IV（COX IV）的表达增加，表明GPPD处理后线粒体活性可能增加，从而增加了产热（图3J）。这些有益效果，包括体重增加和脂肪减少，与食物摄入量的改变无关，因为MD和MD+GPPD组之间的热量消耗没有显著差异（图3K）。GPPD处理显著增加了能量消耗，表明GPPD的给药增强了代谢率，这可能有助于其抗肥胖效果（图3L-M）。此外，GPPD处理增加了氧气消耗（VO2）和二氧化碳产生（VCO2）（图3N-Q）。最后，我们还测量了运动活动，以确定GPPD对能量消耗的影响是否部分归因于体力活动的增加。然而，MD和MD+GPPD组之间的运动距离没有显著差异（图3R）。

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**图3. GPPD在体内饮食诱导的MASH模型中防止体重增加并防止脂肪变性。** C57BL/6J小鼠分别服用对照饮食（CD）、高脂肪、高果糖、高胆固醇饮食（MASH饮食（MD）以及每周一、周三和周五通过腹腔注射10 mg/kg GPPD的MD+GPPD组（MD+GPPD）30周。A）体重。B）相对于原始体重的标准化体重。C）30周结束时的体重。D）30周结束时的肝脏重量。E）第30周时肝脏重量占体重的百分比。F）通过Echo-MRI测定的瘦质量和脂肪质量的百分比组成。G）研究结束时的腹股沟白色脂肪组织重量。H）第30周时腹股沟白色脂肪组织占体重的百分比。I）H&E染色的腹股沟白色脂肪组织切片的代表性图像（比例尺 = 170 μm）。同时使用ImageJ软件和ATAT v1.1.27插件确定了平均白色脂肪细胞面积（每只小鼠40-400个细胞）。J）量化COX IV表达并相对于肌动蛋白进行标准化的直方图，以及iWAT中COX IV表达的Western印迹。K）根据平均每周食物摄入量计算的日均食物摄入量。L）24小时内的平均能量消耗。M）24小时内的总能量消耗。N）24小时内的总能量消耗。O）24小时内的总二氧化碳产生。P）24小时内的总二氧化碳产生。R）小鼠在笼内的移动距离。数据表示为平均值±SD（n=8，除F和K-R组为CD组n=4，MD和MD+GPPD组n=6，* p <0.05, ** p<0.01, *** p<0.001, **** p<0.0001）。

**GPPD处理缓解脂肪变性、炎症和肝损伤**
我们对肝组织切片进行了脂肪变性（H&E）、纤维化（picrosirius red）和炎症（F4/80）的染色。MD饮食诱导的严重脂肪变性、肝细胞气球样变、纤维化和炎症（表现为脂滴增加、胶原沉积和炎症浸润）通过GPPD处理显著减轻（图4A）。GPPD处理还显著降低了MD对照组（图4B-C）的肝三酰甘油和胆固醇水平。此外，血清ALT（肝脏损伤的临床标志物）在MD+GPPD组中显著降低（图4D）。定量RT-PCR证实GPPD降低了参与脂肪酸运输（CD36）、从头脂质生成和三酰甘油合成（Acc1、Scd1、Srebp1、Gpat1、Gpat2、Dgat1）和炎症（TNFα、TGFβ）的基因（图4E）。此外，我们观察到MD+GPPD组肝脏中的胶原蛋白类型1 alpha 1（Col1a1）和平滑肌α肌动蛋白（Acta2）显著减少，这些是纤维化的标志物（图4E）。最后，MD组中的MAP4K4表达和激酶活性显著增加，而GPPD处理抑制了MAP4K4的活性，但没有显著降低其蛋白表达（图4F-G），这证实了体外观察结果。总体而言，我们的数据表明GPPD处理下调了MAP4K4的激酶活性并减轻了脂肪性肝炎的特征。

**A) H&E染色、Sirius红染色和F4/80染色的肝脏切片代表性图像（比例尺=170 μm）。直方图中显示了NAS和Brunt纤维化评分。B) 肝脏三酰甘油。C) 肝脏胆固醇含量。D) 血清ALT水平。E) 与18S rRNA标准化的参与FFA摄取、从头脂生成、炎症和纤维化的基因表达。F) MAP4K4的代表性Western印迹及其相对于肌动蛋白的定量。G) 肝组织中的MAP4K4活性。使用抗MAP4K4抗体从组织裂解物中免疫沉淀MAP4K4，并使其磷酸化MBP底物。通过使用抗磷酸化MBP抗体通过Western印迹监测反应混合物中的磷酸化MBP水平。直方图显示了磷酸化MBP和免疫沉淀MAP4K4的相对条带强度比。数据表示为平均值±标准差（n=8，* p <0.05，** p<0.01，*** p<0.001，**** p<0.0001）。

GPPD通过调节CaMK2来抑制脂肪性肝炎。我们进行了snRNA-seq分析，以确定GPPD在多种肝脏细胞群体中预防脂肪性肝炎的分子机制。snRNA-seq分析显示，在不同饮食条件下，实质细胞和非实质细胞群体存在明显差异（图5A-B）。整合肝细胞、内皮细胞、胆管细胞、免疫细胞和基质细胞亚群的数据表明，MD组和MD+GPPD组的小鼠肝脏微环境发生了显著重塑（图5B）。细胞类型注释得到了标志基因表达的支持（补充图3A）。数据显示，GPPD处理后多个基因和信号通路发生了改变。在肝细胞中，我们的分析重点关注GPPD处理后“激酶”的表达变化，发现钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶2（Camk2）和非典型激酶Mapk15（ERK7/8）的表达显著上调（补充表1）。snRNA分析进一步揭示，在MD+GPPD组中，中央、中中和门静脉肝细胞中的Camk2β异构体（Camk2b）以及pan-Camk2表达评分下降（图5C-F）。GPPD处理还减少了星形细胞中Camk2a和Camk2b异构体的表达，尽管它们的相对丰度低于其他Camk2异构体（补充图3B）。在内皮细胞和Kupffer细胞中，GPPD没有改变Camk2b异构体的表达（补充图3C-D）。免疫印迹证实GPPD处理后CaMK2的表达和磷酸化减少（图5G-I）。

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图5. GPPD调节CaMK2信号通路。A) 综合肝脏单核转录组的UMAP可视化，显示主要的肝脏和非实质细胞类型。B) 不同饮食条件下细胞类型比例的堆叠条形图（CD，MD，MD+GPPD）。C) 中央、D) 中中和E) 门静脉肝细胞中受MD+GPPD调控的基因火山图。Camk2b用蓝点标出。x轴和y轴分别代表log2倍数变化和?log10(FDR)。F) Camk2评分的热图（所有异构体一起）以及肝细胞中个别Camk2异构体的点图。G) 来自CD、MD和MD+GPPD小鼠肝脏的CaMK2和磷酸化CaMK2的代表性Western印迹。H) 相对于CD组，CaMK2表达的定量并标准化为肌动蛋白。I) 相对于CD组的磷酸化CaMK2/CaMK2比率。数据表示为平均值±标准差（n=8，* p <0.05，** p<0.01，*** p<0.001，**** p<0.0001）。

为了确定CaMK2是否作为MAP4K4的下游效应器，我们通过将Camk2b/pCMV-SPORT6载体转染小鼠原代肝细胞实现了CamK2的异位过表达（图6A-B）。与对照组相比，过表达CamK2的细胞对GPPD处理无反应——用GPPD处理的OA暴露的转染细胞中Camk2b mRNA水平保持较高（图6B）。然而，GPPD处理减少了OA暴露的对照组以及Camk2b过表达细胞的Map4k4 mRNA水平（图6C）。GPPD在对照组和Camk2b过表达细胞中的不同效应在脂质积累测定（BODIPY染色）中也得到了再现，其中GPPD处理未能减少Camk2b过表达细胞中的脂质积累（图6D）。由于CaMK2的激活是由钙流入触发的，我们还确定了GPPD对胞质钙的影响。GPPD处理显著降低了小鼠原代肝细胞中的OA诱导的胞质钙（补充图4）。此外，GPPD处理增加了MD+GPPD组肝脏中的Akt磷酸化并减少了JNK磷酸化（补充图5）。总体而言，这些结果表明，通过抑制MAP4K4活性，GPPD抑制了下游的CaMK2信号通路，从而减少了脂肪变性，同时诱导了促进生存的Akt并抑制了促凋亡的JNK。

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图6. 肝细胞中CamK2的过表达消除了GPPD的保护作用。小鼠原代肝细胞分别用载体（对照组）、OA（500 μM）和OA+ GPPD（100 μM）处理24小时（OA+GPPD）。对于Camk2过表达，细胞在OA和OA+GPPD处理前24小时用Camk2b/pCMV-SPORT6转染。A) 使用肌动蛋白作为加载对照的CaMK2 Western印迹。B) Camk2b mRNA表达标准化为18S rRNA。C) Map4k4 mRNA水平标准化为18S rRNA。D) 用BODIPY 493/503（绿色）和DAPI（蓝色）染色的小鼠原代肝细胞的代表性图像（比例尺=170 μm）。数据表示为平均值±标准差（n=3，* p <0.05，** p<0.01，*** p<0.001，**** p<0.0001）。

**讨论**
这里的结果表明，在MASH的实验模型中，MAP4K4的表达上调，而使用新型抑制剂GPPD抑制其激酶活性可减轻体重增加、脂肪堆积、肝脏脂肪变性、炎症和纤维化。最初通过遗传沉默OA处理的AML12细胞中的MAP4K4，发现其抑制了参与脂质摄取和合成的基因（补充图1）。这些发现与先前的报道一致，即MAP4K4敲低可保护人类肝细胞免受脂毒性，通过减少脂生成转录因子Srebp1和Pparg的表达[10]。此外，药理学抑制MAP4K4已被证明可以减少分离的人类肝细胞中的脂质积聚和氧化应激[8]，[10]，[23]。尽管有这些体外和遗传学报告，但慢性药理学抑制MAP4K4对临床前模型中肝脏病理生理学的影响尚未被探索。本研究评估了一种新合成的MAP4K4抑制剂GPPD在30周饮食诱导的小鼠MASH模型中的预防效果。作为一种葡萄糖化的吡咯并嘧啶酮，GPPD采用了一种独特的分子设计，优化了规模化生产和产率[11]。葡萄糖部分提供了多个水合位点和氢键结合机会，提高了水溶性并增强了与靶标的相互作用。此外，结合的葡萄糖可能通过利用葡萄糖转运蛋白进行系统吸收而具有生物利用度的优势，这是其他葡萄糖化治疗药物如glufosfamide和empagliflozin成功利用的机制[24]，[25]。虽然其他MAP4K4抑制剂如PF-6260933和GNE-495正在开发中，但它们在MASLD模型中的体内有效性尚未确定。值得注意的是，与这些先前的候选物不同，GPPD未表现出对血小板聚集的影响，这可能是由于其特定的吡啶并嘧啶结构或增强的靶点选择性[26]。长期高脂肪喂养会增加体重并减少能量消耗，这通常归因于线粒体功能的下降。在本研究中，MD喂养的小鼠表现出COX IV（细胞色素c氧化酶亚基4）的下调，表明线粒体产生能量的能力下降，而Cpt1a（脂肪酸氧化的标志物）没有显著变化（图3，图4）。GPPD处理显著减轻了体重增加和脂肪质量积累（图3）。虽然体重通常由热量摄入和能量消耗的平衡调节，但MD组和MD+GPPD组之间的食物消耗没有显著差异，表明GPPD不抑制食欲。相反，GPPD处理独立于体力活动的变化增加了全身能量消耗。在这方面，GPPD上调了腹股沟白色脂肪组织（iWAT）中的COX IV表达，表明促进了线粒体生物发生（图3）。有趣的是，升高的细胞质Ca2+被GPPD抑制（补充图4），而已知Ca2+可以抑制COX IV[27]。COX IV是适应性产热的关键成分[28]。这些发现表明，GPPD通过调节细胞内钙平衡增强了线粒体呼吸。除了COX IV，解偶联蛋白1（Ucp1）是另一个产热因子，但需要进一步的研究来明确Ucp1依赖性和非依赖性的机制。

本研究最重要的发现之一是GPPD处理后脂肪变性、纤维化、炎症和肝脏损伤的减轻（图4），同时伴随肝脏甘油三酯和胆固醇含量的显著减少。然而，MAP4K4在代谢紊乱中的作用显然比之前理解的更为复杂[29]。虽然先前的研究表明全身性Map4k4缺失可以改善胰岛素信号传导和葡萄糖耐受性，但肝脏和脂肪特异性敲低模型并未显示出显著的代谢改善。相反，骨骼肌特异性Map4k4缺失已被证明可以防止肥胖引起的胰岛素抵抗[30]。组织特异性遗传模型和药理学干预之间的差异可能可以用MAP4K4同源物（特别是MINK1（MAP4K6）和TNIK（MAP4K7）的功能冗余来解释，它们可以共同导致多个器官的代谢功能障碍[31]。未来的研究需要阐明GPPD对MINK1和TNIK表达和活性的影响，以及这一家族在GPPD介导的肝脏保护中的作用。虽然GPPD以相同的效力抑制所有三种同源物（数据未显示），但我们优先考虑MAP4K4作为主要终点，因为它作为代谢调节因子的已知作用以及在MASLD文献中的普遍性。然而，高序列同源性表明GPPD的肝脏保护作用可能涉及MAP4K4及其同源物的共同抑制。使用同源物特异性模型进行研究是必要的，以明确每种激酶对MASH解决的单独贡献。

从机制上看，我们的数据表明，GPPD介导的MAP4K4抑制导致CaMK2表达和磷酸化减少，从而减轻了肝脏功能障碍（图4，图5，图6）。尽管CaMK2在肝脏病理学中的作用尚不完全清楚[32]，但我们的发现与Feng等人的工作一致，他们发现CaMK2在salidroside介导的保护中起作用，防止脂质积累[33]。具体来说，CaMK2磷酸化的减少与促炎细胞因子（IL1β和IL6）的下调以及氧化应激的减少相关[33]，[34]。此外，升高的CaMK2表达已被证明会促进肝星形细胞（HSC）的增殖并促进纤维化，而其药理学或遗传抑制则可以减少纤维化和炎症[35]。GPPD介导的MAP4K4-CaMK2调节多个下游节点以调节脂质合成[36]（补充表2）。我们观察到GPPD处理增加了Akt磷酸化（补充图5），这与CaMK2在PERK-ATF4-TRB3轴中的作用一致，其中激活的CaMK2信号通路抑制Akt磷酸化[37]，[38]。这些发现支持了MAP4K4缺陷的人类肝细胞表现出Akt激活增强的报告[10]。因此，MAP4K4-CaMK2-Akt轴可能参与了GPPD的抗脂肪变性作用，这似乎独立于在我们的研究中保持不变的典型AMPK信号通路。Akt信号通路的上调还通过抑制NF核因子κB（NF-kB）和转化生长因子β（TGFβ）信号通路来抑制HSC激活[39]，[40]，[41]。这导致促纤维化基因（如α-SMA）的下调和胶原合成的抑制[42]。最后，由于已知CaMK2的激活会激活JNK信号通路以促进炎症[43]，GPPD介导的CamMK2抑制与JNK磷酸化的减少相关（补充图5）。

确定MAP4K4-CaMK2轴是MASH的驱动因素及其通过GPPD解决提供了未来临床开发的基础。然而，由于这是对该抑制剂的首次体内特征描述，仍需阐明几个因素以促进其治疗进展。尽管当前的剂量方案是从MTD数据安全推导出的，并显示出强大的疗效，但全面的ADME和药代动力学（PK）分析对于优化给药和定义临床剂量参数至关重要。此外，尽管Mishapen家族内的高序列同源性表明GPPD的效果可能涉及MAP4K4、MINK1和TNIK的联合抑制，但使用同源物特异性模型将进一步明确每种激酶对MASH解决的单独贡献。虽然GPPD在全身的抑制效果中具有同等效力（数据未显示），但我们优先考虑MAP4K4作为主要终点，因为它作为代谢调节因子的已知作用以及在MASLD文献中的普遍性。然而，高序列同源性表明GPPD的肝脏保护作用可能涉及MAP4K4及其同源物的共同抑制。使用同源物特异性模型进行研究是必要的，以明确每种激酶对MASH解决的个别贡献。从机制上看，我们的数据表明，GPPD介导的MAP4K4抑制导致CaMK2表达和磷酸化减少，从而减轻了肝脏功能障碍（图4，图5，图6）。尽管CaMK2在肝脏病理学中的作用尚未明确[32]，但我们的发现与Feng等人的工作一致，他们发现CaMK2在salidroside介导的保护中起作用[33]。具体来说，CaMK2磷酸化的减少与促炎细胞因子（IL1β和IL6）的下调和氧化应力的减少相关[33]，[34]。此外，升高的CaMK2表达已被证明会驱动肝星形细胞（HSC）的增殖并促进纤维化，而其药理学或遗传抑制则可以减少纤维化和炎症[35]。虽然使用了永生化的主要肝细胞系进行MAP4K4的沉默和GPPD的体外疗效研究，但未来采用先进的3D培养模型来模拟MASLD（代谢性脂肪性肝炎）病理学将提高研究的转化相关性。最后，尽管本研究主要集中在预防模型上，但在已经建立MASH（代谢性脂肪性肝炎）的饮食诱导的体内模型中评估GPPD的治疗效果仍是我们当前研究的重点任务。总之，我们的数据表明，GPPD介导的MAP4K4抑制显著改善了慢性MASH模型中的肝脏脂肪变性、炎症和纤维化。MAP4K4-CaMK2轴的调节对于实现这一疗效至关重要，因为它有助于恢复代谢平衡。总体而言，这项研究发现了一种有前景的小分子候选物GPPD，可用于治疗代谢性肝病，并为针对MASH中的非经典激酶通路提供了研究蓝图。

作者贡献：
- 构思：VA, ADJ
- 实验操作：FA, NP, VE, IR, AA, YA, ADJ
- 数据分析：FA, NP, VE, IR, WJ, HA, AA, YA, TGO, VA, ADJ
- 实验结果解释：FA, NP, VE, WJ, HA, YA, TGO, VA, ADJ
- 图表制作：FA, WJ, HA, YA, TGO, VA, ADJ
- 手稿撰写：FA, ADJ
- 手稿编辑和修订：FA, NP, VE, IR, WJ, HA, AA, YA, TGO, VA, ADJ
- 手稿最终版本审批：FA, NP, VE, IR, WJ, HA, AA, YA, TGO, VA, ADJ

数据可用性声明：
单核RNA-seq数据已存入NCBI基因表达组数据库（GEO），访问号为GSE308258。所有支持本研究结果的其他数据均包含在文章及补充材料中。

财务支持：
本工作得到了美国国立卫生研究院的支持：R01 HL169530（资助V. A.）和R01 DK122028（资助A. D. J.）。