源自hiPSC的肝胆类器官中胆汁酸代谢的概述

《JHEP Reports》：Recapitulation of Bile Acid Metabolism in Hepatobiliary Organoids Derived from hiPSC

　　徐俊明|桑小普|柯杰|李景毅|徐嘉森|陈晓妮|林珊|蔡瑞杰|史先杰|吴芬芳
南方医科大学第八附属医院肝胆胰外科，中国深圳518033

**摘要**
**背景与目的**
胆汁酸是胆固醇稳态、脂质消化和解毒的关键介质，可靠的体外合成系统对于肝脏疾病研究和精准医学至关重要。尽管由诱导多能干细胞（hiPSC）衍生的肝类器官可以模拟关键的人体肝脏功能，但完全再现胆汁酸的生物合成过程仍具有挑战性。在这里，我们生成了能够捕捉胆汁酸代谢主要方面的胆汁酸-肝胆类器官（BA-HBOs），从而为代谢研究和药物筛选提供了一个更具生理和病理相关性的平台。

**方法**
我们通过优化含有皂角苷A的成熟培养方案来增强BA-HBOs中的胆汁酸生物合成。通过TGF-β处理进一步建立了纤维化BA-HBOs（FiBA-HBOs）。利用免疫荧光、流式细胞术和qPCR评估细胞身份和功能标记。通过单细胞RNA测序表征类器官的异质性，并利用LC-MS/MS代谢组学技术量化胆汁酸的组成和多样性。

**结果**
BA-HBOs表现出肝脏和胆道功能，包括有序的细胞系分化和强大的合成及代谢能力。与对照组相比，BA-HBOs显示出增强的胆汁酸合成、改善的胆管结构以及更高的转运蛋白表达（n ≥ 3，p < 0.05）。靶向代谢组学鉴定出33种胆汁酸成分，其中以甘氨酸结合形式为主，这与人体生理情况一致。单细胞RNA测序显示BA-HBOs再现了成人肝脏组织的转录图谱，并揭示了与胆汁酸代谢增强相关的肝细胞亚群重组。此外，模拟纤维化相关紊乱的FiBA-HBOs表现出类似胆汁淤积的变化和疾病相关的代谢组学特征（n ≥ 3，p < 0.05）。

**结论**
BA-HBOs在体外再现了人体肝脏胆汁酸代谢、肝细胞分层和核心代谢过程，为肝脏疾病的机制研究和治疗候选药物的筛选提供了生理相关的平台。

**影响与意义**
我们开发的hiPSC来源的BA-HBOs能够合成和分泌多种胆汁酸成分，捕捉到了人体肝脏的关键转录和代谢特征。它们能够模拟伴有胆汁酸代谢紊乱的肝纤维化过程，为疾病机制的分析提供了工具。这些稳健的类器官为基础肝脏研究、治疗药物开发及精准医学开辟了新的途径。

**引言**
胆汁酸是肝脏代谢的关键产物，在人体内对胆固醇稳态、脂质消化和代谢信号通路具有关键作用 [1]，[2]。胆汁酸代谢的紊乱是多种肝脏疾病的根本原因，包括胆汁淤积、非酒精性脂肪肝病和肝纤维化 [3]，[4]，[5]。然而，由于动物模型的局限以及原代人肝细胞和胆管细胞的可用性受限 [6]，[7]，[8]，我们对人类胆汁酸稳态的理解一直受到很大限制。因此，迫切需要能够准确再现人体肝脏组织复杂性和细胞异质性的生理和病理相关体外模型。最近，人类诱导多能干细胞（hiPSC）技术的进步使肝类器官的生成成为可能，为体外疾病建模、机制研究和药物开发提供了有前景的平台 [9]，[10]。尽管已经采用多种方法构建了hiPSC来源的肝类器官 [11]，[12]，[13]，[14]，但要建立能够准确再现肝脏复杂代谢功能（尤其是胆汁酸代谢）的模型仍然是一个重大挑战。 recent研究利用含有荧光胆汁酸类似物的肝类器官来模拟胆汁流动并分析其体外流动特性 [15]，[16]，[17]，[18]，[19]。然而，这些肝类器官中的胆汁酸代谢内容和类型与体内情况仍有很大差异。因此，迫切需要开发能够再现体内胆汁酸代谢并进行胆汁酸分析的功能性肝类器官。在我们之前的工作中，我们共同分化了类似肝细胞、类似胆管细胞的多种非实质细胞，以生成功能性hiPSC来源的肝胆类器官（HBOs）[20]，[21]。值得注意的是，我们在成熟的HBOs上检测到了三种胆汁酸（BA）。然而，这些模型在体外复制复杂的胆汁酸谱型方面仍有局限性，且我们HBOs中胆汁酸形成的具体机制尚未完全阐明。

在这项研究中，我们在hiPSC来源的肝胆类器官成熟阶段引入了皂角苷A（SSA）作为微环境干预因子，以促进胆汁酸代谢。这种方法生成了一个包含33种不同类型胆汁酸的类器官模型，我们将其命名为胆汁酸-HBOs（BA-HBOs）。通过整合分子表征、功能检测和单细胞分析，我们阐明了BA-HBOs在肝胆细胞系分化、代谢基因表达和肝细胞分层方面的特点。此外，基于BA-HBOs，我们构建了一个肝纤维化模型，通过该模型识别并分析了肝纤维化导致的胆汁酸代谢紊乱。我们的发现支持将这一系统作为能够捕捉人体胆汁酸代谢关键方面的生理和病理相关体外模型。

**方法**
**细胞培养**
本研究使用的人类iPSC系为UC，来源于中国科学院广州生物医药与健康研究所。细胞在涂有Matrigel（Corning，354277）的培养皿中，置于37°C、5% CO2的湿润环境中，使用mTeSRplus培养基（STEMCELL Technologies，100-0276）维持培养。培养基每天更新，每3-4天使用EDTA（Shownin，RP01007）进行传代，传代比例为1:6至1:8。

**BA-HBOs的分化**
为了从单个iPSC生成复杂的BA-HBOs，我们遵循了吴团队提出的方案（补充表1）[20]，[22]。在DE阶段保留了一部分中胚层细胞，并在后期分化方案中加入了mTeSRplus。分化前，使用Accutase（Sigma-Aldrich，A6964）在37°C下将iPSC解离成单细胞。细胞重新悬浮在添加了50 μM Y-27632（Sigma-Aldrich，Y0503）的mTeSRplus培养基中，然后接种到减少生长因子的Matrigel（Corning，356231）上。24小时后，将培养基更换为不含Y-27632的新鲜mTeSRplus。当细胞密度达到100%-110%时，将培养基更换为添加了1% B27 minus insulin（GIBCO，A1895601）、100 ng/ml Activin A（NovoProtein，C687）和20 ng/ml BMP4（Peprotech，BMP-4）的RPMI1640（GIBCO，11879020）培养基，持续三小时（具体取决于iPSC系）。之后，培养基再次更换为添加了10% mTeSRplus、1% B27 minus insulin、100 ng/ml Activin A和20 ng/ml BMP4的RPMI1640，持续两天。第3至4天：培养基改为添加了10% mTeSRplus、1% B27 minus insulin和100 ng/ml Activin A的RPMI1640，再持续两天。第5至9天：培养基改为添加了10% mTeSRplus、1% B27（GIBCO，17504-044）、20 ng/ml BMP2（Peprotech，BMP-2）和30 ng/ml FGF4（Peprotech，FGF-4）的RPMI1640，持续五天。第10至15天：培养基改为添加了10% mTeSRplus、1% B27、20 ng/ml HGF（NovoProtein，CP63-50）和20 ng/ml KGF（NovoProtein，CH73-50）的RPMI1640，进行为期六天的培养。第16至25天：细胞在含有10%胆固醇+ MIX（中国专利号：ZL201810211144）、10 ng/ml Oncostatin M（OSM）（NovoProtein，C099）和1% Glutamine（GIBCO，A2916801）的HepatoZYME-SFM（GIBCO，17705021）培养基中培养十天。此时，肝细胞和胆管细胞系均已成熟。随后，BA-HBOs在含有10%胆固醇+ MIX、10 ng/ml OSM、0.5 μM dexamethasone（Dex）（MCE，HY-14648）和1% glutamine的SFM中培养十天，期间可添加或不添加SSA。培养基每24小时更换一次，直到第16天后改为每48小时更换一次。补充表2全面概述了细胞培养和分化过程中使用的试剂。

**定量基因表达分析**
使用Trizol? Reagent（Invitrogen，15596-026）从样本中提取总RNA。使用PrimeScript RT Reagent Kit和gDNA Eraser（Takara，RR037A）从500 ng总RNA中合成cDNA。采用TB Green Premix Ex Taq II（Takara，RR820A）在LightCycler 480 II（Roche）上进行定量PCR。数据通过与标准曲线比较并进行归一化处理，归一化系数为甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）。所用引物列表见补充表3。

**流式细胞术和数据分析**
在分化过程中的第0、4、9、15和25天进行流式细胞术分析。在第15天之前使用Accutase在37°C下将细胞酶解为单细胞，第25天使用TrypLE在37°C下进行分离。单细胞用无菌DPBS洗涤并采用350g离心3分钟收集。彻底重悬细胞后加入250 μL Fixation/Permeabilization溶液（BD，554714）在4°C下处理20分钟（在染色细胞表面抗原时可跳过此步骤）。然后用Perm/Wash?缓冲液（BD，554714）洗涤细胞两次（每次1 mL，用于管内染色）。彻底重悬细胞在含有预设浓度的荧光素标记抗体或适当阴性对照的100 μL BD Perm/Wash?缓冲液中。在4°C下避光孵育30分钟。再用Perm/Wash?缓冲液洗涤细胞两次（每次1 mL，用于管内染色），然后重新悬浮在DPBS中进行流式细胞术分析。流式细胞术数据使用BD FACS LSR Fortessa细胞仪处理，流式Jo软件（v.10.8.1）用于数据解析。

**免疫荧光**
在分化过程中的第0、4、9、15、25和35天进行免疫荧光分析。培养物在室温下用4% paraformaldehyde（PFA）（Solarbio，P1110）固定30分钟，然后用0.3% Triton X-100（Sigma-Aldrich，T9284）在DPBS中渗透1小时。细胞用DPBS洗涤三次，每次浸泡5分钟。在含有5%驴血清（Solarbio，SL050）的封闭溶液中孵育至少1小时后，用3%驴血清在室温下或4°C下孵育1小时作为一抗，随后在1%驴血清中孵育30分钟作为二抗。如有必要进行核染色，再加入DAPI处理3分钟。在初次和二次抗体处理及DAPI处理后，细胞用DPBS洗涤四次，每次5分钟。所有免疫荧光图像均使用共聚焦激光扫描显微镜（LSM800，Carl Zeiss）拍摄。每个组至少检测三个样本，每个样本捕获三个不重叠的视野。使用ImageJ（v.ij154）对阳性区域进行定量，并将其表达为与DPBI染色面积的比值。本研究使用的一抗和二抗列表见补充表4。

**Periodic acid-Schiff（PAS）和Oil Red-O（ORO）染色**
按照制造商说明使用PAS染色试剂盒（Solarbio，G1280）和ORO染色试剂盒（Solarbio，G1262）进行染色。

**吲哚菁绿（ICG）摄取和释放检测**
将类器官在37°C下与1 mg/ml ICG（Sigma-Aldrich，3599-32-4）孵育30分钟。去除培养基并用PBS洗涤后，用明场显微镜观察细胞内ICG的积累情况。为了评估ICG释放模式，类器官在新鲜培养基中维持12小时后进行显微镜评估。

**罗丹明123转运检测**
BA-HBOs在37°C下预处理，有的添加了10 μM verapamil（MCE，HY-14275），处理30分钟。然后与10 μg/ml Rhodamine123（SigmaAldrich，R8004）在37°C下孵育1小时后，用DPBS洗涤三次，每次5分钟，并用荧光显微镜系统（Axio Vert.A1，Carl Zeiss）捕获图像。

**Tunnel检测**
培养物在室温下用4% PFA固定30分钟，然后用0.3% Triton X-100在DPBS中渗透10分钟。样品用DPBS洗涤两次，然后用100 μl TUNEL检测溶液（Beyotime，C1088）在4°C下避光孵育30分钟。最后用DPBS洗涤两次，每次5分钟，并用共聚焦激光扫描显微镜（LSM800，Carl Zeiss）捕获图像。

**BA-HBOs的单细胞RNA测序**
收集BA-HBOs和对照HBOs并两次用DPBS洗涤。使用含有I型胶原酶（Stemcell，07415）和trypsin（GIBCO，15050057）的混合液将类器官酶解成单细胞，比例1:1，然后在37°C下孵育30分钟并震荡。分离后的细胞通过40 μm细胞滤网获得单细胞悬浮液。细胞活力通过台盼蓝染色进行评估，结果显示活力超过90%。细胞悬液立即用于使用Singleron Matrix NEO?自动化单细胞文库制备系统（Singleron Biotechnologies）进行scRNA-seq文库制备，遵循制造商的说明。每个样本中加载了超过5×10^4个活性细胞（活力>90%），经过质量控制过滤后获得了大约10,000个高质量细胞。cDNA合成后，根据Singleron协议制备了单细胞cDNA文库。cDNA扩增和文库构建后进行了质量控制，使用Bioanalyzer分析和Qubit测量。文库被合并并在Illumina NovaSeq 6000系统上进行测序，目标读深度约为每个细胞30,000个读数。

**scRNA-seq数据的预处理**
测序数据使用Cell Ranger Single-Cell软件套件针对GRCh38人类参考基因组（Ensembl版本v.106）进行对齐和定量。为了质量控制和下游分析，应用了以下标准来筛选条形码：(1) 超过1500个UMI，(2) 检测到超过1000个基因，(3) 线粒体编码DNA（mtDNA）少于20%，以及(4) 在三个以上的条形码中检测到基因。使用Scrublet v.0.2.3识别潜在的双重条形码，并将双重条形码得分高于0.2的从数据集中移除。

**scRNA-seq数据的跨数据集整合**
公共转录组谱型从NCBI Gene Expression Omnibus数据库下载。将Gary的研究（GSE154883）、Hans的研究（GSE199239）和人类肝脏图谱（GSE124395）中的肝脏类器官的单细胞转录组与我们的scRNA-seq数据合并，并通过Seurat绘制到共享的UMAP空间中。细胞类型根据已发表的人类数据集中的标记基因进行注释。

**单细胞转录组数据**
单细胞转录组数据从NCBI Gene Expression Omnibus (GEO)数据库中检索，访问代码分别为GSE154883（hiPSC衍生的多谱系肝脏类器官）、GSE199239（人胎儿肝脏类器官）和GSE124395（人类肝脏参考图谱）。这些数据集通过Seurat的标准化分析框架（v4.3.0）与内部生成的scRNA-seq谱型整合，采用基于互适主成分分析（PCA）的整合方法，随后进行联合UMAP降维。细胞类型注释是通过系统查询同行评审文献中确立的人类肝细胞特征基因来完成的。

**基于UCell的代谢基因集富集分析**
在整合的scRNA-seq数据集上使用UCell计算框架（v2.4.0）进行基因集富集分析，该方法基于Mann-Whitney U统计量。经过质量控制的单细胞计数矩阵通过计算流程进行预定义代谢途径（“胆酸代谢”和“脂质和胆固醇稳态调节”）的标记评分（补充表5）。富集分数通过UMAP流形投影算法进行空间解析，从而系统地识别高代谢指数的细胞区域。使用非参数统计方法在整合的数据集之间进行比较分析。

**Cellchat分析**
使用CellChat计算框架（v1.6.1）通过严格的配体-受体相互作用分析系统地解码细胞间通信网络。处理后的BA-HBOs和对照组HBOs的单细胞转录组经过多阶段计算分析：(1) Curated CellChatDB (v2023.02)中的配体-受体对被与标准化基因表达矩阵进行概率匹配；(2) 通过考虑空间邻近性的质量作用原理建模得出通信概率矩阵；(3) 通过排列测试比较SSA处理组与未处理组的差异网络结构。

**功能富集分析**
使用clusterProfiler对差异表达基因（qvalue < 0.05, |log2FC| >1）进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。显著术语通过条形图和棒状图可视化，以突出富集模式。使用语义相似性分析整合冗余的GO术语。KEGG通路映射通过条形图显示富集显著性和基因比率。

**BA-HBOs中的纤维化诱导**
在培养的第35天，BA-HBOs接受转化生长因子β（TGF-β，10 ng/mL；NovoProtein，CA72）治疗，连续五天以诱导纤维化。对照组接受等体积的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。在第40天，收集前48小时的培养基和类器官样本，用于后续的病理和表型分析。

**使用LC/MS-MS的胆酸代谢组学分析**
通过对BA-HBOs和FiBA-HBOs及其培养基进行标准化生物采样协议，系统地进行了胆酸分析。为了减轻自分泌反馈对胆酸稳态的影响，从第25天开始每48小时更新培养基。在第38天更换培养基后，通过无菌抽吸收集48小时的培养基作为细胞外胆酸样本。

**类器官的分离**
类器官使用我们建立的单细胞分离协议在三次PBS洗涤后进行酶法分离。细胞计数数据用于标准化胆酸浓度计算。细胞悬液经过冷离心（100×g，5分钟，4°C）以完全去除上清液，生成细胞内胆酸样本。细胞和细胞外部分立即在液氮中玻璃化，然后在-80°C下冷冻保存，直至进行液相色谱-串联质谱（LC-MS）分析。

**33种胆酸的靶向分析**
使用LC-MS进行多反应监测的靶向分析。色谱分离在反相C18柱上通过梯度洗脱进行，结合双极性模式下的质谱检测和优化碰撞能量。通过化学定义的标准物的系列稀释建立一个涵盖所有胆酸的标准化参考面板，以在生理相关浓度范围内创建校准曲线（补充表6）。样品制备包括蛋白质沉淀，然后是真空辅助的溶剂蒸发。定量方法结合了同位素校正的校准和批次间验证协议，方法验证确认了三个浓度阈值下的测量精度，并显示了85-115%的分析物回收率。连续的系统适用性监测确保了整个实验序列中的分析一致性。

**统计分析**
统计分析使用GraphPad Prism 9.5.1进行。组间差异使用学生t检验（两组比较）或单因素ANOVA（多组比较）进行评估。显著性阈值定义为*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。误差条代表标准偏差。完整的统计参数在相应的图例中说明。

**从hiPSCs生成和功能成熟的多谱系胆酸-HBOs**
为了评估hiPSC衍生的肝脏类器官中的胆酸代谢，我们优化了之前建立的分化协议[20]、[21]、[22]。Saikosaponin A（SSA）是传统用于治疗肝脏疾病的草药Radix Bupleuri中的主要生物活性化合物[23]，它作为强效PPAR激动剂，上调LXR和RXR，从而促进肝脏胆固醇向胆酸的转化[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]。我们在成熟培养基中添加SSA以增强HBOs中的胆酸代谢（图S1A），并确定了一个不会引起细胞毒性的最佳浓度（图S1B-E）。图1A展示了生成胆酸增强HBOs（BA-HBOs）的协议概述。我们在分化前评估了hiPSC的多能性，超过99%的细胞共表达NANOG和OCT4，通过免疫荧光和流式细胞术确认（图S2A）。多种检测一致验证了每个发育阶段的可靠性（图1B，图S2）。在第4天，大约75%的细胞共表达终末内胚层标记物（FOXA2和SOX17），而约20%的细胞对中胚层标记物（TBXT）呈阳性（图S2B，C）。到第9天，肝细胞特异性变得明显，表现为祖细胞中HNF4α和AFP的共定位。到第15天，肝细胞保持双分化能力，同时表达SOX9和AFP。到第35天，类器官成熟导致空间组织的谱系分离，CYP3A4+肝细胞与CK19+胆管细胞相邻，从而建立了结构化的肝脏胆道架构（图1B）。通过Seurat的协调分析框架（v4.3.0），利用互适PCA整合和联合UMAP降维分析了HBOs成熟过程中的发育基因表达（图S2D，E）。免疫荧光进一步确认BA-HBOs合成了丰富的ALB并表达了代谢酶CYP3A4（图1C）。同时，胆管细胞表现出柱状上皮形态，AC-α-微管染色显示极化的管腔纤毛和NOTCH2信号的激活（图1D）。

**BA-HBOs中的诱导纤维化**
在培养的第35天，BA-HBOs接受转化生长因子β（TGF-β，10 ng/mL；NovoProtein，CA72）治疗，连续五天以诱导纤维化。对照组接受等体积的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。第40天，收集前48小时的条件培养基和类器官样本，用于后续的病理和表型分析。

**使用LC/MS-MS的胆酸代谢组学分析**
通过标准化的生物采样协议系统地对BA-HBOs和FiBA-HBOs及其条件培养基进行了胆酸分析。为了减轻自分泌反馈对胆酸稳态的影响，从第25天开始每48小时定期更新培养基。在第38天更换最终培养基后，通过无菌抽吸收集48小时的培养基作为细胞外胆酸样本。

**基于UCell的代谢基因集富集分析**
在整合的scRNA-seq数据集上使用UCell计算框架（v2.4.0）进行基因集富集分析，采用基于Mann-Whitney U统计量的排名方法。经过质量控制的单细胞计数矩阵通过计算流程进行预定义代谢途径（“胆酸代谢”和“脂质和胆固醇稳态调节”）的标记评分（补充表5）。通过UMAP流形投影算法空间解析富集分数，从而系统地识别高代谢指数的细胞区域。使用非参数统计方法在整合的数据集之间进行比较分析。

**Cellchat分析**
使用CellChat计算框架（v1.6.1）通过严格的配体-受体相互作用分析系统地解码细胞间通信网络。处理后的BA-HBOs和对照组HBOs的单细胞转录组经过多阶段计算分析：(1) Curated CellChatDB (v2023.02)中的配体-受体对被与标准化基因表达矩阵进行概率匹配；(2) 通过基于质量作用原理的建模结合空间邻近性权重得出通信概率矩阵；(3) 通过排列测试比较SSA处理组与未处理组解决不同的网络架构。

**功能富集分析**
使用clusterProfiler对差异表达基因（qvalue < 0.05, |log2FC| >1）进行基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。显著术语通过条形图和棒状图可视化，以突出富集模式。使用语义相似性分析整合冗余的GO术语。KEGG通路映射通过条形图显示富集显著性和基因比率。

**BA-HBOs中的纤维化诱导**
在培养的第35天，BA-HBOs接受转化生长因子β（TGF-β，10 ng/mL；NovoProtein，CA72）治疗，连续五天以诱导纤维化。对照组接受等量的磷酸盐缓冲盐水（PBS）。第40天，收集前48小时的培养基和类器官样本，用于后续的病理和表型分析。

**使用LC/MS-MSB的胆酸代谢组学分析**
通过对BA-HBOs和FiBA-HBOs及其条件培养基进行标准化生物采样协议，系统地进行了胆酸分析。为了减轻自分泌反馈对胆酸稳态的影响，从第25天开始每48小时更新培养基。在第38天更换最终培养基后，通过无菌抽吸收集48小时的培养基作为细胞外胆酸样本。

**类器官的分离**
类器官使用我们建立的单细胞分离协议在三次PBS洗涤后进行酶法分离。细胞计数数据用于标准化胆酸浓度计算。细胞悬液经过冷离心（100×g，5分钟，4°C）以生成细胞内胆酸样本。细胞和细胞外部分立即在液氮中玻璃化，然后在-80°C下冷冻保存，直至进行液相色谱-串联质谱（LC-MS）分析。

**针对33种胆酸的靶向分析**
使用LC-MS进行多反应监测的靶向分析。色谱分离在反相C18柱上进行，采用梯度洗脱，并结合双极性模式下的质谱检测和优化的碰撞能量。通过化学定义的标准物的系列稀释建立了一个包含所有胆酸的标准化参考面板，以创建生理相关浓度范围内的校准曲线（补充表6）。样品制备包括蛋白质沉淀和真空辅助的溶剂蒸发。定量方法结合了同位素校正的校准和批次间验证协议，方法验证确认了三个浓度阈值下的测量精度，并显示了85-115%的分析物回收率。连续的系统适用性监测确保了整个实验序列的分析一致性。

**统计分析**
统计分析使用GraphPad Prism 9.5.1进行。组间差异使用学生t检验（两组比较）或单因素ANOVA（多组比较）进行评估。显著性阈值定义为*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001。误差条代表标准偏差。完整的统计参数在相应的图例中说明。

**结论**
我们优化了之前建立的分化协议[20]、[21]、[22]，以评估hiPSC衍生的胆汁道类器官中的胆酸代谢。Saikosaponin A（SSA）是传统用于治疗肝脏疾病的草药Radix Bupleuri中的主要生物活性化合物[23]，它作为强效PPAR激动剂，上调LXR和RXR，从而促进肝脏胆固醇向胆酸的转化[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]。我们在成熟培养基中添加SSA以增强HBOs中的胆酸代谢（图S1A），并确定了不会引起细胞毒性的最佳浓度（图S1B-E）。图1A展示了生成胆酸增强HBOs（BA-HBOs）的协议概览。我们在分化前评估了hiPSC的多能性，≥99%的细胞共表达NANOG和OCT4，通过免疫荧光和流式细胞术确认（图S2A）。多种检测一致验证了每个发育阶段的可靠性（图1B，图S2）。在第4天，大约75%的细胞共表达终末内胚层标记物（FOXA2和SOX17），而约20%的细胞对中胚层标记物（TBXT）呈阳性（图S2B，C）。到第9天，肝细胞特异性变得明显，表现为祖细胞中HNF4α和AFP的共定位。到第15天，肝细胞保留双分化能力，同时表达SOX9和AFP。到第35天，类器官成熟导致空间组织的谱系分离，CYP3A4+肝细胞与CK19+胆管细胞相邻，从而建立了结构化的肝脏胆道架构（图1B）。通过连续qPCR分析了HBOs成熟过程中的发育基因表达（图S2D，E），捕捉从早期特化到最终分化的过程。免疫荧光进一步确认BA-HBOs合成了丰富的ALB并表达了代谢酶CYP3A4（图1C）。同时，胆管细胞表现出柱状上皮形态，AC-α-微管染色显示极化的管腔纤毛和NOTCH2信号的激活（图1D）。功能检测确认BA-HBOs具有成熟的肝细胞和胆道活性，包括糖原合成、脂质代谢、吲哚氰绿（ICG）清除能力和钙依赖性转运蛋白功能（图1E-H）。值得注意的是，在成熟阶段的BA-HBOs中，肝细胞形成了围绕胆管样结构的层（图S2F），再现了肝脏索状组织并扩展了代谢功能表面积。

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**图1. 从hiPSCs生成和功能评估可复制的BA-HBOs。** (A) 说明复杂BA-HBOs分化过程的示意图。HPs，肝干细胞；HBs，肝细胞。**(B) 不同发育阶段（第4天、9天、15天和25天）BA-HBOs中特异性蛋白质标记物的荧光显微照片。免疫荧光染色：SOX17/FOXA2（内胚层细胞），HNF4α/AFP（肝干细胞），SOX9/AFP（肝细胞），CK19/CYP3A4（成熟胆管细胞/肝细胞）。**(C) 免疫荧光显示成熟BA-HBOs中 actively 分泌ALB和CYP3A4的HNF4α阳性肝细胞。**(D) 免疫荧光分析显示成熟BA-HBOs中的胆管细胞表现出丰富的乙酰化α-微管标记的主要纤毛和对于胆管腔形态生成至关重要的Notch2表达。**(E) PAS（ periodic acid-Schiff）染色显示BA-HBOs来源的肝细胞中的糖原储存能力。**(F) ORO（Oil Red-O）染色显示分化肝细胞中的脂滴积累。**(G) 功能检测确认BA-HBOs培养的肝细胞中ICG（吲哚氰绿）的摄取和随后的胆汁排放。**(H) 免疫荧光图像显示在有无维拉帕米抑制的情况下Rhodamine 123进入类器官腔内的情况。** 所有刻度条=50 μm。

**BA-HBOs重现胆酸合成和分泌**
为了确定BA-HBOs中肝脏胆酸合成和胆管细胞转运功能的增强，我们使用2019年的HBO协议作为对照[2这些胆汁酸同时存在于BA-HBOs和上清液中，被分为牛磺酸结合型（TCBA）、甘氨酸结合型（GCBA）和非结合型（UCBA）三种形式，其中GCBA占主导地位（图2E），这与人体生理学是一致的[30]。这些发现共同强调了BA-HBOs在体外具有先进的肝细胞和胆管上皮功能，并突显了其作为人类胆汁酸代谢模型的价值。

BA-HBOs与人类肝脏的转录景观和核心代谢程序相似。为了定义BA-HBOs的转录和代谢特征，我们在第35天对BA-HBOs和对照HBOs进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）[20]，并将这些数据与来自不同样本的已发表数据集进行了整合，包括iPSC衍生的多谱系肝类器官（Gary的研究）[31]、胎儿肝类器官（Hans的研究）[32]以及成人肝组织[33]。经过质量控制后，保留了36,103个细胞用于后续分析（图3A）。无监督聚类识别出八个转录上不同的细胞群体，对应于主要的肝细胞谱系，细胞类型的注释得到了典型标记基因表达的支持（图3B）。BA-HBOs和HBOs都捕获了成人肝脏中观察到的几个主要肝细胞谱系的转录特征，包括肝细胞、胆管细胞和肝星形细胞等，尽管内皮细胞——成人肝脏中最丰富的细胞群体之一——在BA-HBOs中的代表性较低。总体而言，HBO系统比之前的类器官模型更紧密地再现了成人肝脏的细胞多样性和谱系组成（图3C），尽管与体内组织的细胞类型比例仍存在差异。

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图3. 肝类器官和成人肝脏数据的单细胞转录组分析。(A) 来自我们、Gary和Hans的肝类器官以及人类肝脏的单细胞UMAP图。BA，胆汁酸；CON，对照；HCs，肝细胞；ECs，内皮细胞；CHs，胆管细胞；MeCs，间充质细胞；TLs，T淋巴细胞；HPCs，肝祖细胞；HSCs，肝星形细胞；KCs，库普弗细胞。(B) 用于注释八个主要群体的标记基因表达。(C) 条形图显示了五个生物样本中细胞群体占总细胞的比例。(D) 盒形图分析了五个生物样本中肝细胞中胆汁酸代谢、脂质和胆固醇代谢的Ucell衍生活性得分。统计显著性通过ANOVA测试确定（***p < 0.001）。

比较主要细胞类型的分析显示，在肝细胞中，我们的类器官显示出最高的代谢途径富集度，包括药物代谢–细胞色素P450、初级胆汁酸生物合成、视黄醇代谢和牛磺酸/低牛磺酸代谢，最接近成人肝脏（图S5A）。在胆管细胞中，我们的模型上调了与Hippo信号通路、缝隙连接和矿物质吸收相关的基因，表明上皮屏障和转运功能得以保留（图S5A）。肝祖细胞保持了活跃的Wnt和Hedgehog信号通路以及细胞周期程序，符合再生性和干细胞样的状态（图S5A）。我们的类器官显示出比对照和胎儿肝类器官更高的代表性代谢标志物（APOA1、TTR、GLUL）表达。关键合成和基质相关基因（FGA、SERPINA1、RBP4、FN1）的表达更接近成人肝脏水平（图S5B），与相对成熟的肝实质状态一致。

为了进一步解析不同模型中的胆汁酸和脂质/胆固醇代谢，我们使用经过整理的泛代谢基因集（补充表5）对五个单细胞数据集进行了UCell评分。肝细胞的定量分析显示，实验组之间存在不同的代谢成熟状态（图3D和S6）。值得注意的是，BA-HBOs在胆汁酸生物合成和脂质/胆固醇代谢方面的富集度显著高于胎儿肝类器官和对照HBOs（p < 0.001），并且与成人肝脏更为相似（图3D）。

鉴于肝细胞在胆汁酸和胆固醇代谢中的空间和功能分区[34]、[35]，我们对单细胞转录组数据进行了迭代亚聚类，以识别代谢特化的肝细胞亚群并量化其比例的变化。无监督聚类识别出五个转录上不同的肝细胞亚群，分别标记为Hep1至Hep5（Hep1-Hep5；图4A），每个亚群由一组特征基因定义（图4B）。BA-HBOs中Hep1、Hep3和Hep5的比例增加，而Hep2和Hep4的比例减少（图4A，C）。

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图4. 肝细胞亚聚类显示具有不同代谢特征的转录异质性。(A) 通过UMAP分析对类器官中的单细胞进行亚聚类，识别出五个不同的亚群（Hep1-5），并描绘了BA-HBO与对照组之间的群体特定结构。Hep，肝细胞。(B) 差异基因点图显示了五个肝细胞亚群中排名靠前的群体特定标记物。(C) 环形图可视化显示了BA-HBO和CON-HBO之间肝细胞亚群的比例分配。(D-H) 棒状图系列系统地映射了Hep1-5亚群特定的GO富集谱，单个子面板揭示了不同的通路特征。在哺乳动物肝小叶中，肝细胞根据它们在门脉中心轴上的位置显示出功能分区[35]、[36]。为了将这些群体与肝脏分区联系起来，我们将它们的转录谱与已建立的门静脉周围、区域间和中央静脉标记物进行了比较[37]。Hep1和Hep2主要位于区域间（图S7A，D），这与它们在稳态和损伤期间的肝脏再生中的作用一致。Hep3显示出混合特征，同时表达中央静脉和区域间标记物（图S7A，C，D），表明处于功能极化的过渡状态。Hep4没有明显的分区归属，而Hep5主要位于门静脉周围（图S7A，B），与增强的代谢活动一致。为了表征功能特化，我们对高度表达的、群体特定的基因进行了GO和KEGG分析。Hep1和Hep2显示出不同的功能谱（图4D，E和S8）。Hep1富集了蛋白质合成途径，特别是细胞质翻译和核糖核蛋白组装，与增殖或生长支持状态一致。相比之下，Hep2富集了应激适应途径，包括内质网应激反应和巨自噬。Hep3和Hep5在BA-HBOs中增强，显示出参与胆汁酸、胆固醇和脂肪酸代谢的基因上调（图4F，H和S8）。相反，Hep4显示出这些代谢途径的显著下调（图4G和S8）。

这些数据表明，在BA-HBOs中，肝细胞亚群发生了重组，代谢活跃的、具有区域差异的群体得到了扩展，从而促进了类器官的代谢功能。

多谱系BA-HBOs作为肝纤维化相关胆汁酸失调的模型非常理想，因为它们需要肝细胞和肝星形细胞（HSCs）[7]。我们确认了这些细胞类型在BA-HBOs中的存在（图3B），使我们能够建立纤维化模型来研究胆汁酸失调。转化生长因子-β（TGF-β），作为纤维化的核心驱动因素，会在肝脏中诱导胶原蛋白沉积和炎症反应[38]。我们用TGF-β处理BA-HBOs以生成纤维化BA-HBOs（FiBA-HBOs；图5A）。明场成像显示肝细胞结构破坏、胆管紊乱、细胞碎片和细胞外基质沉积（图S9A）。正如预期的那样，FiBA-HBOs显示出胶原蛋白生成和HSC激活标记物的表达增加（图5B-D，S9B，C）。它们还上调了炎症相关因子（TNF-α、IL-2、IL-6和IL-8），并显示出ALT/AST和γ-谷氨酰转移酶（GGT）的水平升高，表明肝脏和胆道功能受损（图5B，E）。

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图5. 使用BA-HBOs构建纤维化模型。(A) 使用TGF-β诱导FiBA-HBOs并进行病理表型分析的过程示意图。(B) 定量PCR分析显示FiBA-HBOs中肝星形细胞（HSC）激活相关基因（α-SMA、MMP2、COL3A1、COL1A1）和炎症细胞因子相关基因（TNF-α、IL-2、IL-6、IL-8）的表达增加。(C) 免疫荧光和(D) 荧光强度量化显示FiBA-HBOs中激活的α-SMA阳性HSC数量增加以及COL3A1沉积量高于BA-HBOs。(E) ELISA检测显示FiBA-HBOs中的GGT、AST和ALT水平升高。(F) FiBA-HBOs培养物中的总胆汁酸含量显著增加，而在48小时培养物的上清液中未观察到显著差异。统计显著性通过未配对t检验确定（ns（不显著），*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001），N = 3个生物重复实验。这些结果表明，FiBA-HBOs可以用来模拟肝脏纤维化的关键特征。接下来，我们探讨了胆汁酸代谢的变化。使用LC/MS-MS，我们量化了BA-HBOs和FiBA-HBOs的细胞和培养上清液中的胆汁酸。尽管上清液中的胆汁酸水平没有显著增加，但FiBA-HBOs中的细胞内胆汁酸显著升高，表明有类似胆汁淤积的积累（图5F）。主成分分析（PCA）显示BA-HBOs和FiBA-HBOs之间有明显的分离（图6A），聚类分析揭示了个别胆汁酸种类的不同模式（图6B）。在FiBA-HBOs中增加的胆汁酸在细胞内部分和上清液部分之间有大量重叠（图6C，D）。最显著升高的胆汁酸是非结合型（UCBA；图6E），这些胆汁酸通常比其甘氨酸或牛磺酸结合形式更具疏水性和细胞毒性。在升高的UCBAs中，疏水性物种包括脱氧胆酸（DCA）、石胆酸（LCA）、胆脱氧胆酸（CDCA）、7-酮脱氧胆酸（7-KDCA）和6,7-二酮石胆酸（6,7-DKLCA）（图6F）。值得注意的是，这种UCBA积累模式与之前关于肝脏纤维化中胆汁酸谱变化的报告一致[39]、[40]、[41]。

这些发现表明，FiBA-HBOs在体内再现了肝脏纤维化的关键病理特征，包括胆汁酸代谢的紊乱。它们可能为评估药物引起的肝毒性及探索抗纤维化疗法提供一个有用的平台。从hiPSCs衍生的肝类器官在发育研究、疾病建模和药物发现方面取得了重大进展[9]、[10]、[42]、[43]、[44]。然而，一个关键挑战仍然是体外准确再现肝脏的代谢能力，特别是内源性胆汁酸的合成和胆管分泌，这需要肝细胞和胆管细胞之间的协调作用。最近的几项基于hiPSC的研究开始解决这一挑战的特定方面：促进形成扩展的功能性胆小管的系统，并使用荧光底物来可视化胆汁流动[15]、[16]；通过模拟肝脏上皮-血管相互作用来生成功能性人类胆管的3D共培养方法[19]；以及由胆汁酸–FXR信号驱动的具有持续肝细胞样功能的长期iPSC衍生类器官[45]。然而，这些构建主要作为胆汁酸运输模拟器，而不是生物合成单元，因此无法恢复生理胆汁酸谱[15]、[16]、[17]、[18]、[19]。在这里，我们描述了从hiPSCs衍生的多谱系HBOs（BA-HBOs），它们接近人类肝脏的细胞组成，并表现出成熟的代谢功能的关键特征。值得注意的是，该模型支持33种胆汁酸的体外生物合成，大大扩展了iPSC衍生肝类器官所报告的胆汁酸复杂性。

在BA-HBOs中，SSA——一种强效的PPAR激动剂，也与LXR活性的增加有关[28]、[29]、[46]、[47]——通过差异性地参与核受体途径来调节胆汁酸代谢。在培养后期对PPARα和LXR信号进行的药理学干扰表明，PPARα信号主要负责SSA诱导的CYP7A1和CYP27A1的上调以及总胆汁酸水平的增加，而LXR信号更与胆汁酸转运蛋白ASBT和MDR3的诱导相关（图S4）。这种酶激活模式与其他研究的结果一致[25]、[27]。值得注意的是，尽管早期研究表明PPARα通过抑制CYP7A1来抑制胆汁酸合成，但其效应似乎取决于具体背景；因此这里观察到的促进效应可能反映了我们类器官系统的代谢背景。我们的结果证实了BA-HBOs中胆汁酸的浓度和多样性显著增加，包括33种不同的胆汁酸种类（图2D）。BA-HBOs中的总胆汁酸水平（56.5–61.8 μg每10^6个细胞，图5F）高于此前报道的初级人类肝细胞在三明治培养中的水平（约40 μg每10^6个细胞）[48]。为了系统地评估BA-HBOs、HBOs以及人类肝组织和已建立的多细胞肝类器官之间的细胞组成和代谢差异，我们将scRNA-seq数据与已建立的数据集和图谱结合起来，用于联合细胞类型注释和群体分析（图3）。我们确认了非实质细胞谱系（包括来源于中胚层的间充质细胞、肝星形细胞、内皮细胞和库普弗细胞）与来源于内胚层的肝细胞前体、肝细胞和胆管细胞的共分化。尽管已经建立了多细胞肝类器官，但细胞多样性和群体比例仍然存在持续的缺陷[12]，[31]。BA-HBOs接近于主要的肝细胞群体，并具有成人肝脏结构的一些特征，从而减少了当前类器官平台中观察到的谱系偏倚，并提供了一个改进的体外模型。此外，BA-HBOs的代谢能力高于其他肝类器官和胎儿肝类器官，其代谢谱型更接近成人肝脏组织（图3D、S5和S6）。然而，不同研究之间的样本处理、测序深度和分析流程的差异仍可能导致路径分数和标记物表达的一些观察到的变化，因此我们将这些比较视为指示性趋势，而不是严格的定量基准。

BA-HBOs表现出高周期肝细胞（HPCs）的比例降低，同时成熟肝细胞的数量增加（图3C）。亚群分析识别出BA-HBOs中比例发生变化的五种不同肝细胞亚群（图4A,C）。Hep1和Hep2在转录上与人类区间肝细胞相似，但似乎处于不同的功能状态。BA-HBOs中Hep1的比例较高，富含蛋白质合成和再生相关通路，而Hep2的比例较低，富含内质网应激反应和自噬清除相关通路（图4D, E）。这些差异可能反映了类器官中的培养引起的应激和免疫激活[49]，[50]，[51]，而SSA通过抗氧化介导的肝保护作用可能减轻这种应激并帮助维持BA-HBO的完整性[26]，[52]。特别值得注意的是Hep3和Hep5，它们的转录特征分别与门脉周围区带和中心区带的标记物对齐（图S7）。BA-HBOs中这两个亚群都显著扩增，它们富含核心肝脏代谢通路，包括胆固醇稳态、脂质重塑和乙醇解毒。Hep5表现出更强的门脉周围区带特征，并且胆汁酸处理机制更为突出。

许多研究表明，肝纤维化通常与胆汁酸代谢紊乱相关，异常的胆汁酸作为关键的调节因子和纤维化进展的潜在促进因素[41]，[53]，[54]。然而，用体外模型模拟具有胆汁酸代谢紊乱的肝纤维化特别具有挑战性，因为这需要一个复杂的多细胞系统——结合肝细胞、胆管细胞和星形细胞——来密切再现相关的胆汁酸代谢通路。我们的FiBA-HBO模型通过整合这些关键细胞谱系来满足这一需求，从而忠实模拟病理过程（图5、6）。在该系统的纤维化进程中，我们观察到未结合胆汁酸的水平显著升高，特别是DCA、LCA、CDCA和UDCA，这与MASLD/MASH和病毒性肝炎相关纤维化的临床发现一致[55]，[56]，[57]，[58]。值得注意的是，检测到了7-KDCA和6,7-KLDCA水平的升高，其中羟基被酮基取代。这种替换增加了疏水性和毒性，表明其可能促进纤维化进展[59]，[60]。

总之，我们的高密度干细胞（hiPSC）衍生的BA-HBOs能够合成和分泌多种胆汁酸，并再现了一些人类肝脏组织的关键转录和代谢特征。此外，BA-HBOs可用于建立一个体外肝纤维化模型，以捕捉与胆汁酸相关的紊乱。尽管还需要进一步改进才能更全面地模拟成人肝脏生物学，但这些模型为基础研究和早期转化研究提供了一个实用的平台。

**作者贡献**
J. Xu（Junming）、J. Li和F. Wu构思了这项研究；J. Xu（Junming）、J. Ke、J. Xu（Jiasen）、X. Chen和R. Cai进行了实验；X. Shi和F. Wu监督了整个工作；X. Sang和S. Lin参与了结果讨论；J. Xu（Junming）、X. Sang和F. Wu撰写了手稿。

**数据和材料可用性**
评估论文中结论所需的所有数据都包含在论文和/或补充材料中。数据请求可以发送至[e-mail]。

**财务支持**
本工作得到了中国国家重点研发计划（2025YFC3408900）、深圳市医学研究基金（SMRF.D2301015）、深圳市科技创新计划（JCYJ20220818103407016）、国家自然科学基金（82172107）、广东省基础与应用基础研究基金（2024A1515011222）、深圳市战略性新兴产业专项资金（项目编号F-2022-Z99-502266）以及深圳市龙岗区科技创新专项资金（LGKCYLWS2022007）的支持。