不同γ-分泌酶抑制剂对人类角质形成细胞的独特影响及共同作用机制

《JID Innovations》：Distinct and Shared Effects of Individual γ-secretase Inhibitors on Human Keratinocytes

　　斯蒂芬妮·L·谢尔（Stephanie L. Schell）| 奥斯汀·B·蒙哥马利（Austin B. Montgomery）| 罗伯特·P·菲汉（Robert P. Feehan）| 塞奥·塔达希科（Tadahiko Seo）| 金彩敏（ChaeMin Kim）| 康昭远（Zhaoyuan Cong）| 伊丽莎白·A·普罗克特（Elizabeth A. Proctor）| 安德鲁·P·科瓦尔奇克（Andrew P. Kowalczyk）| 阿曼达·M·纳尔逊（Amanda M. Nelson）
美国宾夕法尼亚州赫尔希市宾夕法尼亚州立大学医学院皮肤病学系

**摘要**
γ-分泌酶（γ-secretase）是一种酶促跨膜复合物，负责切割超过100种底物，包括notch、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein）、特定细胞因子受体以及其他I型跨膜蛋白。γ-分泌酶复合体中的基因变异与家族性化脓性汗腺炎（familial hidradenitis suppurativa，简称HS）相关，这些变异被认为会使其酶功能失活。此外，γ-分泌酶抑制剂在患有纤维瘤（desmoid tumors）的患者中可引发类似HS的病理反应。然而，目前尚不清楚γ-分泌酶在角质形成细胞（keratinocytes）中的活性调节如何影响细胞过程并促进HS的病理机制。我们研究了γ-分泌酶功能丧失对角质形成细胞介导的炎症细胞因子和趋化因子生成以及细胞黏附的影响——这两种过程在HS中发生了改变。我们使用了具有不同作用机制和底物选择性的γ-分泌酶抑制剂（SCP0004、nirogacestat和E2012）（例如，对notch的处理作用）。每种抑制剂对正常人类角质形成细胞的功能都表现出既具有差异性又具有相似性的影响。SCP0004显著调节了炎症细胞因子的产生，而nirogacestat则对某些趋化因子和细胞因子有调节作用，E2012则几乎没有影响。相反，所有γ-分泌酶抑制剂都降低了角质形成细胞的黏附能力。因此，γ-分泌酶抑制剂可能驱动与HS发展相关的角质形成细胞功能。未来研究这些特定底物的作用机制可能有助于阐明药物诱导的HS表型的机制。

**引言**
γ-分泌酶是一种关键的酶促复合物，由四个核心亚基组成：nicastrin（NCSTN）、presenilin（PSEN1）、anterior pharynx defective-1（APH-1）和presenilin enhancer（PSENEN）。Presenilin是负责切割I型跨膜蛋白的催化成分，而其他成分则对复合物的结构、运输、稳定性和底物选择性至关重要（Zhang等人，2014年）。γ-分泌酶的活性主要与notch和淀粉样前体蛋白（APP）的切割有关，但它也能切割超过100种其他已知底物（Güner和Lichtenthaler，2020年；Haapasalo和Kovacs，2011年）。因此，γ-分泌酶对生物功能具有多方面的影响，精细调节其活性对于维持稳态和适当响应生物信号至关重要（Wong等人，2020年）。缺乏presenilin功能的鼠模型表现出表皮增生、角化过度、充满角蛋白的表皮囊肿、毛囊缺陷、免疫细胞浸润和皮肤炎症等症状（Pan等人，2004年；Tournoy等人，2004年；Xia等人，2001年）。缺乏nicastrin功能的鼠模型也表现出类似的表型，包括毛囊缺陷、角化过度、皮肤炎症和免疫细胞浸润（Shi等人，2023年；Yang等人，2020年）。γ-分泌酶复合体中的基因变异与人类疾病相关，尤其是阿尔茨海默病以及与皮肤相关的化脓性汗腺炎（HS）（Frew等人，2017年；Hur等人，2022年；Wang等人，2010年；Wang等人，2021年）。
γ-分泌酶复合体中的基因变异占家族性HS病例的30%，其中大多数变异位于NCSTN基因上（Frew等人，2017年；Kj?rsgaard Andersen等人，2024年；Wang等人，2010年；Wang等人，2021年）。根据计算机模拟分析，这些变异被认为会导致γ-分泌酶复合体失活（Frew和Navrazhina，2019年；Li等人，2019年）。进一步支持γ-分泌酶功能丧失在HS病理机制中的作用的是，用于治疗纤维瘤的γ-分泌酶抑制剂会在患者中引发类似HS的皮肤病变以及其他皮肤疾病（Frantz等人，2025年；Gounder等人，2023年；O’Sullivan Coyne等人，2018年；Ríos-Vi?uela等人，2024年；Tai等人，2025年）。最初，异常的γ-分泌酶对notch的处理被认为是HS的潜在驱动因素，因为notch在皮肤发育中起重要作用（Melnik和Plewig，2013a；Nowell和Radtke，2013年）。然而，NCSTN的变异并不能完全解释异常的notch信号传导，这表明需要识别γ-分泌酶的其他非notch依赖性效应（Zhang和Sisodia，2015年）。了解γ-分泌酶功能如何影响角质形成细胞生物学特性非常重要，因为该酶在人类表皮中有表达，且角质形成细胞在HS病理机制中起关键作用（Dajnoki等人，2022年；Frings等人，2022年；He等人，2019年；Hotz等人，2016年；Schell等人，2023年；Xia等人，2001年；Xiao等人，2016年）。然而，关于γ-分泌酶或notch对人类角质形成细胞过程影响的研究有限，主要集中在角质形成细胞增殖、分化、PTPRK表达和mTOR活性方面（He等人，2020年；He等人，2019年；Takazawa等人，2015年；Xiao等人，2016年；Xu等人，2015年；Zhou等人，2021年）。其他在HS中异常调节的角质形成细胞功能，如炎症细胞因子反应和细胞黏附，在γ-分泌酶的背景下仍很大程度上未被探索（Dajnoki等人，2022年；Hotz等人，2016年；Nelson等人，2019年；Schell等人，2023年）。关于γ-分泌酶和notch在免疫细胞、脂肪细胞和小胶质细胞中的作用的研究表明，γ-分泌酶能调节细胞因子和趋化因子的反应，但关于这种调节的正面或负面影响尚无定论，这可能取决于细胞类型、细胞因子和底物（Jayadev等人，2010年；Li等人，2019年；Nascimento等人，2021年；Pérez-Cabezas等人，2011年；Sauma等人，2012年；Sparling等人，2020年；Tsao等人，2011年）。关于γ-分泌酶对细胞黏附的影响的研究较为有限，且尚未在原代角质形成细胞中进行。在A431上皮细胞系和PCI52口腔鳞状细胞癌细胞系中，γ-分泌酶对E-钙黏蛋白（E-cadherin）或P-钙黏蛋白（P-cadherin）的切割会减少细胞连接和黏附（Bauer等人，2013年；Marambaud等人，2002年）。另外，使用稳定表达β2的中国仓鼠卵巢细胞的研究显示，γ-分泌酶对β2的切割对于伤口后的细胞聚集和迁移是必需的（Kim等人，2005年）。因此，研究原代人类角质形成细胞中的γ-分泌酶活性将有助于阐明γ-分泌酶如何调节与HS等疾病相关的关键角质形成细胞过程。

我们测试了多种γ-分泌酶抑制剂对原代人类角质形成细胞的影响，以确定具有不同作用机制的γ-分泌酶抑制剂（如针对notch或其它底物的抑制剂）如何影响正常的人类角质形成细胞生物学。我们特意选择了与HS相关病变有关的γ-分泌酶抑制剂nirogacestat，以研究该药物如何驱动与HS相关的病理过程。我们特别研究了γ-分泌酶抑制如何影响人类角质形成细胞产生的炎症细胞因子和趋化因子，从而了解γ-分泌酶功能及其下游底物的调节如何影响HS相关的炎症细胞因子反应。虽然notch保护性抑制剂E2012对细胞因子和趋化因子的产生没有影响，但针对notch的抑制剂（SCP0004和nirogacestat）确实改变了角质形成细胞的炎症细胞因子和趋化因子谱型。因此，除了notch之外，γ-分泌酶的其他底物也可能影响角质形成细胞的细胞因子和趋化因子谱型。所有γ-分泌酶抑制剂都降低了角质形成细胞的黏附能力，并且这与细胞黏附连接和桥粒蛋白的定位及表达改变有关。总体而言，γ-分泌酶抑制改变了角质形成细胞的黏附能力和炎症细胞因子的产生，这为未来研究药物诱导的HS机制提供了有价值的见解。

**结果**
γ-分泌酶抑制剂具有不同的作用机制和对底物处理的下游靶点。
在本研究中，我们测试了三种γ-分泌酶抑制剂：Sigma Aldrich公司的实验性γ-分泌酶抑制剂化合物SCP0004、nirogacestat和E2012。SCP0004是一种leupeptin类似物，通过结合活性位点来抑制γ-分泌酶的活性（Wolfe，2008年）。我们选择这种第一代抑制剂是因为它针对notch切割，能够广泛抑制γ-分泌酶的活性并产生相应的表型效应。FDA批准的nirogacestat会在患有纤维瘤的患者中引发类似HS的病变（Frantz等人，2025年；O’Sullivan Coyne等人，2018年；Tai等人，2025年）（表1）。Nirogacestat是一种较新的抑制剂，它更选择性地靶向notch切割，但可能与早期Generation的SCP抑制剂产生不同的效果。E2012是一种γ-分泌酶调节剂，它作用于presenilin和nicastrin的界面，从而影响底物选择性和招募（Yang等人，2021年）。我们选择E2012是因为据报道它可以保护notch切割，从而能够区分依赖notch的和非依赖notch的表型（Borgegard等人，2012年）。这些抑制剂使我们能够评估notch与其他γ-分泌酶底物的重要性。

**表1. 本研究中使用的γ-分泌酶抑制剂汇总**
| 抑制剂 | 作用机制 | Notch状态 | 临床试验 | 显著的皮肤副作用 | 对角质形成细胞的影响（本研究） |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| SCP0004 (SCP) | Leupeptin类似物，结合γ-分泌酶活性位点 | 切割抑制 | 无（实验化合物） | 广泛调节细胞因子/趋化因子；减少角质形成细胞黏附 |
| Nirogacestat | 未知 | 切割抑制 | 纤维瘤（FDA批准）；卵巢颗粒细胞肿瘤（II期）；多发性骨髓瘤（I/II期） | 类HS病变/皮肤病变；毛发变化；红斑、丘疹和斑疹 | 选择性调节细胞因子/趋化因子；减少角质形成细胞黏附 |
| E2012 | 通过在NCSTN/PSEN1蛋白界面结合来阻止底物招募 | 切割保护 | 阿尔茨海默病（仅I期） | 无报告（试验提前终止） | 对细胞因子/趋化因子无影响；减少角质形成细胞黏附 |

由于notch切割是这些抑制剂之间的一个关键差异，我们验证了它们在原代人类角质形成细胞中的预期效果。当角质形成细胞受到多个剂量的抑制剂处理时，SCP和nirogacestat能够阻止notch的切割（Notch Intracellular Domain (NICD)缺失）。然而，0.1 μM和1 μM的E2012仍能切割notch（存在NICD），而10 μM的E2012则不能。我们通过观察角质形成细胞形态的变化（通过细胞长宽比的变化来量化）确认了1 μM E2012的活性，并随后在本研究中用单剂量抑制剂进行了实验（图1）。在本研究条件下，nirogacestat、E2012和SCP均未引起细胞死亡（通过PARP切割来指示）。总体而言，这些结果证实了三种抑制剂均能按预期抑制notch切割，并且本研究的条件适合进行下游表型分析。

**图1. γ-分泌酶抑制剂活性的验证。**
图1显示了原代人类角质形成细胞经不同剂量DMSO对照、SCP或nirogacestat处理后，notch intracellular domain (NICD)和GAPDH的免疫印迹图像。(a) DMSO对照；(b) DMSO对照或不同剂量E2012处理后的情况（n=2个生物学重复/条件）。细胞在收获前15分钟用胰蛋白酶处理以诱导和同步notch切割。(c) 原代人类角质形成细胞经DMSO对照、SCP或nirogacestat不同剂量处理48小时后的代表性相位对比图像。(d) 经1 μM E2012处理48小时后角质形成细胞长宽比的量化（n=5个生物学重复/条件；每个条件40个细胞）。通过测量长宽比来判断细胞是否因E2012而发生形态变化。尽管1 μM E2012剂量下notch切割未受抑制，但细胞形态发生了变化，表明该药物在1 μM剂量下具有活性。数据为平均值±标准误差（SEM）。比较使用了Mann-Whitney检验。*p<0.05。
(e) 经1.05 μM SCP、10 μM nirogacestat或1 μM E2012处理48小时后全长和切割PARP的代表性免疫印迹。(f) 切割PARP和总PARP的百分比的量化。数据为平均值±标准误差。方块和三角形代表独立实验。每个组有3个生物学重复。比较使用了Dunnett的多重比较检验（2因素ANOVA）。

SCP和nirogacestat改变了角质形成细胞中的炎症细胞因子和趋化因子基因转录，而E2012的影响较小。许多γ-分泌酶的单独底物，包括notch，都参与炎症反应（Cheng等人，2015年）。然而，尚不清楚广泛改变γ-分泌酶底物选择性和活性的抑制剂如何影响正常角质形成细胞中的炎症细胞因子反应。鉴于γ-分泌酶抑制与HS样病变形成的相关性，我们探讨了每种γ-分泌酶抑制剂如何特异性地改变HS相关的细胞因子和趋化因子。首先，我们纳入了在两项或更多HS角质形成细胞研究中上调的细胞因子和趋化因子（Dajnoki等人，2022年；Hotz等人，2016年；Jin等人，2023年；Schell等人，2023年）。根据这些标准，我们选择了CCL2、CCL5、CXCL3、CXCL10、IL-1β、IL-6、IL-8和TNFα进行研究。我们测试了不同剂量的γ-分泌酶抑制剂对健康角质形成细胞中这些细胞因子和趋化因子转录的诱导作用，处理时间为处理后24小时。首先，我们比较了针对notch的抑制剂（SCP、Niro；图2）和保护notch的抑制剂（E2012；图3）。使用1.05 μM的SCP时，IL-8和IL-6的转录显著上调（20-50倍；p < 0.001），而TNFα、CCL2和CXCL3的转录中度上调（约5倍；p < 0.05）（图2a）。CXCL10是唯一一个在SCP处理后显著下调（下降6倍，p < 0.001）的转录本，而IL-1β和CCL5受SCP的影响相对较小。
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**图2.** Notch靶点抑制剂SCP和nirogacestat在处理后24小时对角质形成细胞中的细胞因子和趋化因子转录具有差异性影响。使用qRT-PCR检测经（a）剂量滴定的SCP γ-分泌酶抑制剂（0.21 μM或1.05 μM；绿色）或溶剂对照组（DMSO；粉色）或（b）剂量滴定的nirogacestat（0.1 μM、1 μM或10 μM；黄色）或溶剂对照组（DMSO；粉色）处理24小时后的原代人角质形成细胞产生的HS相关细胞因子和趋化因子。对于A和B组，每种抑制剂都进行了三次独立实验，每组每次实验有2-3个生物重复样本。数据以所有生物重复样本的平均值±标准误差（SEM）表示。通过与溶剂对照组的Kruskal-Wallis检验进行比较，并使用Dunn的post-hoc检验进行多重比较。统计显著性等级如下：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
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**图3.** Notch保护抑制剂E2012在处理后24小时对角质形成细胞中的细胞因子和趋化因子转录影响较小。使用qRT-PCR检测经剂量滴定的E2012 γ-分泌酶抑制剂（0.1 μM、1 μM或10 μM；蓝色）或溶剂对照组（DMSO；粉色）处理24小时后的原代人角质形成细胞产生的HS相关细胞因子和趋化因子。进行了三次独立实验，每组每次实验有2-4个生物重复样本。数据以所有生物重复样本的平均值±标准误差（SEM）表示。通过与溶剂对照组的Kruskal-Wallis检验进行比较，并使用Dunn的post-hoc检验进行多重比较。统计显著性等级如下：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

作为新一代抑制剂，nirogacestat预计比SCP更具选择性。与SCP类似，TNFα和CCL2的转录本也有所增加（约3倍；p < 0.05），但IL-1β和CCL5的转录本受影响较小（图2b）。与SCP处理不同，CXCL3未受影响，CXCL10略有增加（约2倍，p < 0.05；0.1 μM），而IL-6在nirogaceSTAT处理后下调（约2倍；p < 0.05，10 μM剂量）（图2b）。尽管这两种抑制剂均有效靶向notch（图1），但它们对细胞因子和趋化因子转录表达的影响程度和方向性（例如IL-6、CXCL10）有所不同，这表明除了notch之外，其他γ-分泌酶底物的切割也影响了角质形成细胞的炎症细胞因子和趋化因子谱型。

最后，我们评估了notch保护抑制剂E2012以进一步阐明notch在炎症细胞因子反应中的作用。我们观察到1 μM E2012处理后几乎没有反应（notch保护），IL-1β转录本仅略有增加（约2倍；p < 0.05）（图3）。在最高浓度10 μM下，E2012也靶向notch（图1），CCL2和CXCL10的转录本显著下降（分别约10倍、约2.5倍），而CXCL3的转录本略有增加（约2倍）（图3）。SCP和nirogacestat调节角质形成细胞的炎症细胞因子和趋化因子的分泌，而E2012则不会。

基于这些抑制剂处理24小时后的转录本结果，我们使用48-plex Luminex测定法在处理48小时后量化了培养基中分泌的细胞因子、趋化因子和生长因子（蛋白水平）。48-plex细胞因子、趋化因子和生长因子Luminex测定法不仅分析了上述转录本测定中包含的细胞因子/趋化因子，还发现了额外调节的因素。抑制剂剂量是根据底物选择性、细胞形态、细胞存活率和细胞因子转录本评估确定的（图1、2、3）。

与转录本分析类似，每种notch靶向γ-分泌酶抑制剂都改变了角质形成细胞的炎症细胞因子和趋化因子的分泌（图4a-c）。SCP引起的效果最强，并且与nirogacestat、E2012和对照组明显不同（图4a-b）。与处理24小时后的1.05 μM SCP转录本评估结果一致，IL-6和IL-8的分泌显著增加，CXCL10的分泌呈下降趋势，而IL-1β在SCP处理后48小时未受影响（图4b-c）。相比之下，TNFα和CCL2在处理24小时时转录本水平升高，但在处理48小时后分泌并未增加；CCL5在转录本水平上基本不变，但在处理48小时后分泌显著增加（图4c）。CXCL3未包含在Luminex测定范围内，也未在蛋白水平上进行评估。我们还通过Luminex测定发现了SCP介导的其他细胞因子、趋化因子和生长因子的调节。IL-1α和分泌的IL-1RA（代表受体激活）在SCP处理后上调，IL-1信号通路此前与HS发病机制相关（图S1、S2）（Calabrese等人，2024年；Campbell等人，2024年；Witte-H?ndel等人，2019年）。SCP还影响了通常与HS发病机制无关的其他生长因子，包括PDGF-AA和VEGF-A（下调），以及FGF-2、GM-CSF和TGFα（上调）（图S1、S2）。

**图4.** SCP在处理后48小时显著改变角质形成细胞的炎症细胞因子、趋化因子和生长因子的分泌，nirogacestat影响较小，而E2012则没有影响。（a）主成分分析（PCA）图显示PC1与PC2的得分，其中DMSO对照组（粉色）、E2012（蓝色，1 μM）、nirogacestat（黄色，10 μM）和SCP（绿色，1.05 μM）处理后的原代人角质形成细胞样本用Luminex测定法在处理后48小时的上清液表示。（b）热图显示所有高于检测限的细胞因子/趋化因子/生长因子的表达情况（DMSO对照组，粉色；E2012，蓝色；nirogacestat，黄色；SCP，绿色）（使用处理后48小时的上清液进行Luminex测定）。（c）图1和2中所示相应细胞因子和趋化因子的浓度图。CXCL3未包含在Luminex测定范围内。一次独立实验，每个组有3个生物重复样本。数据以平均值±标准误差（SEM）表示。通过与溶剂对照组的Kruskal-Wallis检验进行比较，并使用Dunn的post-hoc检验进行多重比较。*p<0.05，**p<0.01。

如转录本分析所示，nirogacestat在处理48小时后对细胞因子和趋化因子的分泌表现出更具有针对性和较小的影响（图4a-c）。CXCL10的分泌在处理后48小时增强，这与转录本的轻微增加相符（图4c）。尽管nirogacestat的转录本水平没有变化，但其也增加了CCL5的分泌。CCL2和TNFα在转录本水平上上调，但在处理48小时后未能有效分泌（图4a-c）。IL-1β、IL-8和IL-6的分泌未受影响，与转录本水平相似，但与处理24小时时的下调情况相反。在nirogacestat处理后，Luminex测定中没有其他因素具有统计显著性。然而，与SCP类似，我们观察到生长因子PDGF-AA呈趋势性下调，而分泌的IL-1RA呈趋势性上调（图S1）。

与转录本分析一致，1 μM E2012对角质形成细胞的细胞因子和趋化因子分泌影响最小，与DMSO对照组相比没有显著变化（图4a-c、S1、S2）。

**γ-分泌酶抑制减少角质形成细胞的粘附**
几种γ-分泌酶底物参与细胞粘附（Güner和Lichtenthaler，2020年；Haapasalo和Kovacs，2011年）。因此，我们使用dispase解离测定法评估γ-分泌酶是否对角质形成细胞的最佳粘附是必需的。由于SCP单独就能引起强烈的炎症细胞因子反应，从而降低细胞粘附（Shutova等人，2023年），我们首先研究了nirogacestat和E2012。处理10 μM nirogacestat后，与溶剂对照组相比，角质形成细胞的粘附显著降低，这表现在机械应力下单层细胞碎片增多（图5a）。处理1 μM或10 μM的nirogacestat后，也与溶剂对照组相比，角质形成细胞单层的碎片增多（图5b）。与SCP处理相比，SCP处理也导致角质形成细胞单层细胞碎片增多（图6）。这些结果表明，γ-分泌酶功能对于角质形成细胞的最佳粘附是必需的，独立于炎症细胞因子的升高效应。

**图5.** γ-分泌酶抑制减少角质形成细胞的粘附。使用剂量滴定的（a）nirogacestat（1 μM或10 μM；黄色）或溶剂对照组（DMSO；粉色）或（b）E2012（1 μM或10 μM；蓝色）或溶剂对照组（DMSO；粉色）处理原代人角质形成细胞72小时后进行dispase解离测定。在处理48小时时切换至高钙KGM-Gold培养基，使细胞在最后24小时内处于高钙环境中，以便 junctions组装。每种抑制剂进行了四次独立实验，每组每次实验有2-3个生物重复样本。数据以所有生物重复样本的平均值±标准误差（SEM）表示。通过与溶剂对照组的Kruskal-Wallis检验进行比较，并使用Dunn的post-hoc检验进行多重比较。统计显著性等级如下：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

**图6.** SCP处理导致角质形成细胞粘附减少。（a）使用DMSO对照组或1.05 μM SCP处理72小时的原代人角质形成细胞进行的dispase解离测定代表性图像。在采集图像前，角质形成细胞在轨道振荡器上受到4分钟的压力。（b）量化角质形成细胞在机械应力下产生的碎片数量（n=2次独立实验，每次实验有2-3个生物重复样本；通过ROUT检验去除异常值（Q = 1%））。数据以平均值±标准误差（SEM）表示。使用Mann-Whitney检验进行比较。p= 0.0541

**γ-分泌酶抑制改变粘接蛋白的定位和表达水平**
为了确定角质形成细胞粘附是如何减少的，我们研究了γ-分泌酶抑制剂处理后粘接连接和桥粒蛋白的定位和表达是否发生变化。免疫荧光分析显示，每种γ-分泌酶抑制剂处理后，E-钙粘附蛋白（E-cadherin，E-cad）在细胞连接处的分布更加分散（图7a，S3）。免疫印迹分析显示，nirogacestat处理的角质形成细胞中总E-cad和p120-连环蛋白（调节E-cadherin在质膜上的稳定性）表达减少约50%，而E2012处理后没有这种变化（图7b）。对desmoglein 3（Dsg3）的免疫荧光染色显示定位没有明显变化，但在nirogacestat或E2012处理后总Dsg3表达减少了约50%（图7a-b）。SCP处理的（1.05 μM）角质形成细胞显示出与nirogacestat处理的角质形成细胞相似的趋势（图S3）。为了量化位于细胞膜上的E-cad和Dsg3的数量，我们进行了细胞分级，以分离膜结合蛋白和可溶蛋白（图S4）。我们观察到在nirogacestat或E2012处理48小时后，膜结合的E-cad和Dsg3减少了大约两倍（图7c），这支持质膜上的粘接蛋白数量减少。

**图7.** γ-分泌酶抑制改变角质形成细胞中的粘接蛋白定位和表达。原代人角质形成细胞分别用DSMO溶剂（对照组）、10 μM nirogacestat或1 μM E2012处理48小时后，（a）进行免疫荧光染色，检测p120-连环蛋白（p120）、E-钙粘附蛋白（E-cad）和desmoglein 3（Dsg3）。细胞在固定和免疫定位前在低钙到高钙环境中转换24小时。两个独立实验。E-cad和p120共染色，因此一些图像显示了同一视野中这两种不同分子的共定位。（b）处理48小时后的样本中E-cad、p120、Dsg3和GAPDH的代表性免疫印迹（方块）。每个生物重复样本的相对条带密度相对于对照组样本进行了标准化。数据以平均值±标准误差（SEM）表示。通过与对照组的Dunnett多重比较检验进行比较（2-way ANOVA）。（c）膜分级中E-钙粘附蛋白（膜分级）、Dsg3（膜分级）和GAPDH（可溶分级）的代表性免疫印迹。每个生物重复样本的相对条带密度相对于对照组样本进行了标准化。数据以平均值±标准误差（SEM）表示。通过与对照组的Kruskal-Wallis检验进行比较，并使用Dunn的post-hoc检验进行多重比较。**各种抑制剂对炎症细胞因子和趋化因子产生的不同影响进一步证实了γ-分泌酶抑制剂之间存在不同的底物选择性，这表明在角质形成细胞的炎症细胞因子和趋化因子反应调节中， notch蛋白以及其他底物可能也参与其中。有趣的是，所有γ-分泌酶抑制剂都降低了角质形成细胞的粘附性，表明这一过程不受notch蛋白的影响，并暗示可能存在涉及γ-分泌酶尚未确定底物的共同作用机制（表1）。

讨论
我们发现γ-分泌酶复合体在调节角质形成细胞的炎症细胞因子和趋化因子产生以及粘附性方面起着作用。这些数据及未来的研究有助于揭示与γ-分泌酶抑制剂使用相关的药物诱导性HS（扁平疣）的机制。虽然有研究表明γ-分泌酶对notch活性的影响可能是HS相关病理生理学的重要驱动因素，但这一点仍存在争议（Frew和Navrazhina, 2020；Melnik和Plewig, 2013b；Vellaichamy等人, 2021）。一些研究发现，在HS患者的病变皮肤中，notch受体和配体的表达会增加，并且具有功能性γ-分泌酶的患者的notch信号通路会被激活，尤其是在窦道丰富的区域（Hessam等人, 2021；Oliveira等人, 2025）。而其他研究则表明HS组织中的γ-分泌酶活性会降低，且上述研究中的一些样本显示γ-分泌酶活性降低伴随着presenilin的丢失（Oliveira等人, 2025；Stabell等人, 2024）。这些研究表明HS可能存在不同的表型或进展阶段，在这些阶段中γ-分泌酶的功能可能增强或减弱（Frew, 2021）。此外， notch蛋白很可能不是γ-分泌酶在皮肤中的唯一重要底物，因为其他底物如E-cad在HS中也存在失调（Nelson等人, 2019）。尽管HS中γ-分泌酶及其底物的功能发生了改变，但很少有研究探讨γ-分泌酶失活或基因变异对角质形成细胞功能的影响（Xiao等人, 2016；Zhou等人, 2021）。在这里，我们阐明了γ-分泌酶抑制剂如何影响角质形成细胞介导的炎症细胞因子和趋化因子的产生及其粘附性。我们的结果支持γ-分泌酶抑制剂在减少HS相关细胞因子和趋化因子的分泌以及降低角质形成细胞粘附性方面的作用，这为解释为何服用其他适应症γ-分泌酶抑制剂的患者会出现类似HS的皮肤反应提供了解释。

γ-分泌酶是一个复杂的酶复合体，能够处理超过100种底物，因此它在维持体内平衡和疾病过程中起着关键作用（Güner和Lichtenthaler, 2020；Haapasalo和Kovacs, 2011；Zhang等人, 2014）。许多关于γ-分泌酶的研究集中在单个底物在细胞功能中的作用上，但很少关注同时改变大多数或所有γ-分泌酶底物的处理所带来的影响，正如药物抑制所导致的那样。尽管单个底物显著影响细胞功能，但改变γ-分泌酶的整体底物网络可能会产生与单一底物变化不同的效果。我们在本研究中观察到了E-cad定位和细胞粘附性的这种变化。E-cad是γ-分泌酶的直接底物，当它被切割后，会从细胞膜上释放出来，导致粘附连接结构的解体（Marambaud等人, 2002）。相反，当γ-分泌酶被抑制时，应能稳定E-cad在细胞膜上的位置并改善细胞粘附性。当我们用三种不同的γ-分泌酶抑制剂处理角质形成细胞时，观察到细胞粘附性降低，这表明除了E-cad的处理外，还有其他细胞功能参与了γ-分泌酶抑制剂处理后的粘附性丧失。另一项研究观察到E-cad膜定位的间接调节，因为它与notch活性有关（White等人, 2023）。由于即使使用不影响notch的γ-分泌酶抑制剂（E2012）也会观察到E-cad定位的异常和细胞粘附性的降低，因此可能还有其他γ-分泌酶的底物影响着E-cad的功能动态。其中一个候选底物是dystroglycan，当其表达下调时，会导致细胞膜上E-cad的减少（Sirour等人, 2011）。除了E-cad外，我们的数据还支持其他连接蛋白（如Dsg3）在γ-分泌酶抑制剂处理后的失调。最终，需要进一步的研究来确定γ-分泌酶抑制时细胞粘附性丧失的潜在因素。

我们的数据支持γ-分泌酶及其底物在改变角质形成细胞炎症细胞因子和趋化因子谱型中的作用。当使用针对notch的γ-分泌酶抑制剂（SCP和nirogacestat）时，我们观察到细胞因子、趋化因子和生长因子的转录水平和/或分泌水平既有增加也有减少。转录本与分泌蛋白之间的差异可能反映了细胞从转录本到蛋白质的转化以及随后分泌到培养基中的调节过程，同时评估时间点也可能起到作用。此外，患者之间的差异也可能存在，因为这些实验使用了不同的供体。

至少有一种抑制剂上调的一些细胞因子和趋化因子包括CCL2、CCL5、CXCL3、IL-6、IL-8、TNFα以及IL-1信号分子、IL-1α和IL-1RA。所有这些趋化因子和细胞因子及其信号通路在之前的研究中的HS皮肤和角质形成细胞中均有所升高（Dajnoki等人, 2022；Hotz等人, 2016；Jin等人, 2023；Schell等人, 2023；Witte-H?ndel等人, 2019）。值得注意的是，已获FDA批准用于HS的治疗药物（如adalimumab-针对TNFα）或处于临床试验中的药物（例如JAK抑制剂-针对IL-6信号通路；anakinra-针对IL1R；lutikizumab-针对IL-1α/β（NCT05139602）直接针对这些因子中的一个或多个，并可能对趋化因子的产生产生下游效应（Kimball等人, 2016；Krueger等人, 2023；Leslie等人, 2014；Lowe等人, 2020；Schell等人, 2025；Tzanetakou等人, 2016）。在使用不影响notch的抑制剂时，我们观察到的细胞因子和趋化因子的产生变化很小；然而，在针对notch的SCP和nirogacestat之间，尽管两者都抑制了notch处理，但在受影响的炎症因子的数量和程度上存在显著差异。因此，尽管notch可能对角质形成细胞的炎症细胞因子和趋化因子反应有一定影响，但其他γ-分泌酶底物很可能也参与其中。

用药物化合物抑制γ-分泌酶最能模拟那些因其他原因使用这些药物而出现类似HS病变的患者的反应。在这项研究中测试的三种抑制剂中，有两种已经经历了临床试验或目前获得了FDA批准。E2012因在临床前大鼠模型中观察到晶状体混浊而被撤回了一期临床试验（Nakano-Ito等人, 2014）。Nirogacestat已获FDA批准用于治疗软组织瘤患者（Gounder等人, 2023）。在测试的抑制剂中，nirogacestat是唯一一种被报道会导致类似HS病变的抑制剂（Frantz等人, 2025；O’Sullivan Coyne等人, 2018）。在nirogacestat的三期临床试验中，还发现了毛发变化、皮肤红斑、丘疹和皮疹等不良事件，表明它还有额外的皮肤特异性副作用（Gounder等人, 2023）。Nirogacestat目前正在开展针对卵巢粒细胞瘤（NCT05348356）和多发性骨髓瘤（NCT05556798、NCT04126200、NCT04722146）的临床试验，这可能会增加未来因使用nirogacestat而出现药物诱导性类似HS病变的患者数量。其他γ-分泌酶抑制剂也显示了皮肤不良反应。在针对阿尔茨海默病的semagacestat的三期临床试验中，皮肤疹被确认为不良事件；而在针对腺样囊性癌的γ-分泌酶抑制剂AL101的最近试验中，报告了多种皮肤表现，包括丘疹性皮疹、脱发、瘙痒、皮肤病变和毛发颜色变化（Doody等人, 2013；Henley等人, 2014），表明使用γ-分泌酶抑制剂时皮肤表现的发生率较高（Doody等人, 2013；Henley等人, 2014）。γ-分泌酶抑制剂AL102目前正在针对软组织瘤进行临床试验（NCT04871282）。

尽管我们的研究没有探讨家族性HS患者中γ-分泌酶复合体成分的具体基因变异，但类似的分析将在未来的研究中补充使用药物抑制剂的数据。与个别γ-分泌酶抑制剂观察到的差异类似，每个基因变异可能对底物选择性、整体复合体活性以及下游机制功能有不同的影响。综合这些评估，可以全面了解由γ-分泌酶复合体引起的药理学和遗传学诱导的HS。

总体而言，我们关于炎症细胞因子和趋化因子产生及粘附性的结果表明，多种γ-分泌酶的靶点可能参与角质形成细胞的功能和HS的发病机制，而不仅仅是notch蛋白。理想情况下，未来对γ-分泌酶底物的筛选将有助于揭示γ-分泌酶在角质形成细胞生物学中的某些可能不受notch影响的职能，以及HS中异常角质形成细胞的功能。进一步探索在表达γ-分泌酶并参与HS的其他细胞类型中的候选底物，将有助于解析γ-分泌酶在体内平衡和疾病状态下在皮肤中的复杂功能。

**材料与方法**

**正常人角质形成细胞的分离与培养**
根据我们机构的标准护理程序收集新生儿包皮，并按照批准的IRB协议进行去识别处理。包皮用PBS和抗生素清洗，手工切成小块，然后在4°C下用dispase（Corning）消化过夜。第二天，手动分离表皮和真皮，然后将分离出的表皮在37°C下用trypsin消化10-15分钟以释放角质形成细胞。所得细胞悬液通过100 μm滤膜过滤，计数后接种在含有KGM-GOLD培养基和生长补充剂的胶原包被细胞培养板上（Lonza）。当细胞密度达到70-80%时，将角质形成细胞传代到未包还被培养板上以进行进一步扩增和后续实验。为了补充我们内部的角质形成细胞供应，我们从Lonza购买了包装好的新生儿包皮角质形成细胞批次（编号00192906）用于所有实验。

**γ-分泌酶抑制剂处理**
当培养的角质形成细胞达到70-80%的密度时，向培养基中加入γ-分泌酶抑制剂或溶剂对照（DMSO）。使用了三种不同的抑制剂：一种实验性γ-分泌酶抑制剂化合物（SCP；针对notch；Pubchem：Benzyloxycarbonyl-leucyl-leucyl-norleucinal，Sigma-Aldrich，编号SCP0004）、Nirogacestat（Sigma-Aldrich，针对notch）和E2012（Biotechne，不影响notch）。选择Nirogacestat是因为它已知会导致类似HS的病理变化（Frantz等人, 2025）。所有抑制剂的详细信息见表1。在选择实验浓度之前，先对所有抑制剂进行了滴定。对于RNA实验，SCP使用以下浓度：1.05 μM和0.21 μM。Nirogacestat和E2012分别使用以下浓度：10 μM、1 μM和0.1 μM。dispase实验中SCP使用1.05 μM，nirogacestat和E2012分别使用10 μM和1 μM。溶剂对照使用相当于每种抑制剂最高剂量的DMSO。对于Luminex、免疫荧光染色和Western blotting实验，使用单一浓度：SCP（1.05 μM）、Nirogacestat（10 μM）和E2012（1 μM）。对于在使用抑制剂后收集RNA的实验中，角质形成细胞被处理24小时。对于Luminex实验、连接蛋白的免疫荧光染色和Western blotting，角质形成细胞被处理48小时。在固定前24小时，将培养基从低钙切换为高钙以诱导连接结构的形成。对于进行dispase解离实验的实验，细胞被处理72小时，48小时更换培养基并更换为高钙环境。dispase解离实验的更多细节如下所述。

**Notch胞内结构域（NICD）的评估**
为了评估NICD，角质形成细胞预先用不同浓度的γ-分泌酶抑制剂处理。为了诱导和同步notch切割，角质形成细胞先用trypsin处理15分钟，然后通过蛋白裂解缓冲液（NaCl-Tris、蛋白酶抑制剂、0.1% SDS）裂解蛋白质。溶液通过23G针头过滤10次，离心后收集上清液。使用Thermo Fisher Pierce BCA蛋白测定试剂盒测定样品中的蛋白质浓度。

equal amounts of protein were loaded into the wells of an Invitrogen 4-12% Bis-Tris Mini-gel. Samples were run using Thermo Fisher NuPAGE MOPS SDS running buffer and transferred onto an Immobilon PSQ PVDF membrane (Millipore). Blots were blocked with 5% milk and probed with primary antibody diluted in 5% BSA. After incubation with diluted Cleaved Notch1 (Val1744) antibody (Table 2), blots were probed with anti-rabbit secondary antibody conjugated to HRP. Thermo Fisher Supersignal West Pico Plus Chemiluminescent Substrate was added to the blot.SCP和nirogacestat印迹实验使用了Labforce Autoradiography Film（Thomas Scientific）进行。E2012印迹的成像采用了ChemiDoc MP成像系统（Bio-Rad）。表2列出了抗体及其稀释信息。

**免疫荧光实验用的一抗及相应信息：**

| 抗原 | 公司 | 目录号 | 浓度 | 抗体类型 | 掩蔽剂 |
|--------------|--------------|---------------|------------------|--------------|
| E-钙黏附蛋白 | BD Biosciences | 610182 | 1/500 | 鼠类 | 5% BSA |
| p120-连环蛋白 | Santa Cruz | sc-110 | 1/250 | 兔类 | 5% BSA |
| Desmoglein-3 | Thermo | 32-6300 | 1/250 | 鼠类 | 5% BSA |

**Western Blot实验用的一抗及相应信息：**

| 抗原 | 公司 | 目录号 | 浓度 | 抗体类型 | 溶液 |
|--------------|--------------|---------------|------------------|--------------|
| E-钙黏附蛋白 | Cell Signaling | 3195 | 1/1000 | 兔类 | 5% BSA |
| p120-连环蛋白 | BD Transduction | 610134 | 1/1000 | 鼠类 | 5% BSA |
| Desmoglein-3 | Thermo | 32-6300 | 1/250 | 鼠类 | 5% BSA |
| PARP | Cell Signaling | 9542 | 1/1000 | 兔类 | 5% BSA |
| Cleaved Notch 1 (Val1744) | Cell Signaling | 4147 | 1/3000 | 兔类 | 5% BSA |

**二抗及相应信息：**

| 名称 | 公司 | 目录号 | 浓度 | 抗体类型 | 应用 |
|--------------|--------------|---------------|------------------|--------------|
| Anti-mouse IgG2a Alexa 488 conjugate | Thermo | A-2113 | 1/3000 | 山羊 |
| Anti-mouse IgG1 Alexa 488 conjugate | Invitrogen | A-1102 | 1/3000 | 山羊 |
| Anti-rabbit IgG Alexa 647 conjugate | Thermo | A-3157 | 1/3000 | 驴 |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7074 | 1/2000 | 驴 |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling | 7076 | 1/2000 | 山羊 |

**角质形成细胞长宽比测量：**

在处理DMSO对照组或1 μM E2012后人角形成细胞的图像是从独立孔中获取的。每种条件下使用五张图像（独立的生物学重复实验）来测量角质形成细胞的长宽比（细胞的最长/最短维度），每张图像测量40个细胞。数据使用Fiji软件中的测量工具进行分析，并用GraphPad Prism 10软件绘制图表。比较结果采用Mann-Whitney检验：*p<0.05。

**Luminex分析：**

MILLIPLEX Human Cytokine/Chemokine/Growth Factor Panel A 48 Plex预混磁珠面板被涂布在384孔板上。实验按照制造商的说明进行，并适用于384孔板格式（Kuhn等人，2023年）。数据使用Luminex Flexmap 3D仪器收集。所有样本都进行了三次技术重复实验，每组有3个生物学重复实验。Luminex结果使用R语言（R Team，2024年）和SerolyzeR包处理，根据相关标准曲线和空白值拟合每个分析物的逻辑回归模型。然后使用每个模型计算每个样本的标准曲线归一化值。技术重复实验的平均值用于生成每个生物学重复实验的单一值。由于IL-17E/IL-25在所有样本中的方差为零，因此将其排除。

**主成分分析：**

使用prcomp包进行主成分分析，并用ggplot2包绘制结果。ggplot2包用于绘制每个平均生物学重复实验的值和不同抑制剂平均值的标准误差。使用pheatmap包生成热图。

**RNA分离、cDNA合成及qRT-PCR：**

角质形成细胞用含有β-巯基乙醇的RLT缓冲液（Qiagen RNeasy Mini Kit）裂解。RNA分离按照Qiagen RNeasy Mini Kit的标准协议进行，并进行柱内DNase处理（Qiagen RNase Free DNase Set）。使用Nanodrop 1000分光光度计（Thermo Fisher）对分离的RNA进行定量。2 μg的RNA按照Applied Biosystems High-Capacity cDNA逆转录试剂盒的制造商说明进行逆转录为cDNA。进行多重qRT-PCR反应，包括RPLPO内参基因（RPLPO控制混合物Thermo Fisher Ref# 4325785）和感兴趣的基因。使用的实时检测指标包括：CCL2（Hs00234140_m1）、CCL5（Hs00982282_m1）、CXCL3（HS00171061_m1）、CXCL8（Hs00174103_m1）、CXCL10（Hs00171042_m1）、IL1B（Hs01555410_m1）、IL6（Hs00985639_m1）和TNF（Hs00174128_m1，检测与TNFα蛋白相关的转录本）。数据在Roche LightCycler 96仪器上收集，条件为：50°C下2分钟，95°C下20秒，然后是50个循环，每个循环95°C 3秒，60°C 30秒。

**Dispase解离实验：**

角质形成细胞在6孔板上培养至80%汇合度，然后加入γ-分泌酶抑制剂或溶剂对照（见“γ-分泌酶抑制剂处理”部分）。处理48小时后，给细胞添加新鲜抑制剂并将钙浓度调整为高钙培养基，即在标准KGM-Gold培养基中加入NaCl溶液，使最终钙浓度达到1.2mM。在72小时时进行dispase实验，此时细胞已达到100%汇合度并能够形成单层片状结构。用PBS洗涤细胞两次，然后在每个孔中加入1 ml Corning dispase（与PBS 1:1混合）。在37°C下孵育15分钟，直到整个细胞层从孔底脱离。在轨道摇床上以约450转/分钟的转速施加机械应力5-10分钟以破坏细胞层。在摇晃前后分别拍摄图像，并使用Adobe Photoshop软件中的计数工具手动统计细胞层片段的数量。

**细胞连接点和PARP蛋白的免疫印迹及抗体：**

收获过程中，细胞用PBS洗涤两次，直接加入1X Laemmli样品缓冲液（Bio-Rad，费城，PA）+ BME（1:20），并煮沸10分钟。全细胞提取物储存在-20°C备用。进行Western blot时，将等量的蛋白质加载到聚丙烯酰胺凝胶上。凝胶转移到硝酸纤维素膜上，并使用表2中列出的抗体进行探测。每个生物学重复实验的相对密度使用溶剂对照组的平均密度进行归一化，并在每个凝胶内计算，再相对于加载对照（GAPDH）进行归一化。%切割的PARP通过取切割PARP条带的密度除以总PARP（全长PARP + 切割PARP）的密度并乘以100来计算。比较使用Dunnett的多重比较检验（2因素ANOVA）与对照组进行。

**细胞连接点和PARP蛋白的免疫荧光染色及成像：**

在Ibidi 12孔室载玻片中用γ-分泌酶抑制剂处理角质形成细胞48小时后，用预热的4%甲醛固定细胞10分钟。通过用PBS洗涤三次去除PFA。为了染色，将载玻片用渗透缓冲液（0.1% BSA加0.25% Triton-X 100；PBS-T）封闭和渗透30分钟。接下来，在室温下用渗透缓冲液孵育一抗1小时。用PBS-T洗涤三次，然后在PBS-T中孵育二抗过夜（4°C）。用PBS-T洗涤三次后，用Prolong Glass Antifade Mountant（Thermo Fisher）封片。图像使用Zeiss Axio Observer Z1显微镜拍摄，并用Zeiss Zen 2.0软件进行分析。用于染色的抗体和稀释信息见表2。

**细胞分级及免疫印迹：**

角质形成细胞的细胞分级按照之前的方法进行（Jacob等人，2020年）。简而言之，在抑制剂处理48小时后，将细胞收集在低渗缓冲液（10 mM KCl，10 mM Tris，pH 7.5，1 mM MgCl2）中，在冰上孵育10分钟，通过20g针头过滤10次，然后在4°C下以1000 x g离心5分钟。上清液作为可溶性细胞质 fraction收集，并与4x Laemmli样品缓冲液（4x LDS，Bio-Rad）混合。膜 fraction沉淀物重新悬浮在4x LDS中。可溶性细胞质 fraction和膜 fraction样本均煮沸10分钟，然后进行免疫印迹分析（见“细胞连接点蛋白的免疫印迹及抗体”部分）。使用平行可溶性GAPDH作为每个样本的膜相关蛋白的加载对照，计算调整后的相对密度。

**统计分析：**

对于qRT-PCR、Dispase实验和Luminex分析，数据以实际数据点及其平均值±标准误差（SEM）的形式呈现。组间比较使用Kruskal-Wallis检验，并使用Dunn的事后多重比较检验与对照组进行比较。使用ROUT检验（Q=1%）识别并排除异常值。统计分析使用GraphPad Prism版本10.0（GraphPad Software，圣地亚哥，CA，美国）或R包PMCMRplus进行，p值<0.05视为具有统计学意义。对于评估总蛋白水平的Western blot，使用Dunnett的多重比较检验（2因素ANOVA）与对照组进行比较。进行了两次独立实验（不同供体），每次实验有3个生物学重复。对于细胞分级后评估膜定位蛋白水平的Western blot，使用Dunnett的多重比较检验（单因素ANOVA）与DMSO溶剂对照组进行比较（n=3个生物学重复）。

**未引用的参考文献：**

O'Sullivan等人，2018；R Team，2024。