优化猪烧伤部位酶清创后自体皮肤细胞悬浮液的输注时机：采用数字图像散斑相关技术（DISC）进行评估

《JID Innovations》：Optimizing Timing of Autologous Skin Cell Suspension after Enzymatic Debridement of Porcine Burns: Evaluation with Digital Image Speckle Correlation (DISC)

　　**石富|瑞秋·邦恩|罗秀婷|罗伯特·鲁齐克|扎克瑞·哈里斯|埃里卡·赫勒|史蒂夫·麦克莱恩|尤金·蒋|杨布里曼|米里亚姆·拉法伊洛维奇|古尔泰杰·辛格|史蒂文·桑多瓦尔|玛西娅·西蒙|穆罕默德·H·阿尔巴布|瑞秋·布朗利|利奥尔·罗森伯格|亚当·J·辛格**
**纽约州立大学石溪分校材料科学与化学工程系**

**摘要**
酶清创术能够保留深度部分厚度烧伤中的活性真皮，但自体皮肤细胞悬浮液（ASCS）的最佳应用时机仍不清楚。我们评估了ASCS是否能够增强酶清创后的生物力学恢复效果，24小时的延迟是否会影响结果，以及数字图像散斑相关（DISC）技术是否能够提供一种灵敏且无创的愈合评估方法。在猪背部烧伤模型中，伤口在酶清创后立即或24小时后接受了ASCS处理，同时使用杆菌肽作为对照组。DISC测量利用光流法量化了伤口床上的力传递情况，而组织学检查则评估了上皮再生和真皮重塑过程。补充的体外研究还检测了残留清创酶的细胞毒性。

与杆菌肽相比，ASCS显著提高了第28天的力传递恢复程度（p<0.0001），表明伤口床的生物力学整合得到了改善。立即和延迟应用的ASCS产生了相似的愈合轨迹，在最终时间点只有轻微差异。酶浓度≤0.5%时不会影响细胞活性，而更高的浓度则具有毒性。DISC测量结果与组织学重塑相吻合，并揭示了临床或组织学评分系统无法捕捉到的空间分辨的机械恢复情况。

综上所述，这些发现证实了DISC技术作为一种无创方法，可用于评估伤口愈合情况，并支持在酶清创后尽早应用ASCS，而不会影响生物力学恢复。

**引言**
虽然大多数烧伤均为浅表性，几乎没有焦痂且能顺利愈合，但深度部分厚度和全层烧伤通常需要2-3周以上才能愈合，从而导致明显的疤痕和畸形（Cubison等人，2006年；Deitch等人，1983年）。及时有效地清除坏死组织并促进上皮再生对于减少疤痕和优化功能恢复至关重要。传统的标准治疗方法是切除性清创后进行分层皮肤移植（STSG）（Janzekovic，1970年；Orgill，2009年；?uca等人，2024年）。最近，基于菠萝蛋白酶的一种蛋白水解酶混合物（NexoBrid?）的早期选择性酶清创已成为手术切除的替代方案（Hirche等人，2020年；Rosenberg等人，2014年；Rosenberg等人，2015年；Shoham等人，2024年）。此外，当受伤面积较大或有皮肤可供移植时，自体分散细胞悬浮液（ASCS）已成为替代传统STSG的再生策略（Gravante等人，2007年；Holmes Iv等人，2018年；Holmes等人，2019年；Peirce和Carolan-Rees，2019年；Wood等人，2012年）。悬浮状态下的细胞可能表现出更强的代谢活性，并在伤口表面更广泛分布，从而促进更均匀、可能更快的上皮再生（Bush等人，2024年）。尽管酶清创和ASCS都单独降低了了对自体移植的需求，但它们的联合使用尚未得到系统评估（Aoki等人，2024年；Kahn等人，2023年；Yamashita等人，2023年）。特别是酶清创后ASCS的最佳应用时机仍不确定。制造商建议最早在清创后2小时即可使用ASCS，但实际上许多临床医生会推迟24-48小时，因为担心残留的酶活性可能会损害细胞活性或“吸收”组织。此外，酶清创后形成的暂时性纤维层（伪焦痂）增加了临床判断的复杂性，进一步增加了这些技术序贯使用的最佳方案的不确定性。需要临床前模型来明确残留酶活性是否会影响ASCS的效果，并确定联合使用的最佳时机。

在这项研究中，我们首先进行了体外测试以确定清创制剂的细胞毒性水平。然后，我们在猪模型中研究了深度部分厚度（DPT）背部烧伤在酶清创后立即或24小时后应用自体分散细胞悬浮液的愈合反应。结果与仅接受局部抗生素软膏的对照组进行了比较。通过传统的H&E染色活检组织学分析以及数字图像散斑相关（DISC）技术（一种能够生成组织变形空间分辨图谱的无创成像技术）来评估愈合进展。组织学活检提供侵袭性的局部伤口样本，而DISC则捕捉整个伤口及其与周围完整组织界面的大范围实时机械变化。不同皮肤层中的机械力传递可以作为伤口愈合进展的有意义指标（Biggs等人，2020年）。通过将DISC获得的机械图谱与标准的临床和组织学指标相结合，我们提供了客观、无创的皮肤生物力学恢复评估，补充了传统的临床评分方法（如改良的温哥华疤痕评分系统），并减少了评估深度部分厚度烧伤愈合时的高变异性。

**结果**
**来自每头猪的ASCS细胞产量**
从部分厚度皮肤样本中提取的ASCS细胞密度约为10^6细胞·mL^-1，在24小时后重复计数时基本稳定。每头猪的细胞计数见表1。由于实验错误，猪3的第一天数据缺失；我们使用第二天的数据进行替代，因为ASCS的供体部位取自同一头猪的相邻皮肤。根据每头猪的平均浓度计算，猪1的细胞密度为10,040细胞·cm^-2，猪2为5,452细胞·cm^-2，猪3为6,248细胞·cm^-2，猪4为7,660细胞·cm^-2。

**酶清创剂的体外细胞毒性**
体外测试的方案如图1a所示，并在材料部分有所描述。人类间充质细胞被接种在组织培养皿上，暴露于不同临床等效剂量的NexoBrid? 4小时。相衬图像显示，当暴露于0.1-1.0%的稀释溶液中时，NexoBrid? 会引起细胞聚集。在较高剂量下观察到细胞脱离和变形（图1b）。合并脱离和附着的细胞重新接种后，仅≤2%稀释度的孔在16小时后建立了细胞覆盖；超过2%的稀释度则细胞很少再生。16小时时检测的AlamarBlue?结果表明：0.1–0.5%的剂量对细胞活性无影响（所有p ≥ 0.58，ns）；1%剂量略有下降（p = 0.074，ns）；2%剂量导致显著下降（p < 0.05，*）；5–10%剂量降至接近背景水平（p < 0.01，**）。这些数据表明，≤0.5%的残留酶剂量耐受性良好，1–2%剂量开始出现明显细胞毒性。

**数字图像散斑相关（DISC）技术在猪皮中的应用**
图1展示了NexoBrid?细胞毒性的体外评估方法：(a) 体外实验方案示意图：人类间充质基质细胞接种在24孔板中，暴露于0.1–10%临床等效浓度的NexoBrid? PBS溶液中4小时后，暴露结束后所有细胞（脱离的上清液加上胰蛋白酶处理的附着细胞）重新接种16小时进行成像。(b) 代表性明场图像显示随着剂量增加附着细胞数量减少（比例尺=100 μm）。左列显示暴露4小时后的情况，右列显示重新接种16小时后的情况。(c) 16小时重新接种后测得的AlamarBlue?在570 nm处的吸光度（OD570），代表细胞活性。数据以平均值±标准差表示。统计显著性通过Welch单因素ANOVA和Brown–Forsythe检验确定。

**ASCS对伤口愈合的改善作用**
图2展示了ASCS处理伤口的生物力学性能恢复情况。图中展示了该技术在猪伤口上的应用示意图。(a) 使用数字压力计在伤口边缘施加4牛顿（N）的标准化压痕力，以诱导伤口床和周围完整皮肤的变形。动物在接受清创和换药等同时操作时被麻醉（见方法部分），尽管压痕操作本身不需要麻醉。相机分辨率至少为4兆像素，垂直于伤口表面并手动对准感兴趣区域进行拍摄。在恒定照明和固定相机位置下拍摄图像。图2b使用DISC绘制了点压痕在猪背部皮肤中的传播情况，对照测量是在受伤前从正常背部皮肤获取的。在未受伤皮肤中，光流矢量叠加在位移-幅度热图上，显示压痕周围的平滑场域。具体来说，压痕后位移幅度在加载点或附近达到最大值，随着距离增加，位移逐渐减弱。我们将活跃区域定义为位移幅度大于或等于峰值位移的1/e的连续区域。这一标准在物理学和信号处理中常用，因为它提供了一个可重复的、与尺度无关的阈值，可以捕捉到有意义的力传递核心区域，同时抑制低-level背景噪声和光学伪影（如DPT伤口热图中的偏心标记）。在我们的分析中，1/e轮廓作为区分真实机械传播与由于呼吸和反射噪声引起的残余运动的客观阈值，使得在不同伤口、时间点和治疗组之间进行一致比较成为可能。烧伤后7天，传播在相邻的完整组织中持续存在，但在伤口内显著减弱，并主要受限于伤口边缘。这些图谱为跟踪生物力学的时空变化提供了定量基础，并用于比较不同治疗组。

**愈合程度评估**
我们定义了一个比率来表达发生传播的伤口面积比例：
**R（Forcepropagationratio）= 活跃传播区域面积 / 伤口总面积 × 100%**
应用于与伤口面积匹配的未受伤皮肤时，该比率为100%。对于图2b中的DPT烧伤伤口，R = 2.5%。接近100%的R值表示愈合情况更好，生物力学性能恢复更好。

图3总结了各治疗组中组织学重塑和机械力传递的时间演变过程。上部显示连续的苏木精和伊红（H&E）切片，下部显示相应的DISC位移-幅度图。每个时间点对每个条件进行了三次独立的压痕实验，以证明DISC测量的重复性。压痕探针通常位于伤口边缘附近，距离伤口边缘约5毫米。探针位置的微小差异对总体传播面积没有显著影响。

**结论**
所有伤口在第一天都表现出坏死焦痂和表皮完全丧失以及密集的中性粒细胞浸润。这一阶段的DISC图显示几乎没有力传递进入伤口床。到第14天，伤口边缘开始出现早期上皮再生，伴随初期胶原沉积、新生血管结构和混合炎症浸润。与这些变化一致，DISC显示出伤口内力传递的开始。在残余痂覆盖的区域，表面可视化受到限制；然而，位移矢量穿透这些区域，表明皮下机械连续性得到恢复。到第21天，治疗组间的差异变得明显。仅使用杆菌肽的伤口显示胶原沉积有限和持续炎症，力传递主要局限于边缘。使用ASCS治疗的伤口表现出更大的伤口内部传递能力，这与更先进的肉芽组织形成和胶原蛋白重塑相关。这一效应在酶清创后24小时使用ASCS治疗的伤口中最为明显，其中力量的传递更加深入和均匀地延伸到伤口床中。到第28天，仅使用杆菌肽治疗的伤口几乎没有额外的进展。立即使用ASCS治疗会导致部分重新上皮化以及力量传递的适度改善。相比之下，在延迟24小时后使用ASCS治疗的伤口则完全重新上皮化，具有重新组织的真皮结构和通畅的微血管系统，以及减低的炎症。在这一阶段，DISC图显示力量传递遍及大部分伤口区域，平均传递比例为72.4 ± 14.7%。小的非传递区域与活检位置重合，且传递模式在重复压痕过程中保持一致。总体而言，DISC提供了对伤口愈合的全面空间和定量评估，补充了组织学检查。与仅限于离散活检位置的H&E分析不同，DISC能够捕捉整个伤口表面的生物力学恢复情况，从而便于直接比较不同治疗方法的愈合进展。

对于接受三种治疗的伤口，其结果分别在第7天、14天、21天和28天在图4中绘制。统计显著性通过单因素方差分析（one-way ANOVA）确定，所有成对比较均使用Dunnett的T3多重比较检验进行。我们发现，在第21天之前，立即或清创后24小时使用ASCS治疗的伤口在愈合速率上没有显著差异。另一方面，与仅使用杆菌肽治疗的伤口相比，使用ASCS治疗的伤口愈合速率显著更快（p<0.024）。对于后者，直到第21天愈合速率似乎没有显著增加。

为了比较治疗结果，我们汇总了四头猪所有伤口在第28天的个别压痕R值，并在图5中总结了分布情况。箱线图显示了两个发现：（i）无论是立即应用还是延迟24小时后应用，ASCS都显著增强了生物力学力量的传递（p<0.0001，****）；（ii）立即应用与延迟24小时后应用ASCS之间的差异达到了边缘统计显著性（p<0.05，*）。

**伤口愈合的临床和组织学指标**

图6中，通过测量H&E染色切片上的上皮覆盖范围来量化再上皮化的程度。这一指标不一定与DISC测量的力量传递情况一致，后者反映的是整个伤口床内的机械连续性的恢复。因此，尽管可能存在上皮覆盖，但底层的胶原蛋白基质可能尚未充分重塑以支持有效的力量传递，如图14所示。此外，组织学仅采样有限的伤口部分，而DISC则评估整个伤口床。因此，尽管再上皮化数据在定性上与DISC的结果一致，但由于再上皮化的较大变异性，限制了不同治疗组间愈合进展的明确比较。

修正后的温哥华疤痕评分（MVSS）被用作疤痕质量的标准临床指标（Wihastyoko等人，2022年），同时还评估了伤口闭合时间、疤痕深度和疤痕柔韧性。MVSS评分包括柔韧性、高度、血管生成和色素沉着，得分范围从0到14（图7）。各治疗组之间的MVSS评分没有显著差异，这与序数评分在早期重塑期间检测生物力学差异时的有限敏感性一致。

在图8中，使用改进的Ehrlich–Hunt评分系统（Guo等人，2020年；Liu等人，2012年）评估了组织学愈合情况。H&E染色的切片被评估了伤口修复的关键参数，包括再上皮化程度、肉芽组织形成、胶原蛋白沉积和组织、新生血管形成以及炎症细胞浸润。每个参数都按序数等级评分：无 - 0，轻微 - 1，中度 - 2，明显存在 - 3，较高的分数表示更先进的组织再生和重塑。改良的温哥华疤痕评分和改良的Ehrlich–Hunt评分系统是用于伤口愈合的半定量、序数评估工具。然而，这两种方法都依赖于分类分级和主观解释，而不是直接物理测量。这些特点降低了对组织重塑和生物力学细微或空间异质性变化的敏感性，特别是在早期愈合期间，可能导致治疗组间差异增加和不显著的差异。在我们研究的猪模型中，评分尺度过于粗糙，无法描述伤口内的细微变化，导致标准差很大且结果不显著。上皮化评分与我们使用DISC获得的结果最为接近，但在这里，主观评估的误差范围也太大，无法得出明确结论。此外，如图组织学图像所示，表面外观不足以确定与下方组织的连接性，从而增加了误差。

关于ASCS与清创之间的时间安排：冲洗的重要性

已证实，ASCS疗法可以加速猪模型中的伤口愈合（Carney等人，2021年；Li等人，2025年）。这些细胞提供了多种生长因子的丰富来源，如表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、角质形成细胞生长因子（KGF）和转化生长因子β（TGF-β），这些因子可刺激上皮化、血管生成和真皮重塑。最近的猪实验研究表明，ASCS可以加速再上皮化，增强血管生成，并改善胶原蛋白结构，从而形成更强且更持久的再生组织（Li等人，2025年）。对于烧伤伤口，去除坏死组织对于细胞喷雾附着在伤口床上是至关重要的。与含有即使在次优条件下也能附着和血管化的真皮成分的STSG不同，细胞悬浮液高度依赖于干净、有活力的真皮表面进行附着、增殖和迁移。目前使用酶清创来清除伤口床中的坏死物质。尽管有研究（Kaita等人，2025年；Shoham等人，2024年）展示了Nexobrid?去除烧伤焦痂的有效性，但尚未获得关于ASCS应用后的最佳时间的数据。由于消化组织的同一机制也可能影响细胞膜和细胞外基质（ECM）的沉积，因此清创后追加治疗的时间可能受到残留清创物质浓度的影响。因此，我们还研究了酶溶液的细胞毒性以及在使用ASCS之前需要多少稀释。

我们根据Nexobrid?在PBS中的浓度确定细胞活力，结果显示浓度超过1%时具有显著的细胞毒性。在较低浓度（0.1-0.5%）下，Nexobrid?能够有效分离细胞与其ECM，但重新接种实验表明细胞活性得到良好维持。这些结果表明，清创后需要彻底冲洗伤口以去除残留的Nexobrid?溶液。否则，需要适当的延迟时间以便吸收和重新建立止血（Pfister等人，2023年）。因此，在这个实验中，清创后对伤口进行了彻底的冲洗和清洗。

**ASCS应用对伤口愈合的影响：时间和治疗**

在四头约克夏猪的背部区域进行了DPT烧伤处理，所有伤口都进行了清创，并在24小时后用Nexobrid?冲洗。随后立即或24小时后应用ASCS，以避免因伤口位置不同而产生的不确定性。每头猪有两处伤口未接受ASCS处理，所有伤口在第七天后都接受了杆菌肽 treatment 以预防感染。通过从伤口不同位置获取的穿刺活检（图9）和使用DISC方法评估伤口边界上的力量传递来监测所有伤口的愈合情况。确定伤口愈合进展的准确性需要多次压痕测试，但从伤口区域取活检既痛苦又具有侵入性，并干扰愈合过程。DISC技术被用来将生物力学测量与H&E染色活检的组织病理学发现相关联。还尝试了与已建立的评分系统（包括改良的温哥华疤痕评分（Wihastyoko等人，2022年）和改良的Ehrlich–Hunt评分系统（Guo等人，2020年；Liu等人，2012年）进行比较；然而，这些评分方法为主观性的，其序数结构引入了过多的变异性，无法得出明确结论。通过这种方式，我们可以展示DISC协议作为一种替代的、定量的、微创技术，允许更频繁的测量。因此，我们对伤口进行了压痕分析以确定力量传递，然后使用穿刺活检去除组织。

**讨论**

关于ASCS与清创之间的时间安排：冲洗的重要性

已经确立，ASCS疗法可以加速猪模型中的伤口愈合（Carney等人，2021年；Li等人，2025年）。这些细胞提供了多种生长因子的丰富来源，如表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、角质形成细胞生长因子（KGF）和转化生长因子β（TGF-β），这些因子可刺激上皮化、血管生成和真皮重塑。最近在猪身上的实验研究表明，ASCS可以加速再上皮化，增强血管生成，并改善胶原蛋白结构，从而形成更强且更持久的再生组织（Li等人，2025年）。

在烧伤伤口的情况下，去除坏死组织对于细胞喷雾附着在伤口床上是至关重要的。与STSG不同，STSG含有即使在次优条件下也能附着和血管化的真皮成分，而细胞悬浮液则高度依赖于干净、有活力的真皮表面进行附着、增殖和迁移。目前使用酶清创通过消化坏死物质来清洁伤口床。尽管有最近的研究（Kaita等人，2025年；Shoham等人，2024年）展示了Nexobrid?去除烧伤焦痂的有效性，但尚未获得关于ASCS应用后最佳时间的资料。由于消化组织的同一机制也可能影响细胞膜和细胞外基质（ECM）的沉积，因此清创后追加治疗的时间可能受到残留清创物质浓度的影响。因此，我们还研究了酶溶液的细胞毒性以及在使用ASCS之前需要多少稀释。

我们根据Nexobrid?在PBS中的浓度来确定细胞活力，结果显示浓度超过1%时具有显著的细胞毒性。在较低浓度（0.1-0.5%）下，Nexobrid?能有效分离细胞与其ECM，但重新接种实验表明细胞活性保持良好。这些结果表明，清创后需要彻底冲洗伤口以去除剩余的Nexobrid?溶液。否则，需要适当的延迟时间以允许吸收和重新建立止血（Pfister等人，2023年）。因此，在本实验中，清创后对伤口进行了彻底的冲洗和清洗。

**讨论**

**ASCS应用对伤口愈合的影响：时间和治疗**

在四头约克夏猪的背部区域进行了DPT烧伤处理，所有伤口都进行了清创，并在24小时后用Nexobrid?冲洗。随后立即或24小时后应用ASCS，以确保伤口位置之间的不确定性被消除。每头猪有两处伤口未接受ASCS处理，所有伤口在第七天后都接受了杆菌肽治疗以防止感染。通过从伤口不同位置获取的穿刺活检（图9）和使用DISC方法评估伤口边界上的力量传递来监测所有伤口的愈合情况。确定伤口愈合进展的准确性需要多次压痕测试，但从伤口区域取活检既痛苦又具有侵入性，并干扰愈合过程。DISC技术被用来将生物力学测量与H&E染色活检的组织病理学发现相关联。还尝试了与已建立的评分系统（包括改良的温哥华疤痕评分（Wihastyoko等人，2022年）和改良的Ehrlich–Hunt评分系统（Guo等人，2020年；Liu等人，2012年）进行比较；然而，这些评分方法为主观性的，其序数结构引入了过多的变异性，无法得出明确结论。通过这种方式，我们可以展示DISC协议作为一种替代的、定量的、微创技术，允许更频繁的测量。因此，我们对伤口进行了压痕分析以确定力量传递，然后使用穿刺活检去除组织。如图5所示，未接受ASCS处理的伤口在愈合结果上表现出较低的方差，表明动物之间的变异很小。这一点通过个体动物分析得到了进一步的支持，其中双尾t检验显示猪之间的差异并不显著（图10），从而确认愈合结果并非由个体动物效应驱动。下载：下载高分辨率图片（384KB）下载：下载全尺寸图片

图10. 第28天个体动物力传递比率分析（平均值±标准差）。在酶清除和ASCS处理后。所有接受ASCS处理的伤口，无论是立即应用还是酶清除后24小时应用，其传递比率都明显高于使用杆菌肽处理的对照组，表明组织顺应性得到了更好的恢复。对于个别猪，样本数量如下：仅使用杆菌肽，n=6个压痕（来自2个伤口）；酶清除后立即使用ASCS，n=18个压痕（来自6个伤口）；酶清除后24小时使用ASCS，n=18个压痕（来自6个伤口）。

相比之下，ASCS处理伤口中观察到的传播增加可能归因于所输送细胞剂量的变异性。不同动物之间的细胞产量存在差异，而有效的细胞覆盖范围受到喷雾流出的影响，这又取决于局部伤口床的方向。尽管存在这种变异性，ASCS处理仍然显著增强了伤口愈合效果，相比仅使用杆菌肽效果更为明显。立即应用与延迟24小时应用ASCS之间的差异不大，并未显著改变整体愈合结果。

这些发现具有重要的临床意义。鉴于ASCS已证明的好处以及与立即应用相当的生物力学恢复效果，早期治疗的优势（包括降低感染风险和简化临床工作流程）很可能超过延迟应用带来的任何边际益处。

结论

在这项DPT烧伤模型中，DISC提供了一种定量、空间分辨的生物力学恢复评估方法，补充了组织学评估，同时避免了侵入性、顺序评分系统固有的变异性。与仅使用局部抗生素治疗相比，ASCS处理显著增强了伤口愈合效果，尽管存在与细胞输送相关的伤口间差异。愈合结果在动物间是一致的，立即应用与延迟24小时应用ASCS之间的差异不大，也未显著改变整体恢复情况。这些发现支持DISC作为监测伤口愈合的可靠功能终点，并表明在充分清洗伤口后可以临床实施早期ASCS应用，而不会影响生物力学的恢复。

**方法**

**研究设计**

我们使用了4只体重约30公斤、年龄约为3个月的雌性约克夏猪。我们进行了一项前瞻性、随机、盲法的动物试验来验证研究假设。该研究得到了机构动物护理和使用委员会（IACUC2024-00034）的批准，并在动物研究部（DLAR）进行。我们的方法和结果报告遵循了《体内实验动物研究报告》（ARRIVE）文档（Percie du Sert等人，2020年）推荐的格式。

**动物处理、镇静和麻醉**

为了适应环境，动物被喂食标准猪饲料一周，并可自由饮水。我们将动物暴露在每12小时交替的明暗循环中。

禁食12小时后，动物接受了酮胺（10 mg/kg）、右美托咪定（0.03 mg/kg）和布托芬（0.2 mg/kg）的肌肉注射以诱导麻醉。一旦动物失去活动能力，通过气管插管给予2-4%的异氟烷（1.5 L/min）进行长时间手术，而对于如换药等短时间手术，则使用鼻锥。在背部腰部剪短的皮肤上放置了透皮芬太尼贴片（75 mcg/hr），并用Tegaderm（3M，圣保罗，MN）固定。烧伤诱导后，给予布普瑞诺芬（0.02 mg/kg）的肌肉注射以提供镇痛效果，直至芬太尼达到最大血浆浓度。实验程序结束后，动物接受了阿替帕美唑（0.003 mg/kg）的静脉注射以帮助恢复。

**烧伤制造**

我们之前已经描述了用于制造烧伤的猪模型（Singer和McClain，2003年）。使用一个设定在600°C的辐射热装置，在猪的脊椎两侧、前腿和后腿之间的棘旁肌肉上均匀施加了14个5x5厘米的DPT烧伤，如图11所示。在所有烧伤处，立即用组织镊子的钝端刮除坏死的上皮。然后，烧伤处涂抹了局部抗生素（杆菌肽锌，Taro Pharmaceuticals，霍桑，NY）和非粘附性敷料（Telfa，Cardinal Health，都柏林，OH）。

**酶清除**

烧伤生成大约24小时后，动物被镇静并麻醉，所有烧伤处浸泡在生理盐水中两小时。随后使用富含菠萝蛋白酶的酶制剂（NexoBrid?）处理两小时，然后在封闭性敷料下再浸泡两小时。临床剂量约为每个伤口2.2克NexoBrid?（约88 mg/cm2）。浸泡期后，用肥皂和清水彻底清洁伤口。

**酶清除剂的体外细胞毒性测试**

为了测试NexoBrid?残留物是否会对细胞造成伤害，我们从石溪大学牙医学院提取的人类智齿中分离出人间充质基质细胞，使用机构审查委员会批准的标准酶消化方案（IRB#20076778），并在含有10% FBS（Gibco，目录号：A5670701）和2% Pen-Strep（Gibco，目录号：15140122）的α-MEM培养基中培养细胞。细胞以1×10?细胞/cm2的密度接种到24孔板中，并在37°C、5% CO2条件下培养16小时。16小时培养后，吸出培养基，并用PBS（Gibco，目录号：14190250）冲洗孔洞两次，以避免血清对菠萝蛋白酶的抑制作用。然后将细胞暴露在稀释至最终浓度0.1%、0.2%、0.5%、1%、2%和10%的NexoBrid?中，PBS作为对照。培养4小时后，收集细胞并进行相位对比成像。

**ASCS制备**

使用RECELL?系统制备ASCS。使用电动皮肤切割器从每只动物身上获取2x6厘米2、厚度约为0.75毫米的皮肤样本，按照制造商的说明制备ASCS。将皮肤样本在加热的专有酶溶液（RECELL? Enzyme）中孵育15-20分钟，以破坏细胞与细胞外基质（包括真皮-表皮连接处）之间的粘附。去除酶溶液后，将皮肤样本放置在设备的无菌托盘上，测试表皮和真皮组织是否可以自由分离。如果可以分离，则用缓冲液冲洗皮肤样本，然后将皮肤样本真皮面朝下放在设备的无菌托盘上。通过剧烈刮擦真皮和表皮层完全分离皮肤细胞。将分离出的细胞悬浮在缓冲液中，过滤后吸入施用注射器中，并将其施加在清创后的伤口床上。

**伤口处理**

在每只猪中，一半伤口在完成酶清除和浸泡后立即用ASCS处理，而另一半伤口则在酶清除24小时后用ASCS处理。使用随机数表随机分配哪一侧接受细胞悬浮液处理。图11展示了每只猪的伤口位置及其相应的治疗方案。总共制造了56个DPT烧伤，其中24个在酶清除后立即用ASCS处理，24个在酶清除后24小时用ASCS处理，8个用局部抗生素作为对照。所有烧伤在四只实验动物中均匀分布。

**敷料**

在应用细胞悬浮液之前，先将Telfa? Clear Wound Dressing（Covidien，明尼阿波利斯，MN）覆盖在伤口的下缘。从最高部位开始向最低部位涂抹细胞悬浮液，以减少废液流出。每次应用的六分之一用于覆盖整个伤口表面。最后，用Telfa? Clear Wound Dressing包裹处理部位，并用皮肤钉固定。

**组织活检和组织学评估**

直到受伤后28天，每周更换敷料两到三次。每次更换敷料时都会对伤口进行观察和数字摄影。在第7天（右上）、第10天（左下）、第14天（右下）和第21天（左上），从所有烧伤处获取全厚度3毫米的活检样本（Integra，约克，PA）。此外，在受伤后第28天从所有烧伤的中心获取另一个全厚度8毫米的活检样本（图9）。

**机械皮肤顺应性评估**

为了量化愈合过程中的生物力学重塑，我们使用DISC（Digital Image Speckle Correlation）每周测量每个伤口的表面顺应性。DISC是一种非侵入性的光学方法，可以绘制出在受控机械刺激下的表面变形图。该方法包括两个关键步骤：（1）施加标准机械力以变形伤口表面；（2）光学跟踪由此产生的变形以生成全场位移图。DISC技术利用皮肤本身的纹理特性，包括毛孔和细微表面特征，作为天然的斑点标记，从而无需使用侵入性探针或活检。图2a展示了该技术应用于测量猪伤口愈合情况的示意图。在动物处于麻醉状态时，使用一种柔软且尖端平坦的探针对手动地在伤口部位施加一个温和且标准化的压痕。压痕位于伤口边缘附近，以诱导伤口部位及周围完整组织的变形。配备至少400万像素相机的设备垂直于伤口表面放置，并手动对准目标区域进行拍摄。每次压痕操作会分析两张图像：一张是在压痕前的未变形参考图像，另一张是在压痕达到最大程度时的变形图像，整个过程中照明条件保持不变，相机位置和焦距也固定不变。DISC分析是通过一个自定义的基于Python的图像处理流程来进行的（Fu等人，2025年）。位移场是通过光流算法从配对的未变形和变形图像中计算得出的。光流是一种计算机视觉算法，它通过估计未变形参考图像与在机械刺激下获得的变形图像之间的像素级位移来量化表面变形。对于参考图像中位于(x,y)位置的像素，定义一个以该像素为中心的正方形邻域N(x,y)。这个子集会与变形图像中相同大小的候选邻域N(x′,y′)进行比较，计算归一化的交叉相关相似度函数Sx,y(x′,y′) = ∑(x?,y?)∈N(x,y)I(x?,y?)I(x?′,y?′) / ∑(x?,y?)∈N(x,y)I2(x?,y?)∑(x?′,y?′)∈N(x′,y′)I2(x?′,y?′)，其中I表示灰度强度。使Sx,y最大化的坐标(x′,y′)对应于原始像素最可能的位移位置。因此，每个像素的位移向量u(x,y) = (x′-x,y′-y)被计算出来，从而在整个图像上形成一张密集的位移场（Saadon等人，2023年）。在本研究中，使用了Lucas–Kanade方法来计算位移，该方法假设在局部邻域内位移很小且大致恒定，并通过强制亮度恒定性将空间和时间图像梯度与像素运动关联起来，非常适合捕捉微妙的平面内表面位移，生成一组描述位移大小和方向的向量。位移向量场（图12a）以热图的形式显示在原始照片图像（图12b）上。位移较大的区域对应于更柔软、更具柔韧性的组织，而位移较小的区域则反映了更大的刚性或机械不连续性。

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图12. 皮肤中压痕引起的位移和力传播的定量DISC分析。
(a) 压痕后皮肤位移产生的矢量场。
(b) 对应于压痕产生的矢量幅度的热图。实线白色轮廓表示最大幅度的1/e。
(c) 通过(b)中紫色虚线所标示平面的3D空间分布幅度图。
(d) 由点状紫色线所标示截面的2D剖面图。黑色线表示最大幅度的1/e。
(e) 健康皮肤上压痕产生的总热图，其中叠加了伤口区域。

在图12c中，我们绘制了位移幅度作为沿轨迹径向距离的函数。将位移幅度超过峰值位移1/e的区域定义为活性变形区域，这一阈值的选择是为了在保留机械意义上的传播的同时抑制背景噪声。图12d展示了力量衰减到最大幅度1/e的点轨迹。力传播比率（R）是活性传播伤口面积所占的比例，该比例相对于未受伤皮肤的等效面积进行了归一化，后者定义为100%。R值的增加表明伤口组织的机械连续性和功能恢复的情况。

自然皮肤毛孔作为斑点标记，基于光流的跟踪技术可以估计标准化机械输入前后图像之间的像素级位移。由于猪皮通常与下面的肌肉紧密相连，我们通过在伤口边缘附近施加受控的外部压痕来标准化刺激，一般距离伤口边缘5毫米以内。通过连接数字压力表的探针施加4牛顿（N）的力，从而在伤口内部和周围产生变形区域。高分辨率相机在每次刺激过程中在恒定照明下记录皮肤表面。处理前后图像对以计算位移场和相应的热图。在每个时间点，同一伤口周围区域内的三个不同位置进行三次压痕操作，每次压痕之间有超过1分钟的恢复时间。然后独立分析每次压痕的力传播比率（R值），并将这些值平均后以平均值±标准差的形式报告出来。

在完整的皮肤中，表皮、真皮和皮下层作为一个连续结构传递负荷；损伤会破坏这种连续性，限制变形的传播范围。因此，较大的局部位移表明组织更柔软、更具柔韧性，更接近未受伤的状态；而较小的位移则表明组织更僵硬，如疤痕。这些空间图提供了组织整合和随时间功能恢复的非侵入性定量读数。计算分析使用了Python 12.1和光流算法。

**统计分析**
分析在GraphPad Prism（v10）软件中进行。对于具有分组和独立观察结果的情况（无配对），我们使用了单因素Welch方差分析，并结合Brown–Forsythe检验来处理可能的异方差性（标准差不等）。当全组检验具有显著性时，所有成对比较均采用Dunnett’s T3多重比较程序进行，该程序不假设方差相等。统计显著性定义为p < 0.05（*），p < 0.01（**），p < 0.001（***），p < 0.0001（****）；ns表示无显著性。

**未引用参考文献**
国家研究委员会。