基于基因组的物种划分揭示了希腊一种Chorthippus（直翅目：蝗科）蝗虫群中的隐秘多样性和半通透的物种边界

《Systematic Entomology》：Genomic-based species delimitation reveals cryptic diversity and semi-permeable species boundaries in a Chorthippus (Orthoptera: Acrididae) grasshopper complex from Greece

　　**摘要**

最近的更新世辐射事件常常产生隐秘的物种多样性和半渗透的物种边界，这给物种界定和进化历史的重建带来了挑战。在本文中，我们利用全基因组ddRAD-seq数据结合几何形态测量学，研究了希腊Chorthippus蝗虫物种复合体中的这些现象。系统基因组分析表明，物种多样化发生在中更新世，并识别出两个主要的地缘分支，它们被科林斯湾分隔开，随后在伯罗奔尼撒半岛内部发生了更细微的分化。尽管最近发生了分化，但大多数类群形成了支持良好的、互为单系的谱系，尽管某些边缘种群的迹象显示了历史上杂交的痕迹，揭示了由二次接触形成的半渗透物种边界。基因渗入在地理上是受限制的，并且具有强烈的不对称性，主要从长翅类群向短翅类群发生，这与扩散能力的差异一致。物种界定分析在很大程度上支持当前的分类系统，但也识别出三个先前未被认识到的进化谱系，这些谱系对应于地理上受限的种群，揭示了额外的隐秘多样性。形态学分析显示，在不同谱系之间与体型相关的特征存在显著的停滞，其中翅长成为主要的区分轴。系统发育重建表明，翅大小的多次独立减小突显了向减少扩散能力进化的转变。在至少一个谱系中，翅长的显著地理梯度与浅层系统发育结构相对应，支持了扩散能力发生的初步进化转变，而不是表型可塑性。混合种群一致地保留了短翅表型，这表明尽管发生了基因渗入，但对扩散相关特征的选择仍然强烈。总体而言，我们的结果展示了地形复杂性、更新世气候变化以及与扩散相关的形态如何相互作用，以塑造地中海生物多样性热点地区的物种多样性和维持谱系的完整性。

**引言**

隐秘物种和半渗透的物种边界越来越多地被认为是近期多样化的普遍结果（Bickford等人，2007年；Seehausen，2004年）。在某些情况下，尽管表型差异很小，遗传不连续性可能很明显；而在其他情况下，二次接触和不同程度的基因渗入可能会模糊分类界限，从而挑战物种界定（Barton & Hewitt，1985年；Harrison & Larson，2014年）。这种情况通常发生在更新世期间起源的物种复合体中，那里的形态在强烈的功能限制下进化，而生殖隔离往往不完整（例如，Ortego & Knowles，2022年）。导致这种复杂进化场景的一个主要因素是第四纪的气候波动，它深刻地影响了温带生物群的空间分布和遗传组成（Hewitt，1996年，2000年）。这些周期通过将种群压缩到冰川或间冰川避难所中反复导致种群破碎（Bennett & Provan，2008年；Carstens & Knowles，2007年），引发了遗传分化，并使种群在隔离状态下暴露于不同的选择机制中，从而促进了分化和物种形成（Stewart等人，2010年）。相反，范围扩张和海拔或纬度的变化反复使谱系接触，为基因流提供了机会（Knowles & Massatti，2017年；Maier等人，2019年；Tonzo & Ortego，2021年）。如果刚开始分化的谱系之间的生殖屏障较弱，二次接触可能导致基因渗入杂交、谱系融合，甚至物种逆转（Mallet等人，2016年；Nevado等人，2018年）。因此，更新世的气候动态被认为既起到了“物种泵”的作用，也起到了“熔炉”的作用，促进了物种形成连续体不同阶段的分化和基因流（April等人，2013年；Ebdon等人，2021年；Haffer，1969年；Hewitt，2000年）。结果，最近分化类群的系统发育关系往往由于谱系分类不完全（Maddison & Knowles，2006年）和网状进化而变得模糊，这挑战了物种界定和进化历史的重建（Degnan & Rosenberg，2009年；Payseur & Rieseberg，2016年）。阐明在这些条件下谱系如何持续存在和多样化是一个对于进化生物学至关重要的问题（Coyne & Orr，2004年；Nosil，2008年），需要结合基因组、表型和生态数据的综合性框架。直翅目昆虫包括许多物种复合体，其中最近的分化、杂交和有限的表型分化导致了重大的分类不确定性，使它们成为测试复杂物种界定情景和研究物种形成背后的进化、生态和地质过程的理想模型系统（例如，Hawlitschek等人，2022年；Huang等人，2020年；Le Flanchec等人，2026年；Ortego & Noguerales，2025年；Schmidt等人，2024年）。大多数直翅目昆虫的有限扩散能力和它们的生态特化通常促进了强烈的种群分化（Chapco & Litzenberger，2002年；Mason等人，1995年），而声学和形态特征提供了不同的区分轴（Neumeister等人，2025年；Noguerales等人，2018年；Vedenina等人，2024年；Willemse等人，2009年）。然而，在密切相关的物种复合体内，大多数形态特征表现出强烈的停滞，翼发育的变化是一个显著的例外。翅多态性和多态性，以及频繁向减少扩散能力进化的转变（例如，从长翅型到短翅型）（Harrison，1980年；Roff，1990年，1994年；Zera & Denno，1997年），反复导致了直翅目中的分类不确定性（例如，Ortego等人，2021年）。与其他许多生物一样，在岛屿系统和高山-阿尔卑斯环境中生活的类群中，翅大小的减少和向不能飞行能力的转变特别常见（Ikeda等人，2012年；Wright等人，2016年）。这种扩散能力的差异具有重要的微进化和种群动态后果，并与不同的地理多样化速率（Ortego等人，2021年；Suárez等人，2022年）、不对称的基因渗入（Dussex等人，2016年；Ortego等人，2021年；Ortego & Knowles，2022年）以及范围扩张（Hochkirch & Damerau，2009年）有关。总的来说，这种明显的遗传结构、低迁移能力和保守的形态特征的结合使得蝗虫的近期辐射成为研究隐秘物种形成和半渗透物种边界的优秀模型系统，并有助于阐明驱动物种形成过程的机制。在这里，我们关注分布于希腊南部的Chorthippus Fieber属蝗虫复合体，该复合体包括几个表型分化有限的异地类群，代表了一个典型的近期多样化案例。这个复合体包含了具有高度受限分布的微特有谱系马赛克，包括一个伊奥尼亚岛屿特有的C. sangiorgii（Finot）和三个在伯罗奔尼撒半岛南部具有相邻异地分布的类群——C. moreanus Willemse, Helversen & Odé, C. parnon Willemse, Helversen & Odé和C. crassiceps（Ramme）。只有一个推测的物种C. pulloides Ramme表现出更广泛的分布，从品都斯山脉到伯罗奔尼撒半岛，其中许多种群与其他三个在该地区存在的类群非常接近。尽管一些研究强调了不同推测物种的声学独特性，但所有类群都表现出明显的形态相似性，除了类群之间和某些种群在前翅发育程度上的差异（Ramme，1926年，1927年；Willemse，1984年，1985年，1986年；Willemse等人，2009年）。因此，由于它们显示出中间或非典型的表型，一些种群仍然难以分类（Willemse等人，2009年），这表明了杂交和基因渗入的历史（例如，Ortego等人，2026年）。事实上，该复合体内几个窄范围特有物种目前被IUCN红色名录列为“近危”（Hochkirch等人，2016年），这强调了阐明它们进化独立性的保护重要性。总的来说，这种受限范围和主要是异地分布的组合，加上微妙的形态和生态差异，说明了当无法在接触区域评估候选物种之间的生殖隔离时，测试分类假说的长期困难（Coyne & Orr，2004年；Mayr，1963年）。在这种情况下，全面的分类和种群采样，结合基因组和形态数据的综合分析，可以提供关于生殖隔离程度和推测物种的进化独立性的关键见解，并为物种界定提供可靠的基准（Coyne & Orr，1989年；Dynesius & Jansson，2014年）。在本研究中，我们结合了细尺度的种群采样、全基因组数据（ddRAD-seq）和几何及线性形态测量分析来界定物种，并研究焦点复合体内的分化后基因流模式。具体来说，我们解决了三个主要目标及其相关假设。首先，（i）我们重建系统发育关系，并在系统发育和基因型聚类物种概念下评估物种边界（De Queiroz，2007），测试尽管形态分化有限，但地理分布狭窄的异地类群代表进化上独立谱系的假设。我们预测基因组数据将恢复与描述类群相符的、得到良好支持的谱系，同时揭示出模糊系统发育分辨率的浅层分化或混合案例。其次，（ii）我们应用基于共祖的人口统计建模来评估在聚类分析中被识别为混合的种群中的二次接触的程度、方向和时机，测试更新世驱动的范围变化促进了部分隔离谱系之间反复的二次接触，导致地理上受限的谱系融合过程的假设。最后，我们（iii）整合基因组和形态测量分析来评估不同数据源在界定物种边界方面的一致性，以测试在整个复合体的进化历史中是否多次发生了向短翅型的转变，并评估杂交对表型变异的贡献程度。我们假设翅大小的减小和扩散能力的减少与种群分化和生境斑块隔离多次相关联（Harrison，1980年；Roff，1990年，1994年），并且基因渗入在局部塑造了形态变异，但没有完全侵蚀物种边界。通过结合基因组和形态数据与物种界定和人口统计推断，我们的研究提供了一个精细和综合的框架，用于区分近期分化与基因流，并理解地中海生物多样性热点地区内触发分化的直接过程。

**材料与方法**

**分类和种群采样**

在2021年和2023年的夏季，我们采样了34个种群，这些种群涵盖了希腊中部和南部Chorthippus属所有类群的整个范围，特别关注伯罗奔尼撒地区（表1）。该复合体包括大陆类群C. pulloides、C. moreanus、C. parnon和C. crassiceps，以及伊奥尼亚岛屿特有的C. sangiorgii。虽然C. pulloides和C. sangiorgii是短翅的，但C. moreanus、C. parnon和C. crassiceps是长翅的，前翅可以达到或超过后膝盖（Willemse等人，2009年）。采样旨在最大化对该复合体的地理和表型变异的覆盖范围，并包括分类状态不确定的种群（Willemse等人，2009年）。我们的目标是每个种群至少收集八只成虫个体。然而，在某些地点，只有在采样过程中发现了一些成年雄虫或主要是若虫。由于未成熟个体的翅膀尚未完全发育，这些限制仅影响了形态测量分析。对于基因组分析，我们确保每个种群至少有八只个体，必要时包括若虫（表1）。空间坐标使用全球定位系统（GPS）记录，整个标本在-20°C下保存在1500 μL的100%乙醇中，直到需要用于基因组和形态分析。所有样本都是在希腊环境和能源部的许可下获得的（许可证编号YPEN/DDD/34736/1134和YPEN/DDD/32363/1054）。有关采样类群和种群的更多详细信息见表1。

**表1. 希腊Chorthippus物种复合体的地理位置，包括其在物种界定（推测物种）之前和之后的分类状态（见物种界定分析）和遗传混合（种群遗传结构）分析。**

| 推测物种 | 划定物种 | 种群 | 代码 | 纬度 | 经度 | 海拔 | n（个体） | n（形态） |
|-------------------|-------------------|-----------------|-------------------|--------------|-----------------|---------------------|
| C. sangiorgii | C. sangiorgii | Lefkada Island—Marantochori | MARA | 38.638862 | 20.675340 | 200 | 8 |
| C. sangiorgii | Cephalonia Island—Chavdataa | CHAV | 38.194927 | 20.372910 | 190 | 8 |
| C. pulloides | DelineatedSp001 | Mt. Kakarditsa | KAKA | 39.544839 | 21.18708 | 1860 | 8 |
| C. pulloides | DelineatedSp002 | Mt. Akarnanika | AKAR | 38.834396 | 20.982888 | 910 | 8 |
| C. pulloides | Mt. Panachaiko | PANA | 38.207062 | 21.868688 | 1730 | 8 |
| C. pulloides | Agia Triada | TRIA | 37.847903 | 21.653582 | 490 | 8 |
| C. pulloides | Mt. Erymanthos | ERYM | 37.951604 | 21.793806 | 1990 | 8 |
| C. pulloides | Metochi | METO | 38.003929 | 21.934568 | 880 | 8 |
| C. pulloides | Mt. Chelmosa | CHEL | 37.975511 | 22.202851 | 2260 | 10 |
| C. pulloides | Mt. Kyllini | KYLL | 37.939056 | 22.396115 | 2350 | 8 |
| 混合种 | Mt. Maenalon | MAEN | 37.644274 | 22.276261 | 1840 | 8 |
| 混合种 | Krioneri | KRIO | 37.576332 | 22.551306 | 830 | 7 |
| 混合种 | Agios Petros | PETR | 37.332440 | 22.557441 | 880 | 8 |
| 混合种 | Mt. Parnon | PARN | 37.281016 | 22.612383 | 1870 | 8 |
| 混合种 | ... | ... | ... | ... | ... | ... |泰盖特斯-波特尔斯（Taygetus—Portes）

TAYP

36.957716

22.351548

2240

8

5




C. moreanus

C. moreanus

斯滕尼察（Stemnitsa）

STEM

37.535469

22.089126

1050

8

1




C. moreanus

巴撒埃亚（Bassaea）

BASS

37.429405

21.899759

1120

10

5




C. moreanus

皮洛斯（Pylos）

PYLO

36.884127

21.696716

450

8

4




C. moreanus

内杜萨（Nedousa）

NEDO

37.134629

22.229493

920

8

5




杂交种群

泰盖特斯-EOS卡塔菲吉奥（Taygetus—EOS Katafygio）

TAYK

36.950079

22.367255

1560

8

5




C. moreanus

特纳罗角（Cape Tenaro）

TENA

36.400436

22.485514

10

8

5




杂交种群

波利德罗索（Polidroso）

POLI

37.141440

22.613072

1030

8

5



C. parnon

克雷马斯蒂亚（Kremastia）

KREM

36.959406

22.870150
ftype
790

8

5




C. parnon

阿尔盖泰卡（Argiteika）

ARGE

36.614777

23.002187
460

10

5




C. parnon

马莱亚斯角（Cape Maleas）

MALE

36.438923

23.173909
榕
60

8

5




DelineatedSp003

基西拉岛-波塔莫斯（Kythira Island—Potamos）

POTA

36.304524

22.976823
榕 homemade
310

8



C. crassiceps

索菲科（Sofiko）

37.800653
榕 homemade
23.038608
榕 homemade
440


C. crassiceps

阿拉克尼奥（Arachneo）

ARAC
榕 homemade
37.66534
榕 homemade
650


C. crassiceps

帕莱亚埃皮达夫罗斯（Palaia Epidavros）

EPID
榕 homemade
37.647412
榕 homemade
130


C. crassiceps

梅塔纳（Methanaa）
榕 homemade
METH
榕 homemade
37.627264
榕 homemade
310


C. crassiceps

迪迪莫山（Mt. Didymo）
榕 homemade
DIDY
榕 homemade
1040



注意：杂交种群未纳入物种界定分析（参见系统基因组推断）。aType地点或地理上最接近每个分类单元对应模式地点的采样点。n（gen.）=基因型个体数量；n（morp.）=用于几何形态测量分析的个体数量。基因组文库制备和基因组数据处理



我们使用NucleoSpin Tissue试剂盒（Macherey-Nagel，德国杜伦）从每个样本中提取并纯化了DNA。我们按照Peterson等人（2012年）描述的双酶切限制性片段技术（ddRAD-seq）将DNA处理成不同的基因组文库，并在方法S1中进行了详细说明。原始序列通过stacks v. 2.66（Rochette等人，2019年）进行解复用和预处理，然后使用ipyrad v. 0.9.93（Eaton & Overcast，2020年）进行组装。方法S2提供了有关序列数据过滤和组装的所有详细信息。系统基因组推断


我们使用两种独立的分析方法重建了研究复合体种群之间的系统发育关系：在raxml v. 8.2.12中实现的最大似然（ML）方法和在bpp v. 4.7.0中实现的多物种联合进化方法（分析A01；Flouri等人，2018年）。为了避免杂交对系统发育推断和物种界定的干扰（Chan等人，2023年；参见物种界定分析），我们从结构分析中识别出的混血种群中排除了它们（参见种群遗传结构和混合以及种群遗传结构）。为了减少计算需求，我们对每个种群只包括了数据缺失比例最低的单一代表性个体，用于系统基因组分析。



raxml

我们使用在r v. 4.4.0（R Core Team，2021年）软件包‘phrynomics’（B. Banbury，http://github.com/bbanbury/phrynomics）中编辑的SNP连接矩阵（每个位点的所有SNP；来自ipyrad的.snp文件）运行了raxml。作为外群，在raxml分析中使用了属于同一亚属（Glypthobothrus）的C. willemsei Harz的五个个体（Cigliano等人，2025年）。输入数据集包含15,455个SNP。我们应用了条件似然方法（Lewis，2001年）进行了确定性偏差校正，使用了GTR-GAMMA核苷酸进化模型，进行了100次快速自助法复制，并搜索了得分最高的最大似然树。为了探索混血种群的系统发育位置，我们对包含所有采样种群的数据集（即不包括混血种群）进行了额外的raxml分析（19,661个SNP）。



bpp

我们使用来自ipyrad的完整的ddRAD-seq位点（.loci文件）在bpp（Flouri等人，2018年）中运行了树估计A01分析。.loci文件经过编辑后，使用自定义的r脚本（J. Ortego，https://github.com/OrtegoLab/ipyrad2bpp）转换为bpp输入文件。由于bpp分析的计算要求很高，我们将数据集限制在1000个位点。我们设置了均匀的根树作为物种树先验，应用了自动调整的微调参数，设置了二倍体选项以指示输入序列是未分相的，并根据基于每个位点分离位点数量的经验估计调整了逆伽马分布的θ（α = 3，β = 0.04）和??（α = 3，β = 0.07）先验（Huang等人，2020年）。注意，bpp分析不需要定义外群，因为该程序会同时采样树的根位置和其他节点。我们进行了两次独立的重复分析，每20代采样一次，经过20,000代的燃烧期后进行。推断分歧时间


使用raxml和bpp推断的系统发育树（参见系统基因组推断）被作为固定拓扑结构在bpp的A00分析中拟合，以估计种群间的分歧时间后验分布（τ；Rannala & Yang，2003年；Flouri等人，2018年）。我们使用与bpp中树推断A01分析相同的数据集和设置进行了分析。为了确保运行的收敛（ESS > 200），我们进行了两次独立的重复分析，每20代采样一次，经过100,000代的燃烧期后进行。我们使用公式?? = 2??t估计了分歧时间，其中??是bpp估计的每个位点的分歧替换次数，??是每代的突变率，t是以年为单位绝对分歧时间（Walsh，2001年）。我们考虑了Drosophila melanogaster的每代每个位点的突变率为2.8 × 10^-9（Keightley等人，2014年），这与Heliconius melpomene蝴蝶的估计突变率（2.9 × 10^-9；Keightley等人，2015年）相似。物种界定分析


我们使用delineate v. 1.2.3程序进行了受限的、分区的物种界定分析，该方法在多种群联合进化框架内结合了明确的物种形成模型，以识别代表不同物种的谱系集合（Sukumaran等人，2021年）。基于数据集中部分种群的人群水平超度量系统发育和物种分配的先验知识，delineate估计剩余种群是属于已描述的物种还是代表与独立物种一致的进化谱系（Sukumaran等人，2021年）。我们使用从A00分析中获得的超度量树（参见分歧时间估计）进行了delineate分析，并考虑了使用raxml和bpp分析A01推断的略有不同的拓扑结构，以及一个物种分配参考文件，该文件指示每个种群是对应于已知的名义物种（status = 1）还是未知的物种身份（status = 0）。我们根据命名法的优先级和当前对群体的分类学理解，以及从系统发育中推断出的种群谱系之间的进化关系，进行了状态分配（Sukumaran等人，2021年）。具体来说，我们根据分类学文献和Orthoptera Species File（https://orthoptera.speciesfile.org/；Cigliano等人，2025年；Willemse等人，2009年；参见表1）中的物种分布信息，将种群分配到已知或未知的名义物种状态。在文献中被分配到C. pulloides（KAKA和AKAR，来自希腊中部）的两个种群和一个被分配到C. parnon（POTA，来自基西拉岛）的种群在它们的假定物种的模式产地所在的支系中没有聚类在一起，因此在delineate分析中被视为具有未知的物种身份（表1）。同样，两个在文献中被分配到C. crassiceps（SOFI和ARAC）的种群也被视为具有未知的物种身份，因为它们形成了一个得到了良好支持的、不同的支系，并且前翅比包含其假定物种模式产地的支系短得多（参见系统基因组推断和分歧时间估计；表1）。测试引入


我们使用基于D统计量的四类群ABBA/BABA测试来评估给定分类单元的不同种群是否经历了来自其他分类单元的遗传引入（Durand等人，2011年）。假设姐妹分类单元P1和P2从P3和一个外群物种O分化，D统计量用于测试P3和P1或P2之间没有引入的零假设（D = 0）。显著不等于零的D值表明P1和P3之间（D < 0）或P2和P3之间（D > 0）存在基因流。这些测试旨在评估一个分类单元（P3）向另一个分类单元（P1）的每个种群的引入。为此，对于P2和P3，我们使用了在结构中的贝叶斯聚类分析和详尽的D统计量测试中没有遗传引入迹象的参考种群。在所有分析中，高度分化的支系来自Kakarditsa山（KAKA；图2）被用作外群（P4）。D统计量测试专门针对涉及C. pulloides、C. moreanus和C. parnon及其分布范围相邻或部分重叠的分类单元的对进行。我们没有包括C. crassiceps在这些分析中，因为结构或探索性的D统计量测试都没有提供该分类单元参与遗传混合或引入的证据（种群遗传结构）。D统计量测试是按照ipyrad管道（Eaton & Overcast，2020年）中的实现方式运行的。


我们使用结构v. 2.3.3（Pritchard等人，2000年）程序中实现的贝叶斯马尔可夫链蒙特卡洛聚类方法来量化伯罗奔尼撒半岛上四个假定物种（C. pulloides、C. moreanus、C. parnon和C. crassiceps；表1）的种群的遗传结构和混合。在这些种群中，分类单元具有相邻的分布，并可能在当代和/或历史接触区杂交。我们在燃烧期后的100,000次迭代后，进行了200,000次MCMC迭代的结构分析，假设等位基因频率相关，并且没有使用预先的种群信息。我们对每个遗传簇的数量（K）进行了15次独立运行，K的范围从1到8，以估计最可能的遗传簇数量。我们保留了每个K值下可能性最高的10次运行。正如Gilbert等人（2012年）和Janes等人（2017年）所推荐的，我们使用了两个互补的统计量来确定最佳描述数据的K值：数据的对数概率（LnPr(X|K）；Pritchard等人，2000年）和ΔK（Evanno等人，2005年），这些统计量是在structure harvester（Earl & vonHoldt，2012年）中实现的。我们使用clumpp v. 1.1.2和Greedy算法对相同K值的重复运行进行了对齐（Jakobsson & Rosenberg，2007年），并使用distruct v. 1.1（Rosenberg，2004年）在条形图中可视化了个体的种群成员概率。分化时间和混合的时间

结构中的贝叶斯聚类分析显示，伯罗奔尼撒半岛的几个种群具有较高的混合血统比例，D统计量测试确认它们起源于C. pulloides和C. moreanus（MAEN和TAYP）、C. pulloides和C. parnon（KRIO、PETR和PARN）或C. moreanus和C. parnon（POLI）之间的历史杂交（详见结果部分）。我们使用fastsimcoal2（Excoffier等人，2021年）中实现的基于联合进化的方法来推断导致这些混合种群形成的次级接触事件的人口统计学参数，包括混合的时间和每个亲本物种贡献的血统比例。由于计算限制，我们将人口统计分析集中在三个混合种群（MAEN、PARN和TAYP）的子集上。我们专注于假设最初在隔离状态下分化，随后发生混合的模型，因为这是鉴于重点分类单元的异域分布和它们最近的分化（<0.5 Ma）的最简洁情景（见结果部分）。这种方法避免了在这样年轻的谱系中区分早期基因流和不完全谱系分化的固有难度。此外，我们的模型没有限制混合事件的时间，允许在初始分化之后的任何时间点进行基因流的推断。我们首先测试了两种不同的人口统计模型和混合模型，然后在使用最佳支持模型的情况下估计了人口统计参数及其相应的95%置信区间。两种模型包括了（i）在严格隔离状态下分化随后发生混合事件和（ii）在严格隔离状态下分化随后发生混合事件并伴有持续基因流的情景（模型A）。每个分析包括一个混合种群（MAEN、PARN或TAYP）和每个相应亲本分类单元的一个代表性非混合种群。亲本群体是从与非混合种群（即假定的纯种群）中选择的，这些非混合种群被分配到与重点混合种群相同的遗传簇中（见种群遗传结构和图3），从而得到了三个种群三元组：KYLL-MAEN-PYLO、KYLL-PARN-MALE和KYLL-TAYP-TENA。关于fastsimcoal2分析和模型选择的更多细节见方法S3。形态测量分析

我们采用了几何和线性形态测量方法来表征雄性标本前翅（翅鞘）及前胸-头部组合体型的变化，这两个特征在Chorthippus属中具有重要的分类学意义（Noguerales等人，2018年；Willemse等人，2009年）。鉴于先前的形态学研究指出，伯罗奔尼撒半岛上的某些种群表现出中间型表型，这可能反映了形态转变、物种形成初期或该地区物种间的持续或历史性杂交现象（Willemse等人，2009年），因此这种方法尤为重要。在进行几何和线性形态测量分析时，我们使用安装在Zeiss Stemi 2000立体显微镜上的Leica Flexacam C3相机拍摄了每个雄性标本的前翅、前胸-头部和后腿股节的图像。

形状变化分析

我们使用r v. 4.2.3（R核心团队，2021年）软件包中的‘StereoMorph’（Olsen & Westneat，2015年）对每张照片中的同源标志点进行了数字化处理。我们为前翅识别了12个标志点（图1a，表S1），为前胸-头部组合体识别了20个标志点（图1b，表S1）。我们利用r包‘geomorph’（Adams & Otárola-Castillo，2013年）中的广义Procrustes分析（GPA；Rohlf，1998年）来消除所有标志点配置的尺度、旋转和平移效应。为了评估有和无体型影响下的形状变化，我们对原始Procrustes坐标和经过体型校正后的Procrustes坐标分别进行了分析。体型校正是通过拟合一个Procrustes线性模型（ProcD.lm）来实现的，该模型以形状作为响应变量，以质心大小作为预测变量。该模型的残差代表了独立于体型的形状变化，用于体型校正后的分析。随后，我们对Procrustes对齐数据的协方差矩阵进行了主成分分析（PCA），以确定个体间的主要形状变化轴，并总结了这两个特征的形态变化模式。我们使用r包‘geomorph’中的ProcD.lm函数进行了Procrustes方差分析（ANOVA；Anderson，2001年），以评估不同物种和种群之间的形状差异。最后，我们使用r包‘rrpp’中的pairwise函数，通过非参数随机残差排列程序（Collyer & Adams，2018年）计算了物种和种群之间的距离及其对应的经验p值。由于在两个地点的采样量有限（KRIO：n=2；STEM：n=1；表1），这些种群被排除在种群水平比较之外，但在PCA中保留下来，以便可视化它们与其他种群的亲缘关系。

用于表征希腊Chorthippus物种复合体中雄性个体（a）前翅和（b）前胸-头部组合体的标志点。标志点的完整描述见表S1。插图由Marina Trillo绘制。

相对翅大小分析

我们通过计算前翅长度与前腿长度的比率（FWL/FL）来评估翅大小的变化。这一特征在分类学和生态学研究中被广泛用作相对翅发育和潜在扩散能力的代理指标（Noguerales等人，2018年；Noguerales & Ortego，2022年）。线性距离是通过r包‘geomorph’（Anderson，2001年）中的interlmkdist函数从数字化的标志点坐标中提取的。前翅长度是在标志点1和12之间测量的（图1a，表S1）。我们使用前腿长度作为整体体型的代理指标，因为它与蝗虫的结构体长有很强的相关性（García-Navas等人，2017b；Ortego等人，2012年）。使用ANOVA和事后Tukey检验比较了不同种群之间的FWL/FL比率。为了可视化不同物种和种群之间FWL/FL比率的分布和重叠情况，我们使用r包‘ggplot2’生成了密度脊图。

基因组数据集

经过不同的质量控制步骤后，每个个体保留的平均读取量为3,128,441条（范围=858,283–6,270,222）。用于所有后续分析的不同基因组数据的属性在表S2中呈现。所有数据集已存储在Figshare上（https://doi.org/10.6084/m9.figshare.31136593；Ortego & Trillo，2026）。

系统发育推断和分化时间估计

使用bpp和raxml进行的系统发育重建得出了相似的拓扑关系，仅在一些最近分化的C. parnon种群上存在轻微差异（图2和S1）。系统发育分析显示，来自Kakarditsa山（KAKA）的C. pulloides种群构成了一个高度分化的谱系，它是该复合体内所有其他物种和种群的姐妹群。后者又分为两个主要亚群：一个包括来自Akarnanika山（AKAR）的C. pulloides种群和两个爱奥尼亚群岛特有物种C. sangiorgii的姐妹谱系（MARA和CHAV），以下称为中央希腊-爱奥尼亚群岛亚群；另一个包括伯罗奔尼撒半岛的所有种群和物种，以及来自邻近Kythira岛（POTA）的C. parnon种群，以下称为伯罗奔尼撒-基西拉岛亚群。在伯罗奔尼撒-基西拉岛亚群内，来自伯罗奔尼撒北部所有C. pulloides种群形成了一个单系群，它是包含该组其余种群的姐妹群。后者又包含C. moreanus，后者又是包含C. parnon和C. crassiceps的姐妹群。所有C. moreanus和C. crassiceps的种群形成了互为单系群。然而，来自Kythira岛（POTA）的C. parnon种群是与C. crassiceps和其余C. parnon种群姐妹群的姐妹群，这使得C. parnon成为并系群（图2和S1）。总体而言，bpp推断出的树中节点的支持度很高（贝叶斯后验概率>0.99），在C. moreanus、C. parnon和C. crassiceps内部的某些浅层次分化中支持度较低（图2）。raxml推断出的树中大多数节点的支持度也很高（自助法支持度>94%），除了分隔中央希腊-爱奥尼亚群岛亚群和伯罗奔尼撒-基西拉岛亚群以及C. sangiorgii与Kakarditsa山（AKAR）的C. pulloides谱系的节点。在包括所有种群的raxml树中（即不包括混血种群），假定的混血种群在其各自的亚群中占据基部位置，这在包含混血种群的系统发育分析中是预期之中的（图S3）。

使用bpp（分析A01和A00）估计的希腊Chorthippus物种复合体分析种群的系统发育树和分化时间。通过结构分析识别出的混血种群（K=6，在图3b中用星号标记）被排除在系统基因组学分析之外（见检测引进和种群遗传结构）。用bpp估计的贝叶斯后验概率在节点处用*表示（*>0.95）。节点上的条形表示95%的最高后验密度（HPD）的分化时间，基于每站点每代2.8×10^9的基因突变率和一年的世代时间进行估计。分支颜色对应于根据结构分析为每个种群分配的主要遗传簇（见图3b），背景颜色表示第四纪的地质划分。种群在物种界定分析前的（输入；？=未知）和后的（输出）分类学状态在右侧显示；界定使用了.pageset的贝叶斯后验概率以及一部分种群的先前物种分配来评估剩余种群是否属于先前描述的物种或代表不同的谱系。种群代码如表1中所述。插图显示了短翅C. pulloides的雄性（插图由Marina Trillo绘制）。

分子年代测定分析表明，所有谱系和假定物种在中更新世时期分化（Chibanian阶段，0.71–0.18 Ma BP；图2）。最早的分化发生在Kakarditsa山（KAKA）的C. pulloides谱系与其他物种和种群的分裂（约0.71 Ma BP），其次是中央希腊-爱奥尼亚群岛亚群和伯罗奔尼撒-基西拉岛亚群的分化（0.35 Ma BP；图2）。爱奥尼亚群岛特有物种C. sangiorgii大约在0.3 Ma BP时从Kakarditsa山（AKAR）的C. pulloides谱系分化出来，而伯罗奔尼撒-基西拉岛亚群内的所有谱系和假定物种则更近期分化，大约在0.28至0.18 Ma BP之间（图2）。

物种界定分析在del Lineate中识别出三个先前未被识别的物种。最初被归类为C. pulloides（KAKA和AKAR）的两个种群以及来自Kythira岛（POTA）的种群，被推断为代表不同的进化谱系，相当于独立的物种（DelineatedSp001、DelineatedSp002和DelineatedSp003）（图2和S1，表1）。所有剩余种群都被分配到它们的名义物种，包括C. crassiceps，它们形成了一个得到充分支持的单系群。使用bpp（图2）和raxml（图S2）得到的略有不同的拓扑结构，物种界限推断结果是一致的。

检测引入

D统计量测试显示了显著的遗传引入：（i）从C. moreanus引入C. pulloides的Maenalon山（MAEN）和Taygetus山（TAYP）种群；（ii）从C. parnon引入其分布边界附近的几个C. pulloides种群（KRIO、PETR和PARN）；以及（iii）从C. parnon引入Polidroso（POLI）的C. moreanus种群（表S3）。尽管结构分析表明Taygetus山（TAYK）的C. moreanus种群显示出与C. parnon的遗传混合迹象（见种群遗传结构），但D统计量测试未检测到这一种群的显著遗传引入（表S3）。

结构分析包括所有种群和物种，显示ΔK在K=2时达到峰值，并在K=6时出现第二个峰值，而LnPr(X|K)在K=6–7时趋于稳定（图S4）。对于K=2–5推断的遗传簇与系统基因组学分析和当前的物种分类分配不一致（见图S5），这可能反映了跨物种和谱系的采样不均衡（Puechmaille，2016）和/或当来自大型数据集且具有复杂进化历史的个体被强制纳入太少簇时，structure恢复高级关系的能力有限（Funk等人，2020；Kalinowski，2011；例如，Ortego等人，2025）。从K=5到K=7，结构分析显示了物种和谱系在种群内的分层分裂，这与系统基因组学推断大体一致（图2和3）。在K=6时，structure在C. pulloides中识别出两个遗传簇（深红色和浅红色），在C. moreanus中识别出两个簇（深蓝色和浅蓝色），以及分别对应于C. parnon（棕色）和C. crassiceps（橙色）的单个簇。几个群体在遗传上表现出高度同质性和凝聚力，特别是C. crassiceps（SOFI、EPID、ARAC、METH和DIDY）以及C. parnon的东南部种群（KREM、ARGE和MALE）。

（a）希腊Chorthippus物种复合体研究种群的地理分布；（a, b）基于结构对伯罗奔尼撒半岛内种群进行遗传分配的结果。（a）地图上的饼图显示了伯罗奔尼撒半岛内基因分型种群的地理位置及其在K=6时的相应遗传分配。（b）在条形图中，每个个体由一个垂直条形表示，条形分成K种颜色段，显示个体属于该颜色簇的概率；细垂直黑线分隔来自不同种群的个体。带有星号的种群表示通过结构分析识别出的混血种群，并被排除在系统基因组学分析之外（见物种界定分析）。种群代码如表1中描述。相比之下，伯罗奔尼撒中部和南部的许多种群显示出明显的遗传簇间混合迹象，这与它们靠近物种分布边界的位置一致（即历史接触区；图3a）。最显著的案例涉及伯罗奔尼撒中部和南部的C. pulloides种群，它们与C. moreanus（MAEN和TAYP）和C. parnon（KRIO、PETR和PARN）有不同程度的混合。Maenalon山（MAEN）的假定C. pulloides种群的约25%的推断祖先来自C. moreanus的西部谱系。同样，Taygetus山（TAYP）的假定C. pulloides种群的约70%的推断祖先来自C. moreanus的东部谱系。Parnon山（PARN）及其周边地区的C. pulloides种群的20%至50%的祖先来自C. parnon。最后，位于Taygetos山（TAYK）和Parnon山（POLI）脚下的C. moreanus种群分别有约5%和32%的遗传引入来自C. parnon。导致杂种群体形成的混合事件发生得相当晚，时间范围从大约84千年前的PARN（95%置信区间：83–91千年）到大约103千年前的MAEN（95%置信区间：100–107千年），除了TAYP，其混合事件要早得多，可以追溯到大约253千年（95%置信区间：232–249千年）（表3）。在三个群体中，杂种群体中源自C. pulloides的遗传比例始终高于其他亲本物种，比例从PARN的69.1%（95%置信区间：67.8–69.2%）到TAYP的84.3%（95%置信区间：82.6–84.2%不等），而MAEN的比例介于两者之间，为78.0%（95%置信区间：77.5–78.6%）（表3）。

表2. 使用fastsimcoal2对三个群体三元组（包括杂种群体MAEN、PARN、TAYP）及其亲本物种C. pulloides（KYLL）和C. moreanus（PYLO、TENA）或C. parnon（MALE）的代表性群体进行了分歧和混合模型测试。

模型
k
KYLL-MAEN-PYLO（704个SNP）
KYLL-PARN-MALE（625个SNP）
KYLL-TAYP-TENA（466个SNP）

lnL
AIC
ΔAIC
ωi
lnL
AIC
ΔAIC
ωi
lnL
AIC
ΔAIC
ωi

模型A
8
-1129.71
2275.41
0.00
0.00
-1015.09
2046.18
0.00
0.00
?720.31
1456.61
0.00
0.00

模型B
12
?1126.80
2277.61
2.19
0.00
?1012.00
2047.99
1.81
0.00
?717.45
1458.90
2.28
0.00

注：模型包括在严格隔离后发生混合事件（模型A），以及在严格隔离后发生混合事件并伴随当代基因流（模型B）的分歧情景（见图S1）。群体代码如表1所述。最佳支持的情景用粗体标出。用于计算位点频率谱的保留的可变单核苷酸多态性（SNP）数量用括号表示。缩写说明：ΔAIC，与最强模型的AIC值之差；AIC，Akaike信息量准则值；k，模型中的参数数量；lnL，模型的最大似然值；ωi，AIC权重。

表3. 使用fastsimcoal2在三个群体三元组（包括杂种群体MAEN、PARN、TAYP）及其亲本物种C. pulloides（KYLL）和C. moreanus（PYLO、TENA）或C. parnon（MALE）的最支持的分歧和混合情景下，通过共祖模拟推断出的参数。

参数
点估计值
下限
上限
点估计值
下限
上限

θANC
284,977
244,302
270,144
252,274
222,751
249,655
569,690
448,498
490,887

θANC-KYLL
350,405
250,332
299,724
339,536
376,468
289,927
285,379
322,417
242,404
250,332
299,724

θANC-PYLO
236,831
229,958
256,249
θANC-MALE
198,824
196,826
225,076
θANC-TENA
135,552
145,112
177,692

θKYLL
759,677
–
–
θKYLL
759,677
–
–
θKYLL
759,677
–
–

θMAEN
574,315
551,021
598,160
θPARN
415,440
408,995
455,342
θTAYG
762,130
675,924
743,458

r
0.780
0.775
0.786
r
0.691
0.678
0.692
r
0.843
0.826
0.842

TDIV
452,165
454,768
498,160
TDIV
373,742
380,909
424,008
TDIV
427,251
427,893
472,906

TADMIX
102,550
100,052
106,627
TADMIX
84,100
82,580
90,792
TADMIX
252,517
232,377
249,480

注：群体代码如表1所述。表格显示了每个参数的点估计值及其95%置信区间下限和上限，包括基因组规模（θ）、从C. pulloides继承的谱系比例（r）以及分歧时间（TDIV）和混合时间（TADMIX），假设每年一代。C. pulloides的当代有效种群规模（θKYLL）是根据其核苷酸多样性（π）计算得出的，并在fastsimcoal2分析中固定，以便估算所有其他参数（详见“检测基因渗入”部分）。模型在图S1中进行了说明。

**形态测量分析**
基于原始Procrustes坐标的前翅形状的几何形态测量分析显示，短翅和长翅类群之间有明显的分离，C. pulloides和C. sangiorgii的群体与C. moreanus和C. parnon分开（图S6a）。C. crassiceps的群体在翅膀大小上表现出显著变异，西北部的群体（SOFI、ARAC）翅膀较短，与C. pulloides和C. sangiorgii聚类，而东南部的群体（METH、DIDI）翅膀较长，与C. moreanus和C. parnon聚类（图S6a）。EPID群体在形态空间中占据中间位置，这与翅膀发育的连续地理梯度一致（图S6a）。与C. moreanus（MAEN、TAYP）或C. parnon（PARN）发生基因混合的C. pulloides群体显示出与前翅形状无异的翅膀形状（图S6a）。异速生长分析表明大小对前翅形状有显著影响（单因素方差分析；F1,111 = 304.49，p < 0.001）。在校正了大小效应后，短翅和长翅类群之间的形状差异不再明显（图S6b）。对于前胸-头部形状，大小也有显著影响（单因素方差分析；F1,111 = 5.47，p = 0.002），并且类群之间的总体变异有限，大多数群体在形态空间中大致重叠（图S7a,b）。两种特征的Procrustes距离通常较小，在大多数成对比较中不显著（表S4和S5），表明群体间的形状差异较弱。在物种层面，前翅形状的Procrustes距离也较低（表S6），只有在涉及最不同谱系的少数比较中检测到显著值（主要是AKAR和KAKA）。对于前胸-头部形状，显著差异同样有限，主要限于C. sangiorgii和AKAR之间的对比（表S7）。相对前翅大小（FWL/FL）在类群间存在显著差异，共识别出两种主要形态型：短翅的C. sangiorgii和C. pulloides，以及长翅的C. moreanus和C. parnon（图4）。如上所述，C. crassiceps在相对翅膀大小上表现出显著的群体间变异，遵循从西北到东南的梯度，从短翅的（SOFI和ARAC）到长翅的（METH和DIDI）群体，而在地理过渡群体（EPID）中值为中间值（图4）。事后成对比较显示，大多数群体对的FWL/FL比率存在显著差异，特别是在短翅和长翅群体之间（表S8），物种层面的比较也显示了类似的模式（表S9）。值得注意的是，被认为属于C. pulloides的混合群体（MAEN、PARN和TAYP）的FWL/FL值与该类群的纯遗传群体重叠（图3和4）。

**图4**
展示了希腊Chorthippus物种复合体中雄性前翅长度与前腿长度比率（FWL/FL）的分布。山脊密度图表示相对翅膀大小的变化，前腿长度用作体型的代理指标。群体根据它们在系统发育树中的相应谱系（图1）或基于结构分析分配给它们的主要遗传簇（用星号标记的混合群体）进行着色（图3）。群体代码如表1所述。

**讨论**
我们对希腊Chorthippus物种复合体的综合分析为塑造谱系多样化和地中海生物多样性热点地区物种边界的持续存在提供了新的见解。系统基因组重建表明，多样化发生在中更新世时期，随后的二次接触产生了佩洛波尼索斯半岛上的复杂遗传结构和混合模式。遗传聚类分析与该地区四个类群的地理分布范围大致一致，但在分布边缘，一些群体表现出明显的杂交历史特征，揭示了半通透的物种边界。这些发现共同强调了历史隔离、二次接触和不完全生殖隔离作为这一复合体内多样化的主要驱动因素，凸显了地中海地区作为微地理物种形成的重要中心和独特性的显著储库。

系统基因组分析揭示了一个高度分裂的谱系，对应于据推测来自Karkarditsa山的C. pulloides最北端的群体（KAKA），它被恢复为包括所有其他类群的姐妹群（图2和S1）。在这个姐妹群中，识别出两个地理上连贯的亚群：一个包括C. sangiorgii和来自阿卡纳尼亚山脉的C. pulloides群体的中央希腊-伊奥尼亚群岛亚群，以及一个包括C. moreanus、C. parnon、C. crassiceps和其余C. pulloides群体的佩洛波尼索斯-基西拉岛亚群（图2和S1）。这种深度分裂将分布在科林斯湾北部和南部的群体分开，科林斯湾是一个众所周知的生物地理屏障，它影响了多个巴尔干生物的多样化（Collier & Dart, 1991; Kiourtsoglou et al., 2021; Ortego et al., 2026）。自更新世以来，佩洛波尼索斯半岛与希腊大陆其余部分的隔离可能促进了佩洛波尼索斯-基西拉亚群的分化，而科林斯湾以北的谱系在中央希腊和伊奥尼亚群岛内多样化。与这一情景一致，部分共分布的高山蝗虫属Oropodisma的古分布模型表明，佩洛波尼索斯半岛至少从末次冰盛期以来就与巴尔干大陆其他部分分离（Ortego et al., 2026）。除了这种主要的南北划分外，佩洛波尼索斯半岛复杂的内部地形似乎进一步促进了该地区的多样化。南部次半岛——Messenian、Mani、Cape Malea和Argolid——构成了基因最纯正的C. moreanus、C. parnon和C. crassiceps群体的地理死胡同。这些狭窄的半岛可能在更新世期间起到了隔离作用，或者说是“隔离中的避难所”（Allegrucci et al., 2021; Kiourtsoglou et al., 2021; Nieto-Feliner, 2011; Thanou et al., 2023），强调了它们在促进局部多样化和物种形成中的作用。我们的结果与先前记录的系统地理模式一致，支持了多样化的主要地理维度。在佩洛波尼索斯半岛内部，每个假定类群的群体在系统发育树上都是互单系的，具有强有力的节点支持，表明我们的数据集提供了足够的系统发育信号来解析进化关系，尽管谱系最近发生了分化。只有少数分隔同种群体的节点支持度较低，这可能反映了由于最近分化导致的不完全谱系分离（ILS）。分化时间估计将最深节点置于中更新世时期（<0.7 Ma），与其他地中海蝗虫复合体的估计一致，在这些复合体中，涉及基因型一致的类群的真正物种形成事件（Ortego et al., 2021, 2024）或部分生殖隔离（Ortego & Knowles, 2022; Ortego et al., 2026）发生在最近0.3–1.5 Ma内。因此，希腊Chorthippus复合体内的遗传分化和表型分化最好解释为近期或初始物种形成的结果，而不是由于地理障碍造成的简单遗传不连续性。我们的结果还有助于解决该群体内的分类学不确定性。早期评估注意到C. sangiorgii和C. pulloides之间的强烈形态相似性，导致一些作者认为这两个类群可能代表一个单一物种（Ramme, 1926, 1927; Willemse, 1984, 1985, 1986）。随后的生物声学研究揭示了C. pulloides的独特鸣叫声，为其与C. sangiorgii的区别提供了证据（Willemse et al., 2009）。我们的系统基因组分析进一步证实了这两个类群代表的是独立的进化谱系（图2），说明近期分化和有限的表型分化如何在这个群体中产生分类学上的不确定性。物种界定分析在很大程度上与当前的分类学相符，但也揭示了三个额外的不同谱系（KAKA、AKAR和POTA）（图2），在某些情况下（AKAR），这些群体之前被认为是形态上的过渡形式（Willemse et al., 2009）。尽管它们在形态上与C. pulloides（KAKA、AKAR）或C. parnon（POTA）非常相似，但这些群体始终被恢复为独立的进化实体。这些发现一起说明了在最近更新世辐射中，形态上统一的类群可能隐藏着大量的多样性（即隐秘物种；Bickford et al., 2007; e.g., Huang et al., 2020; Ortego et al., 2024）。

**二次接触区的杂交动态**
D统计测试和结构分析显示，历史上的杂交和遗传混合在地理上是受限的，主要局限于位于物种范围边缘的群体（图3；表S3）。大多数混合事件涉及来自中央和南部佩洛波尼索斯的短翅C. pulloides群体，这些群体的分布范围与长翅的C. moreanus和C. parnon重叠或相邻。这些分析还揭示了强烈的不对称渗入现象，基因流主要从长翅的C. moreanus和C. parnon流向短翅的C. pulloides。这种模式与扩散能力的差异一致，即长翅类群更有可能到达该范围并与C. pulloides杂交，而相反方向的移动可能受到限制，这反映了其他具有对比扩散能力的杂交蝗虫的类似模式（Ortego et al., 2021; Ortego & Knowles, 2022）。此外，C. moreanus和C. parnon更广泛的地理分布可能促进了基因淹没地理上更受限的C. pulloides群体。这种动态在泰盖图斯山（Mt. Taygetus）上得到了体现：在那里，C. pulloides种群显示出与C. moreanus高度混血的迹象，尽管这两种类群相距不到1.7公里，但没有发现相互渗入的证据。C. pulloides在其分布范围内的海拔分布进一步揭示了即使在繁殖障碍较弱的情况下，其谱系也能持续存在的机制。在伯罗奔尼撒半岛北部，由于该地区缺乏这一复合体的其他成员，杂交的机会极少，C. pulloides占据了广泛的海拔范围（400–2400米）。相比之下，在伯罗奔尼撒半岛的中部和南部，C. pulloides主要局限于高海拔地区（>1800米），而C. moreanus和C. parnon则主导了周边的丘陵和低地。这种海拔隔离可能有助于C. pulloides在马埃纳隆山（Mt. Maenalon）、帕尔农山（Mt. Parnon）和泰盖图斯山上保持高度隔离的状态，限制了谱系的融合和由更广泛分布的低地类群带来的基因淹没效应。在这些C. pulloides种群中检测到的较高水平的混血现象表明，在冰河时期，它们多次向下迁移，促进了与长翅类群的局部至区域性的接触和杂交；而随后的间冰期则将这些混血种群重新推回了高山和亚高山栖息地。来自fastsimcoal2的联合估计表明，混血事件发生在晚更新世时期（约25万至8万年前；表3），与主要的冰期-间冰期周期相吻合（Hewitt, 1996, 2000; Hughes et al., 2006）。值得注意的是，对于TAYP的混血事件推断的时间要早得多（约25.3万年前），而PETR和PNR的混血事件大约发生在8.4至10.3万年前（表3），这表明不同种群之间的二次接触和杂交事件是异步发生的。这一情景还得到了其他共分布的高山蝗虫历史分布重建的支持，这些蝗虫在冰河时期经历了分布范围的扩张，在温暖的间冰期则收缩到了山顶（Ortego et al., 2026）。这些变化主要是海拔方向的，这可能解释了为什么基因混血在空间上是有限的，并且仅存在于地理上相邻的谱系之间（图3）。总体而言，这些结果说明了第四纪气候变化如何促进了目前分布在不同区域的谱系之间的多次二次接触，形成了局部的杂交区（Hewitt, 1996, 2000; Ortego & Knowles, 2022）。

我们的形态测量分析显示，前翅和前胸背板-头部的形状在不同谱系之间基本保持一致（图S5和S6，表S4和S5），而翅膀长度与体型的比例是唯一一个与分类边界部分吻合的特征（图4，表S9）。这种整体的形态保守性符合隐秘物种形成的预期（Bickford et al., 2007），并表明除了与扩散直接相关的特征外，其他特征都表现出明显的形态停滞。在其他直翅目昆虫中也有类似的模式，即共域和生殖隔离的谱系在形态上无法区分（Ortego et al., 2024），或者主要在扩散相关特征上存在差异（Ortego et al., 2021）。Pterygota的进化历史以翅膀发育的反复转变为特点（例如，从长翅到短翅或无翅），这通常与栖息地稳定性和减少的扩散需求有关（Roff, 1990, 1994; Zera & Denno, 1997）。假设祖先状态是长翅的，我们的系统发育树显示该复合体内至少有四次独立的翅膀尺寸减小事件：（i）在孤立的KAKA谱系中；（ii）在C. sangiorgii和大陆AKAR谱系的祖先中；（iii）在C. pulloides中；（iv）最近在C. crassiceps中，它包括短翅和长翅的两个亚支。这些反复的减小事件突显了与扩散相关的特征的进化不稳定性，与其他直翅目昆虫中的模式一致（Ortego et al., 2021）。C. crassiceps物种提供了一个明显的例子，展示了扩散能力的持续进化转变。在该物种中，翅膀长度呈现出明显的西北-东南梯度：短翅种群（SOFI, ARAC）位于其分布范围的西北部，长翅种群（METH, DIDY）位于东南部，中间形态（EPID）位于中间区域（图4）。在我们的系统基因组分析中，西北部和东南部的种群形成了不同的亚支（图2），表明翅膀长度的变化反映了飞行能力的进化转变，而不是表型可塑性或简单的多态性。分歧时间估计表明这些亚支的分化时间小于120千年，并且分布距离小于35公里，这说明在较短的空间和时间尺度上可以发生显著的扩散相关形态变化。在其他蝗虫（Ortego et al., 2021）和其他昆虫群体（McCulloch et al., 2022; Suzuki et al., 2019）中也记录了类似的快速飞行能力丧失现象。总之，这些结果表明，在破碎的景观中，向短翅的转变可以迅速进化，即使是在相对较小的地理距离内。对短翅（C. pulloides）与长翅（C. moreanus或C. parnon）之间杂交产生的混血种群的分析进一步揭示了该复合体内翅膀尺寸减小的驱动因素。尽管与长翅类群有大量的基因混合（图3），所有混血种群仍然保留了纯C. pulloides的特征性短翅表型（图4）。缺乏中间表型种群，以及尽管有广泛的渗入，C. pulloides样态的持续存在，表明在伯罗奔尼撒中部和南部主要由C. pulloides占据的高海拔栖息地中，对长翅表型存在强烈的选择压力，和/或通过与贡献最多基因组的类群的反复回交实现了表型同化（Huang, 2016; Ortego et al., 2026; Rheindt et al., 2014）。

我们的研究表明，通过整合基因组和形态测量数据可以澄清最近多样化物种复合体的分类边界。在希腊的Chorthippus物种复合体中，基因组证据揭示了在多个时间和空间尺度上运作的差异化和混合现象：大多数类群表现出明确的遗传结构，而在其分布边缘则发生了广泛的杂交。复合体内的分化可能是由复杂的地形和更新世气候变化驱动的分布变化所促进的（Carstens & Knowles, 2007; Hewitt, 2000），随后又通过二次接触和渗入性杂交事件重新塑造（Ortego & Knowles, 2022; Seehausen, 2004; 图3和S2）。在这个动态背景下，伯罗奔尼撒半岛南部的小半岛——拥有最纯净的遗传种群——说明了小规模的地形死胡同如何作为长期微观避难所，在反复的气候波动中保持谱系的独立性。翅膀长度的反复和独立减小，与其他形态特征的强烈保守性形成对比（例如，前胸背板-头部和前翅形状），表明扩散相关形态是主要的分化轴（Roff, 1990, 1994; Zera & Denno, 1997）。这种部分生殖隔离和形态保守性的结合突显了在地形异质的地中海景观中进行物种划分的挑战（García-Navas et al., 2017a; Hawlitschek et al., 2022; Neumeister et al., 2025; Noguerales et al., 2018; Ortego et al., 2024; Schmidt et al., 2024）。我们的结果进一步表明，最近的分化与形态上的统一性可以掩盖大量的隐藏多样性。因此，一些地理上受限的谱系（例如AKAR、KAKA和POTA）尽管在形态上分化较小，却表现出明显的基因组独特性，说明了地理隔离和减少的扩散能力如何促进细尺度的隐秘多样化。从保护的角度来看，我们的发现特别重要，因为它们识别出了多个隐秘的进化单元，并完善了该复合体内几个类群（C. pulloides、C. parnon、C. crassiceps）的分类地位和分布，这些类群目前被IUCN红色名录列为“近危”（Tzortzakaki et al., 2023a, 2023b, 2023c）。值得注意的是，尽管这些谱系在基因组水平上差异明显，但由于Chorthippus属的地位尚未解决，以及需要更多的系统基因组和表型分析证据，我们目前选择不做出正式的分类决定。未来整合额外的基因组数据和补充表型特征（例如，内部生殖器）的工作对于澄清这些谱类的分类地位至关重要，一旦有更多证据，可能会允许将它们认定为独立的分类单元。同时，我们的结果为这些谱系的保护和进一步进化研究提供了坚实的基础。

我们的研究展示了基因组和形态测量数据的整合如何有助于澄清最近分化的物种复合体的分类边界。在希腊的Chorthippus物种复合体中，基因组证据揭示了在多个时间和空间尺度上运作的差异化和混合现象：大多数类群表现出明确的遗传结构，而在它们的分布边缘则发生了广泛的杂交。复合体内的分化可能是由复杂的地形和更新世气候变化驱动的分布变化所促进的（Carstens & Knowles, 2007; Hewitt, 2000），随后又通过二次接触和渗入性杂交事件重新塑造（Ortego & Knowles, 2022; Seehausen, 2004; 图3和S2）。在这个动态背景下，伯罗奔尼撒半岛南部的子半岛——拥有几个类群最纯净的遗传种群——说明了小规模的地形死胡同如何作为长期的微避难所，在反复的气候波动中维持谱系的独立性。翅膀长度的反复和独立减小与其他形态特征的强烈保守性形成对比，表明扩散相关形态是分化的主要轴（Roff, 1990, 1994; Zera & Denno, 1997）。这种部分生殖隔离和形态保守性的结合突显了在地形异质的地中海景观中进行物种划分的挑战（García-Navas et al., 2017a; Hawlitschek et al., 2022; Neumeister et al., 2025; Noguerales et al., 2018; Ortego et al., 2024; Schmidt et al., 2024）。我们的结果还表明，最近的分化与形态上的统一性可能掩盖了大量的隐藏多样性。因此，一些地理上受限的谱系（例如AKAR、KAKA和POTA）尽管在形态上分化较小，却表现出明显的基因组独特性，说明了地理隔离和减少的扩散能力如何促进细尺度的隐秘多样化。从保护的角度来看，我们的发现特别相关，因为它们识别出了多个隐秘的进化单元，并完善了该复合体内几个类群（C. pulloides、C. parnon、C. crassiceps）的分类地位和分布，这些类群目前被IUCN红色名录列为“近危”（Tzortzakaki et al., 2023a, 2023b, 2023c）。值得注意的是，虽然这些谱系在基因组水平上差异明显，但鉴于Chorthippus属的地位尚未解决，以及需要更多的系统基因组和表型分析证据，我们目前选择不做出正式的分类决定。未来整合额外的基因组数据和补充表型特征（例如，内部生殖器）的工作对于澄清这些谱类的分类地位至关重要，并可能在获得更多证据后允许将它们认定为独立的分类单元。与此同时，我们的结果为这些谱系的保护和进一步进化研究提供了坚实的框架。

作者贡献：
Marina Trillo：概念化；数据管理；正式分析；调查；方法学；验证；可视化；初稿撰写。
Joaquín Ortego：概念化；数据管理；资金获取；调查；方法学；项目管理；资源协调；监督；验证；可视化；修订和编辑。

致谢：
我们感谢Ioannis Anastasiou（希腊雅典国立和卡波迪斯特里亚大学）在研究许可申请方面的支持，以及Anna Papadopoulou和Jorge Gutiérrez-Rodríguez在野外工作期间的帮助。我们还要感谢三位匿名审稿人对早期手稿提出的建设性和宝贵意见。采样许可由希腊环境和能源部授予（许可编号YPEN/DDD/34736/1134和YPEN/DDD/32363/1054）。Logistic支持由多尼亚纳生物站（CSIC）的分子生态学实验室（LEM-EBD）提供。我们还要感谢加利西亚超级计算中心（CESGA）和多尼亚纳的独特科学技术基础设施（ICTS-RBD）提供的计算机资源。

资助信息：
资助项目TED2021-129328B-I00由科学技术创新部（MCIN/AEI/10.13039/501100011033）和欧盟NextGenerationEU/PRTR资助；资助项目PID2021-123298NB-I00由科学技术创新部和欧洲区域发展基金（MCIN/AEI/10.13039/501100011033/FEDER, UE）资助。

利益冲突声明：
作者声明没有利益冲突。

伦理声明：
所有样本都是在希腊环境和能源部颁发的许可下获得的（许可编号YPEN/DDD/34736/1134和YPEN/DDD/32363/1054）。

数据可用性声明：
原始的Illumina读段已存放在NCBI Sequence Read Archive（SRA）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）的BioProject PRJNA702631中。所有分析的输入文件可在Figshare上找到（https://doi.org/10.6084/m9.figshare.31136593（Ortego & Trillo, 2026））。