《Journal of Materials Chemistry B》：Dictated cell adhesion and migration using microfluidic-controlled synthetic hydrogels exhibiting programmable viscoelasticities
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细胞与细胞外基质（ECM）之间的机械感应相互作用是细胞运动、增殖和粘附等基本功能的基础，由焦点粘附（FA）位点动态、双向、张力调节的成熟所驱动。研究人员展示了利用合成水凝胶精确控制天然机械感应相互作用及其下游功能。研究人员介绍了一种微流控辅助合成亚胺交联透明质
细胞与细胞外基质（ECM）之间的机械感应相互作用是细胞运动、增殖和粘附等基本功能的基础，由焦点粘附（FA）位点动态、双向、张力调节的成熟所驱动。研究人员展示了利用合成水凝胶精确控制天然机械感应相互作用及其下游功能。研究人员介绍了一种微流控辅助合成亚胺交联透明质酸-明胶共聚物水凝胶（HAG）的方法，实现了可控、预定义的梯度粘弹性。具体而言，制备了三种模拟天然组织（肌肉、表皮和软骨）的HAG水凝胶，使其匹配有效杨氏模量（Ymod）和应力松弛时间（τ1/2）。观察到增强的细胞铺展和定向细胞迁移，且细胞偏好于具有组织匹配粘弹性的底物。这些机械感应反应通过牵引力显微镜得到证实，揭示了天然组织机械性能与水凝胶粘弹性参数之间的紧密相关性。研究人员证明，作为FA形成和细胞迁移核心调节因子的FAK及相关YAP/TAZ信号通路的功效，可通过底物组织匹配粘弹性进行调节。研究人员将这些预编程的粘弹性梯度水凝胶作为时空细胞分离基质进行应用，实现了二元细胞混合物的粘弹性驱动迁移。这项工作为研究细胞-材料相互作用提供了一个强有力的平台，在组织工程、免疫治疗和再生医学方面具有重要的潜在应用价值。
该研究针对细胞与细胞外基质（ECM）间机械感应相互作用对细胞功能的关键调控机制，以及现有水凝胶系统在模拟天然ECM动态粘弹性及梯度特性方面的不足，开发了微流控辅助合成的可编程粘弹性水凝胶，并深入探究了其对细胞行为的影响及应用潜力。论文发表于《Journal of Materials Chemistry B》。
研究人员主要采用以下关键技术方法：微流控技术合成具有可编程粘弹性的亚胺交联透明质酸-明胶共聚物水凝胶（HAG）；流变学和纳米压痕测量表征水凝胶的杨氏模量（Ymod）和应力松弛时间（τ1/2）；扫描电子显微镜（SEM）观察水凝胶微观结构；细胞培养及细胞毒性评估；牵引力显微镜（TFM）量化细胞牵引力；免疫印迹（Western blotting）和免疫荧光染色检测 focal adhesion kinase（FAK）、vinculin及YAP/TAZ等蛋白表达与定位；实时显微术追踪细胞迁移轨迹及铺展面积；以及利用梯度水凝胶实现二元细胞混合物的时空分离实验。
研究结果
3.1. 微流控控制合成具有可编程粘弹性的透明质酸/明胶水凝胶
研究人员通过自动化程序流速调制含有HA和明胶的前凝胶溶液，成功合成了具有精确可调粘弹性的HAG水凝胶。该方法能实现0.01%（w/v）精度的组分沉积，确保了梯度粘弹性水凝胶的高度可重复合成。傅里叶变换红外光谱（FTIR）证实了亚胺键的形成。流变学和纳米压痕测量显示，该方法能有效生成具有定制粘弹性梯度的凝胶，其杨氏模量和应力松弛时间可通过HA/明胶的组成和浓度进行精确调控。
3.2. 仿生组织粘弹性水凝胶的制备
研究人员评估了肌肉、表皮和软骨三种组织的力学性能，并据此合成了三种分别模拟其粘弹性参数的HAG水凝胶（HAG-2模拟肌肉，HAG-3模拟表皮，HAG-4模拟软骨）。此外，还合成了具有更低（HAG-1）和更高（HAG-5）机械性能的两种水凝胶作为边界。SEM分析表明，水凝胶的孔径和密度随机械参数变化，低机械参数凝胶孔径大、密度低，高机械参数凝胶孔径小、密度高。最终构建了包含这三种水凝胶的连续粘弹性梯度框架。
3.3. 仿生组织梯度粘弹性水凝胶上的定向细胞迁移与铺展
研究人员将C2C12成肌细胞、NIH-3T3成纤维细胞和鼠软骨细胞分别置于非线形梯度粘弹性水凝胶的不同界面处，通过延时显微术分析其迁移轨迹和铺展面积。结果显示，细胞偏好迁移至与其天然组织粘弹性相匹配的水凝胶区域，并在对应区域表现出最大的平均铺展面积。例如，C2C12细胞偏好迁移至模拟肌肉的HAG-2区域并表现出最大铺展，NIH-3T3细胞偏好迁移至模拟表皮的HAG-3区域，软骨细胞则偏好迁移至模拟软骨的HAG-4区域。均匀粘弹性水凝胶上的对照实验则未观察到定向迁移模式。这表明底物的梯度粘弹性而非绝对机械特征是引导细胞定向迁移的关键。
3.4. 粘弹性调控的HAG水凝胶上的细胞牵引力
利用牵引力显微镜（TFM）技术，研究人员量化了三种细胞在不同粘弹性水凝胶上的牵引力。结果表明，每种细胞类型均在其匹配的粘弹性水凝胶上施加最大牵引力：C2C12细胞在HAG-2上牵引力最大，NIH-3T3细胞在HAG-3上最大，软骨细胞在HAG-4上最大。这些牵引力数据与细胞铺展和迁移的偏好性结果高度吻合，进一步证实了细胞对底物粘弹性的机械感知及其与天然组织机械特性的相关性。
3.5. 水凝胶粘弹性决定的细胞焦点粘附成熟
研究人员通过免疫印迹和免疫荧光实验，分析了不同粘弹性水凝胶上细胞的焦点粘附（FA）成熟情况。结果显示，在匹配其天然组织粘弹性的水凝胶上，三种细胞均表现出更高的p-FAK和vinculin水平，更大的FA复合体尺寸，以及更高的YAP核定位比例。定量PCR（qPCR）分析也证实，下游靶基因CTGF的表达在这些匹配的水凝胶上显著上调。这些结果表明，底物粘弹性，尤其是与生理值匹配时，能强烈影响YAP/TAZ通路激活、焦点粘附形成与成熟。
3.6. 可编程粘弹性底物的细胞空间分离
基于上述发现，研究人员将两种不同细胞类型的混合物随机接种在由HAG-2、HAG-3和HAG-4组成的梯度水凝胶上，观察其时空分离效果。结果表明，C2C12与NIH-3T3细胞混合物、NIH-3T3与软骨细胞混合物以及C2C12与软骨细胞混合物均能在3天内根据其各自匹配的粘弹性区域实现有效的空间分离，分离纯度和效率较高。这证明了利用粘弹性梯度水凝胶实现细胞自主分离的可行性。
讨论与结论
该研究提出了一种合成具有可编程粘弹性水凝胶的多功能方法，该方法能精确控制水凝胶组成，并具有良好的重现性和可扩展性。合成的粘弹性可编程水凝胶底物能够模拟天然细胞外基质（ECM）的功能，调节细胞的机械感知和响应。研究揭示了不同细胞类型与具有可变及梯度粘弹性的水凝胶框架之间的机械感应相互作用关系，及其对细胞铺展、焦点粘附成熟和定向迁移等机械细胞功能的调控作用。通过将细胞与合成可编程粘弹性水凝胶的机械感应相互作用转化为机械细胞功能，研究人员成功将该原理应用于不同细胞混合物的水凝胶引导动态分离。
研究的实际效用和未来应用前景广阔。通过控制水凝胶基底的空间机械移动，可生成具有不同预编程粘弹性特性的复杂水凝胶阵列，从而实现细胞的自主程序化图案化及其功能互作。此外，设计用于干细胞定向分化或癌症研究的细胞可编程粘弹性水凝胶阵列，可为组织工程、免疫治疗和再生医学提供高效的目标细胞高通量合成平台。该研究还为探索细胞与合成粘弹性水凝胶界面的相互作用开辟了新方向，未来可结合细胞膜化学修饰、刺激响应元件集成以及低温凝胶（cryogels）等技术，进一步拓展系统功能，并深入解析合成粘弹性水凝胶的机械感应相互作用与细胞内信号线索之间的生物物理联系。
