非离子肽两亲分子及其超分子共组装调控电荷密度与生物活性

《Journal of Materials Chemistry B》：Nonionic peptide amphiphiles and their supramolecular co-assemblies tune charge density and bioactivity

　　

超分子肽组装通常依赖离子基团实现水相溶解性，但电荷有时会影响其生物学功能。这些组装体中的阳离子残基常与细胞毒性相关，且带电氨基酸导致超分子结构依赖于pH值和离子强度。研究人员在此报道了一种含有十聚乙二醇（decaethylene glycol）片段的非离子肽两亲分子（Peptide Amphiphile, PA）的合成，及其与离子型PA单体的超分子共组装策略，旨在产生不带电荷的组装体并精细调控电荷密度。研究表明，尽管带电PA组装体的形态和内部结构取决于抗衡离子屏蔽和pH值，但这些非离子分子自组装形成了具有高长径比（high-aspect ratio）的细丝，其中包含β-折叠，且在有无离子屏蔽以及酸性、中性和碱性pH条件下均保持稳定。通过将非离子PA分子与带电PA分子共组装，研究人员制备了具有可调表面电荷密度的超分子共聚物，其内部有序性高于完全带电或完全不带电的组装体。利用间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）成骨分化的体外模型，研究人员发现含有非离子分子或非离子与离子PA分子共组装的超分子组装体比仅含带电分子的组装体表现出更高的生物活性。研究人员假设这种增强的生物活性源于PA分子的蛋白质结合能力与由非离子乙二醇片段引入的增强型超分子动力学之间的协同作用。因此，非离子PA及其共组装体可用于研究电荷密度和其他因素如何影响水溶性超分子纳米结构的生物活性。

学术解读：非离子肽两亲分子设计及其在调控生物活性中的应用

研究背景与意义

静电电荷在纳米材料的生物活性中扮演着关键角色，高界面能驱动生物分子吸附形成“生物分子冠”，进而决定纳米材料的体内分布与细胞相互作用。传统策略常采用聚乙二醇（Polyethylene Glycol, PEG）修饰以构建无电荷水合层，减少非特异性蛋白吸附并延长循环时间。然而，在自组装肽体系中，离子电荷不仅是决定超分子形态的核心因素，还直接影响生物活性、免疫原性及凝胶化行为。Stupp课题组开发的肽两亲分子（PA）平台虽能通过程序化组装形成动态纳米细丝，但其表面高密度正电荷常引发细胞毒性，且带电表位易因静电相互作用导致生物活性受限。现有研究缺乏对完全非离子PA体系的探索，尤其难以厘清电荷本身对生物功能的独立影响。因此，开发非离子PA并构建其与离子PA的共组装体系，成为解析电荷密度-结构-功能关系的关键路径。该研究成果发表于《Journal of Materials Chemistry B》。

关键技术方法

研究人员通过固相肽合成法制备了三种核心PA分子：非离子型N-棕榈酰-VVAA-PEG₁₀-NH₂（PA1）、阴离子型N-棕榈酰-VVAAEE-NH₂（PA2）及阳离子型N-棕榈酰-VVAAKK-NH₂（PA3）。利用尼罗红荧光光谱（Nile red assay）监测疏水微环境形成，圆二色谱（Circular Dichroism, CD）分析二级结构，冷冻透射电子显微镜（Cryogenic-TEM）观察形貌，小角/广角X射线散射（Small/Wide-Angle X-ray Scattering, SAXS/WAXS）解析内部有序性。细胞实验采用正常人肺成纤维细胞（normal human lung fibroblast, nHLF）评估细胞活力，并以人间充质干细胞（human MSCs）成骨分化模型检测碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, ALP）活性。

研究结果

1. 非离子PA分子的自组装

尼罗红荧光蓝移现象表明，PA1的组装不受缓冲液盐浓度影响，而PA2的组装依赖于离子强度（150 mM NaCl下蓝移显著）。CD光谱显示PA1在0 mM与15 mM NaCl中均呈现典型β-折叠信号，而PA2/PA3在无盐条件下因静电排斥转为无规卷曲。这表明PEG化PA通过空间位阻而非静电屏蔽驱动组装，实现了离子强度不敏感的超分子聚合。

2. pH依赖性超分子聚合

Zeta电位测量显示PA1在pH 2、7、12时表面电荷均接近0 mV，而PA2/PA3的表面电荷随pH剧烈变化。Cryo-TEM显示PA1在所有pH下均形成窄带状结构，PA2在酸性pH下呈宽短带状聚集，中性/碱性pH下转为细长纤维；PA3则在碱性pH下发生形态转变。SAXS数据进一步证实PA1的散射图谱斜率在不同pH下保持一致，而带电PA的斜率随电荷密度变化。CD结果显示PA1的β-折叠特征不受pH影响，验证了非离子基团对酸碱环境的鲁棒性。

3. 非离子与离子PA的超分子共聚

将PA1与PA2共组装后，Cryo-TEM显示添加25 mol% PA2即可诱导形态从PA1型宽带状向PA2型扭曲细丝转变。SAXS分析表明，随着PA2比例增加，散射矢量（wave vector）的第一极小值右移（0.60 nm^?1至0.77 nm^?1），反映组装体横截面积减小。WAXS揭示(10)晶面峰强在PA1:PA2为1:1时达到最大值，表明共组装优化了分子间氢键排列。FTIR显示酰胺I′带峰位从PA1的1625 cm^?1移至共组装体的1623 cm^?1，提示电荷引入增加了内部水合作用与动力学柔性。

4. 表面电荷对PA细丝生物活性的影响

细胞活力实验表明，PA1与PA2在100 μM浓度下对nHLF无毒性（存活率>85%），而PA3的半数有效浓度（EC₅₀）为25±4 μM。在MSCs成骨分化模型中，PA1单独处理或与PA2共组装（含10%-50% PA2）组在第14天的ALP活性显著高于对照组，而纯PA2组无此效应。值得注意的是，含75% PA1与25% PA2的共组装体诱导ALP活性增幅最大，提示适度电荷密度与PEG表面修饰的协同效应优于单一组分。

结论与讨论

本研究报道了一类基于十聚乙二醇的非离子PA分子，其可在酸性、中性及碱性pH条件下形成稳定的β-折叠纳米细丝，且组装行为对缓冲液离子强度不敏感。通过与离子型PA共组装，研究人员实现了表面电荷密度的精准调控，并发现仅需少量带电单体（约25 mol%）即可诱导形态学转变，同时显著提升组装体的内部有序性。生物活性实验证实，非离子PA及其共组装体通过增强蛋白质结合能力与超分子动力学特性，有效促进了MSCs的成骨分化。该工作为设计低毒、电荷可调的肽基生物材料提供了新范式，尤其在规避阳离子毒性的同时维持生物信号传导方面具有重要应用价值。未来可通过在非离子PA骨架中引入特定生物活性肽序列，进一步优化靶向识别与膜相互作用性能。