高通量多物种定量聚合酶链反应检测方法用于研究急性热应激对三种鲟鱼（Acipenser sturgeon）的影响

《Journal of Fish Biology》：High-throughput multispecies quantitative polymerase chain reaction assays to study the effects of acute thermal stress in three species of Acipenser sturgeon

　　摘要

鱼类在自然环境中会经历热应激，这种应激可能由自然因素或人为因素引起，并直接影响它们的生理机能。在本研究中，我们开发了一种多物种OpenArray? qPCR（定量聚合酶链反应）“芯片”，用于测量急性热应激对Acipenser sturgeons（鲟鱼）mRNA反应的影响。随后，我们在三种鲟鱼物种上测试了这种qPCR芯片：Acipenser fulvescens、Acipenser oxyrinchus和Acipenser brevirostrum。Acipenser fulvescens来自两个遗传上不同的种群（加拿大曼尼托巴省的Burntwood河和Winnipeg河），它们分别适应了三种不同的温度（16°C、20°C和24°C），以量化遗传背景和适应温度对急性热应激转录组反应的影响。此外，还让Acipenser oxyrinchus oxyrinchus和Acipenser brevirostrum的幼鱼适应10°C的温度，然后让它们经历急性热应激。在经历急性热应激前后，我们从所有这些物种中采集了鳃和肝脏样本，热应激是通过CTmax试验施加的。我们使用多物种qPCR芯片量化了这三种物种以及四个参考基因的52个目标基因的表达情况。结果显示，急性热应激影响了17-26个与热代谢应激相关的基因的表达，具体受影响的基因数量因物种而异。然而，不同物种和遗传上不同的种群之间的mRNA模式存在差异，这表明它们对热应激的细胞反应不同，从而导致在自然栖息地中对应激的敏感性也不同。

1 引言

由于气候变化（Houghton, 2001），平均水温正在上升，这可能对全球水生环境产生深远影响（Fernández et al., 2022; Ryan & Ryan, 2006）。像鱼类这样的变温动物对水温的变化非常敏感（Burraco et al., 2020），因为它们的内部温度高度依赖于环境温度，而温度直接影响它们的代谢率（Lear et al., 2020）。鱼类已经进化出能够忍受其自然分布范围内温度波动的能力（Cuculescu et al., 1998），然而，在遇到如热浪这样的快速周期性温度变化时，完全适应热应激并不总是可能的（Volkoff & R?nnestad, 2020）。因此，由热浪引起的快速温度升高有可能对鱼类种群产生严重影响（Morgan et al., 2020）。因此，有必要了解温度对鱼类生理表现和耐热性的影响（Lefevre et al., 2021）。基于转录组的方法可以帮助我们研究野生动物的生理状态，并将动物的转录组特征与适应性特征联系起来（Jeffries et al., 2021）。动物的代谢率代表了维持生命、生长和繁殖所需的能量（Riemer et al., 2018）。由于温度决定了变温动物的代谢率，高温会增加细胞的能量需求（Sun, Zhao, et al., 2019）。在组织中有足够的氧气供应时，葡萄糖通过糖酵解代谢为丙酮酸，然后丙酮酸被转运到线粒体中，在那里经过三羧酸（TCA）循环，并通过氧化磷酸化产生三磷酸腺苷（ATP）（Bertram et al., 2006）。然而，在缺氧条件下，会使用无氧糖酵解来产生ATP，其效率较低（Vazquez et al., 2010）。在这个过程中，糖酵解后丙酮酸被乳酸脱氢酶转化为乳酸，而该反应的副产物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）也被用来生成ATP（Chandel, 2021）。此外，应激激素如儿茶酚胺和皮质醇是脂肪组织中能量流动的重要调节因子（Peckett et al., 2011）。在几种物种中，也报告了应对热应激时参与脂质代谢的基因表达变化（Balbuena-Pecino et al., 2019; Ma et al., 2015; Zhao et al., 2021）。此外，皮质醇水平的升高通常与导致无氧代谢的情况相关（De Boeck et al., 2001）。据报道，热应激会增加参与无氧代谢或糖异生途径的酶的表达和活性，例如乳酸脱氢酶和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶1（Dalvi et al., 2017; Sun, Liu, et al., 2019; Windisch et al., 2011）。如果细胞内产生的ATP不足，重要的生理活动如蛋白质生产和离子调节可能会失败，最终导致细胞死亡（Staples & Buck, 2009）。急性热应激会在鱼类中引发生理反应（Morgan et al., 2019），包括细胞层面的变化（Somero, 2020）。热休克蛋白（HSP）的上调在暴露于高温的水生动物中是常见的细胞反应（Zheng et al., 2019），这些蛋白质对于蛋白质的折叠非常重要（Craig et al., 1993; Whitley et al., 1999）。热应激还被观察到会增加活性氧（ROS）的产生（Belhadj Slimen et al., 2014）。通常，抗氧化蛋白如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）和过氧化氢酶（CAT）可以解毒ROS并减少这些化合物的负面影响（Mates, 2000）。当ROS的产生超过细胞的抗氧化能力和时，ROS会通过脂质过氧化、蛋白质和DNA的改变导致细胞损伤，最终可能导致细胞死亡（Fleury et al., 2002）。程序性细胞死亡或凋亡是一种可由细胞内部压力（如ROS水平升高）引起的细胞死亡类型，特别是通过激活内在凋亡途径（Villalpando-Rodriguez & Gibson, 2021）。在这种现象中，细胞色素c从线粒体释放出来，激活凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1），从而帮助形成凋亡小体复合体，最终由执行性caspases激活（Green & Llambi, 2015）。执行性caspases，如caspase-3，会激活细胞质内的核酸内切酶和蛋白酶，分别降解细胞核和蛋白质（Elmore, 2007），从而导致受控制的细胞死亡。鲟鱼是一类古老的鱼类，主要栖息在北半球的河流系统中（Carmona et al., 2009）。自19世纪以来，由于过度捕捞和栖息地破坏等因素，这些物种的数量受到了威胁（Lenhardt et al., 2006）。结果，几种鲟鱼被国际自然保护联盟（IUCN）红色名录列为濒危或极危物种（IUCN, 2025）。此外，热应激还会影响鲟鱼的生理机能，影响其生存（Rodgers et al., 2019; Sardella & Kültz, 2014; Wassink et al., 2019）。定量聚合酶链反应（qPCR）已被用于多项关于Acipenser sturgeon的研究，以探究它们对温度升高的细胞和系统反应（Bugg et al., 2020; Bugg, Thorstensen, et al., 2023; Chen et al., 2022; Penny et al., 2023; Wang et al., 2023）。本研究的目的是开发一种多物种Acipenser OpenArray? qPCR芯片，以检测56个编码在免疫系统、代谢、渗透调节、缺氧反应、凋亡、一般应激反应和氧化应激反应中起重要作用的蛋白质基因的表达。然后，我们使用这种Acipenser芯片来量化三种鲟鱼在生命早期阶段经历临界温度最大值（CTmax）试验后急性热应激的影响：湖鲟（Acipenser fulvescens）、短吻鲟（Acipenser brevirostrum）和大西洋鲟（Acipenser oxyrinchus oxyrinchus）。这些物种是北美的特有物种，由于人为活动，它们的人口在过去几十年中有所下降（Fernandes et al., 2010; Kynard & Horgan, 2002; Pollock et al., 2015）。尽管在形态上相似，并且短吻鲟和大西洋鲟分布在相似的地理区域，但这三种鲟鱼在数百万年前就分化出来，具有不同的生活史和染色体数目（Penny et al., 2023; Trifonov et al., 2016）。研究这些物种对气候变化和热应激的适应能力可以增加我们对它们生物学的了解，并有助于未来的管理决策。在本研究中，我们使用定制设计的OpenArray?芯片来考察具有不同遗传、地理和适应历史的相似物种在转录组水平上对急性热应激的反应。此外，我们旨在识别在Acipenser物种中可作为热应激生物标志物的共同基因和物种特异性基因。

2 材料与方法

2.1 OpenArray?芯片的引物和探针优化

我们设计了一种多物种Acipenser OpenArray? qPCR芯片，其中包含用于扩增和检测Acipenser sturgeon中56个基因的引物和探针。这些基因涉及免疫系统（6个基因）、代谢（15个基因）、渗透调节（4个基因）、缺氧反应（7个基因）、氧化应激反应（7个基因）、一般应激反应（9个基因）和内源对照（4个基因）。这些基因的选择基于其他物种（例如鲑鱼）中的热应激和代谢应激标志物（Islam et al., 2026）以及先前的Acipenser sturgeon研究结果，这些基因对于监测野生和圈养环境中的鲟鱼具有相关的生理意义。每个芯片可以同时量化24个样本中这56个基因的表达，重复两次（56基因×24样本×2个技术重复=2688次反应）。每个样本产生的cDNA使用QuantStudio? 12K Flex Accufill系统（Thermo Fisher Scientific, USA）加载到芯片上。芯片在QuantStudio 12K Flex实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific, USA）上运行，该系统可以同时运行四个芯片，每次可以测量96个样本（10,752次反应）。为了设计适用于Acipenser sturgeon的通用OpenArray?芯片，我们从多个来源获取了不同Acipenser物种的基因组和转录组信息，包括湖鲟（Bugg, Thorstensen, et al., 2023）、白鲟（Acipenser transmontanus）（Doering et al., 2016）和西伯利亚鲟（Acipenser baerii）（Klopp et al., 2020）的RNA测序数据，以及国家生物技术信息中心（NCBI）网站上的在线DNA和RNA序列（www. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。使用Geneious Prime（2023.0.1）对不同物种的序列进行对齐后，根据每个基因保守区域的 consensus 序列，使用Primer Express（3.0.1）设计了引物和探针，遵循用于鲑鱼多物种芯片设计的类似方案（Islam et al., 2026）。在湖鲟、大西洋鲟和短吻鲟上测试了设计的引物和探针（组织由合作者提供用于测试），使用QuantStudio? 5实时PCR系统（Applied Biosystems, USA）和SYBR Green?检测方法进行检测。通过监测扩增曲线和熔解曲线分别检查了扩增的质量和引物的特异性。生成标准曲线后，使用公式E = [10^(1/?slope)]^-1计算每个引物的效率（Wong & Medrano, 2005）。根据OpenArray技术的最佳检测设计协议，选择了效率在80%到120%之间的引物来开发OpenArray?芯片。然后，我们在三种鲟鱼物种上测试了这些芯片，这些物种接受了下面描述的CTmax试验。引物和探针的序列及引物的计算效率列在表S1中。

2.2 实验设计

2.2.1 湖鲟

本研究中使用的A. fulvescens组织样本来自先前的一项研究，该研究调查了曼尼托巴省北部和南部Burntwood河和Winnipeg河两个不同种群适应温度对热生理的影响（Bugg et al., 2020）。这些湖鲟幼鱼是通过用从这两种种群中捕获的野生雌性和雄性的配子进行受精而在加拿大曼尼托巴大学培育的。从受精后30天（DPF）开始，这些幼鱼被分别适应16°C、20°C和24°C，持续30天。30天后（60 DPF），在CTmax试验之前（Pre-CTmax），从Winnipeg河（1.02 ± 0.41 g; 67.71 ± 10 mm LT）和Burntwood河（1.14 ± 0.51 g; 71.51 ± 10 mm LT）的每个适应温度中各选取八条鱼，通过浸泡在过量的三氯甲磺酸溶液中并加入等体积的碳酸氢钠进行安乐死。收集鳃组织并保存在RNAlater?（Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA）中，之后转移到-80°C进行储存。另外从每个适应温度中选取八条鱼，在CTmax试验前1小时放入通风良好的实验装置中（约200 mL水体积，长9.5 cm × 宽5 cm）。CTmax试验是通过以0.3°C/min的速度逐渐升高水箱中的水温，并保持恒定通风，直到鱼在被翻转仰面后3秒内无法自行翻正。在这一刻，鱼通过浸入三氯甲基磺酸酯（tricaine methanesulphonate）溶液中（浓度为250 mg/L）并被碳酸氢钠缓冲处理后实施安乐死，随后取出了鳃组织并进行了保存。

2.2.2 大西洋鲟鱼和短吻鲟鱼
用于本研究的大西洋鲟鱼和短吻鲟鱼样本来自另一项研究，该研究探讨了鱼类对急性热应激的生理反应（Penny等人，2023年）。在那项研究中，研究人员从加拿大新不伦瑞克省金斯顿市的Acadian Sturgeon and Caviar公司获取了2岁的大西洋鲟鱼幼鱼（平均体重122±10.3克；平均体长33.8±0.84厘米）和短吻鲟鱼幼鱼（平均体重136±8.6克；平均体长32.9±1.0厘米），并将它们带到了加拿大新不伦瑞克大学。这些鱼被分为两组：CTmax组和对照组。之后，将两组鱼都适应在10°C的环境中30天。对于CTmax组，研究人员以每分钟0.1°C的速度逐渐提高水温，直到鱼无法保持直立姿势。此时，将鱼从水中取出，在三氯甲基磺酸酯（MS-222；浓度1克/升）和碳酸氢钠（2克/升）缓冲溶液中对其进行麻醉，并通过颈椎脱位的方法实施安乐死，然后收集鳃组织和肝脏组织。对照组中的8条鱼也经历了相同的处理过程，不同之处在于没有水温的升高，这些鱼的样本也以相同的方式被收集和保存。

2.3 RNA提取及cDNA合成
大西洋鲟鱼和短吻鲟鱼的肝脏及鳃样本中的总RNA，以及白鲟鱼的肝脏组织，是使用RNeasy? Plus Micro Kit（Qiagen公司，德国）和PureLink RNA Mini Kits（Invitrogen公司；Ambion Life Technologies）提取的。对于湖鲟鱼的鳃样本，使用TissueLyser（Qiagen公司）以50Hz的频率在各自的裂解缓冲液中处理5分钟，随后按照制造商的说明进行RNA纯化。使用NanoDrop One（Thermo Fisher Scientific公司）仪器测量RNA的浓度和纯度，选择260/230比值在1.7–2之间的RNA以及260/280比值高于1.8的RNA用于cDNA合成。为了检测RNA的完整性，将每个样本中的400 ng RNA加载到1%的琼脂糖凝胶上，以观察18S rRNA和28S rRNA的条带。在cDNA合成之前，使用Invitrogen? ezDNase酶（Thermo Fisher Scientific公司）在37°C下处理1000 ng的总RNA，以去除基因组DNA。处理后的RNA直接用于cDNA合成，方法同样是按照QuantiTect?逆转录试剂盒（Qiagen公司）的说明书进行。

2.4 相对基因表达分析
为了使用通用的Acipenser OpenArray?芯片量化所研究基因的表达情况，将合成的cDNA以1:4的比例稀释于无核酸酶的水中。接着，将2.5 μL的稀释cDNA与2.5 μL的2× TaqMan Real-Time PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific公司，美国）混合。使用QuantStudio? 12K Flex Accufill系统将样品双份加载到芯片上，并按照制造商的说明进行实时PCR检测。通过QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR系统软件评估扩增的质量，选择扩增曲线呈S形且扩增得分大于0.125的样品进行进一步分析。为了计算每个基因的PCR效率，从软件中导出经过基线校正的荧光数据，并使用LinRegPCR（版本2021.2）计算每个反应的效率。对于每个基因，计算出每个物种所有单次反应的平均效率，并在表S2中列出。平均效率值用于应用Pfaffl方法（Pfaffl，2001年）计算相对基因表达。为了测量湖鲟鱼的相对基因表达，将所有处理组的结果与在CTmax试验前适应16°C的对照组样本进行归一化。对于大西洋鲟鱼和短吻鲟鱼，将CTmax组中每个基因的表达相对于各自的对照组进行计算。由于PCR效率较低，某些基因的表达数据被排除在相对表达分析之外，具体包括cam1、mhc1a和atp1a的数据。此外，湖鲟鱼的casp3基因、大西洋鲟鱼的肝脏样本以及短吻鲟鱼的鳃样本也被排除在外。对于大西洋鲟鱼，还排除了tp53、cox1、lipe和ca15基因在肝脏数据中的表达；而对于短吻鲟鱼，则排除了lipe、tp53和cox1基因在鳃数据中的表达。

2.5 统计分析
所有统计分析均使用R 4.3.2软件（R Core Team，2024年）进行。Shapiro–Wilk检验用于评估三个物种处理组数据的正态性。由于个体基因的相对表达不符合正态分布，因此对湖鲟鱼实验的数据进行了对数转换，并使用双向ANOVA（two-way ANOVA）来测量组间的显著差异（p值<0.05），同时考虑了适应温度和CTmax两个影响基因表达的因素。双向ANOVA测试适应温度、CTmax及其交互作用的p值结果列在表S3中。使用Bonferroni校正方法调整p值以控制假阳性结果。对于大西洋鲟鱼和短吻鲟鱼，组间比较采用Mann–Whitney U检验进行。为了检查热应激下的整体转录组变化，对每种物种使用了基于四个内部对照基因标准化的Ct值进行无监督主成分分析（PCA）。

2.6 伦理声明
本研究中使用的样本来自先前的实验，这些实验均获得了曼尼托巴大学（AUP#F15-007）和新不伦瑞克大学（AUP#2018-1S-02）动物护理委员会的批准，符合加拿大动物护理委员会的指导方针。

3 结果
3.1 湖鲟鱼
Bugg等人（2020年）报告的两种湖鲟鱼的CTmax值显示，温尼伯河的鱼比伯恩特伍德河的鱼略高（适应16°C、20°C和24°C的鱼分别达到了0.12°C、0.72°C和0.74°C）（表S4）。在本研究中对这些鱼在CTmax后收集的鳃样本进行分析时，hsp基因在两个湖鲟鱼群体中均表现出最显著的上调（图1a和2a）。hsp70a基因在所有适应温度下均显著上调（变化幅度从323倍到637倍）。同样，适应16°C、20°C和24°C的伯恩特伍德河鲟鱼鳃组织中hsp90a的表达也显著增加（分别增加了19倍、28倍和25倍）。温尼伯河群体的湖鲟鱼样本在CTmax后，hsp90a的表达在16°C、20°C和24°C下也显著上调（分别增加了9.5倍、7.6倍和8.8倍）。而在伯恩特伍德河群体中，适应16°C的鱼在CTmax后hspa4a的表达显著增加（分别增加了2倍、2.7倍和2.8倍）。然而，在温尼伯河群体中，只有适应24°C的鱼在CTmax后hspa4a的表达显著增加（增加了2.87倍）。与其他HSPs不同，适应20°C的温尼伯河群体的hspa8基因在CTmax后表达显著下调（减少了0.43倍）。最后，在温尼伯河群体中，编码冷诱导RNA结合蛋白（CIRBP）的基因在所有三个适应温度下均显著下调（分别在16°C、20°C和24°C下减少了0.35倍、0.36倍和0.45倍）。**

图1：伯恩特伍德河湖鲟鱼（Acipenser fulvescens）群体中，在适应16°C、20°C和24°C后组间表达有显著差异的基因。其中一部分鱼随后接受了CTmax处理。不同生物学过程的基因在不同的面板中展示。每个基因的表达都是相对于16°C适应温度的，不以相同字母标记的组间存在显著差异。组间差异通过双向ANOVA测量得出。为了更好地显示结果，y轴使用了对数刻度。误差条表示标准误差。

图2：温尼伯河湖鲟鱼（Acipenser fulvescens）群体中，在适应16°C、20°C和24°C后组间表达有显著差异的基因。其中一部分鱼随后接受了CTmax处理。不同生物学过程的基因在不同的面板中展示。每个基因的表达都是相对于16°C适应温度的，不以相同字母标记的组间存在显著差异。组间差异通过双向ANOVA测量得出。为了更好地显示结果，y轴使用了对数刻度。误差条表示标准误差。参与能量代谢的基因也受到急性热应激的影响，但其反应因群体和适应温度而异（图1b和2b）。在伯恩特伍德河群体中，CTmax后pck1基因在所有三个适应温度下均上调（分别在16°C、20°C和24°C下增加了3.2倍、6.1倍和1.64倍），但这种上调仅在16°C和20°C下具有统计学意义。在温尼伯河群体中，这种上调仅在适应20°C的鱼中显著（增加了7.3倍）。相比之下，CTmax显著下调了ampk1a（分别在20°C和24°C下减少了0.38倍和0.48倍）、cpt1a（分别在16°C和20°C下减少了0.42倍和0.41倍）以及ghr（在24°C下减少了0.45倍）的表达。ctsd基因在CTmax后的表达没有显著变化，但在适应24°C的温尼伯河群体中，该基因的表达显著增加（增加了2.1倍）。参与渗透调节的基因在两个湖鲟鱼群体中CTmax后也表现出显著变化（图1c和2c）。ca基因在两个湖鲟鱼群体中CTmax后的表达均显著下调，这种下调在两个群体中的幅度分别为0.18倍到0.26倍，且不同适应温度之间的差异不显著。同样，atp6v1ba基因在两个湖鲟鱼群体中CTmax后的表达也显著下调，但这种下调仅在适应16°C和20°C的鱼中具有统计学意义。急性热应激还影响了参与氧化应激反应和异生物质代谢的基因的表达（图1d和2d）。适应20°C和24°C 30天后，两个湖鲟鱼群体中cyp1a的表达均显著降低（与16°C适应温度相比，分别减少了0.36倍和0.24倍）。然而，CTmax显著增加了适应20°C的鱼中该基因的表达（在伯恩特伍德河群体中增加了5倍，在温尼伯河群体中增加了6.3倍；在24°C下增加了14倍）。nfe2基因作为抗氧化基因的调控因子，在两个湖鲟鱼群体中CTmax后表达均下调，但这种变化仅在适应20°C的伯恩特伍德河群体（减少了0.3倍）和适应24°C的温尼伯河群体（减少了0.34倍）中具有统计学意义。在抗氧化基因中，gpx1a在伯恩特伍德河群体中适应16°C（减少了0.31倍）和20°C（减少了0.34倍）以及适应24°C的温尼伯河群体（减少了0.38倍）后表达显著下调。编码SOD的基因中，sod1在伯恩特伍德河群体中适应16°C（减少了0.46倍）和20°C（减少了0.44倍）以及适应24°C的温尼伯河群体（减少了0.32倍）后表达显著下调。cat基因在两个湖鲟鱼群体中CTmax后的表达均下调，但在适应20°C的伯恩特伍德河群体（减少了0.40倍）和适应16°C的温尼伯河群体（减少了0.25倍）中尤其显著。参与细胞凋亡调节的基因在对急性热应激的反应中也表现出下调（图1e和2e）。在适应20°C的Burntwood River种群中，casp9的表达显著下调（下降了0.22倍），而在适应20°C和24°C的Winnipeg River种群中，casp9的表达也分别下调了0.36倍和0.41倍。适应16°C和20°C也显著下调了两种鲟鱼种群中tp53的表达（Burntwood River下降了0.37–0.39倍，Winnipeg River下降了0.39–0.44倍）。hif1ab的表达在适应16°C的Burntwood River种群（下降了0.3倍）和适应20°C的Winnipeg River种群（下降了0.2倍）中显著下调（见图1f和2f）。此外，在急性热应激后，参与糖酵解的基因大多也表现出下调趋势（见图3和4）。唯一一个在CTmax后上调的基因是hk2a；然而，这种上调仅在适应24°C的Winnipeg River种群中显著（上升了2.3倍）。相比之下，hk1a的表达在适应16°C的Burntwood River种群（下降了0.35倍）和适应16°C、20°C（下降了0.38倍）以及24°C的Winnipeg River种群（下降了0.32倍、0.26倍和0.34倍）中显著下调。在Winnipeg River种群中，适应20°C的鱼类中pgk1和pfklb的表达显著下调（pgk1下降了0.61倍，pfklb下降了0.67倍）。图3可在图表查看器中打开。

图1f和2f显示了Burntwood River种群的湖鲟（Acipenser fulvescens）在适应不同温度和急性热应激后52个基因的表达模式。幼年湖鲟被分别适应16°C、20°C和24°C 30天后，其中一部分鱼经历了CTmax。为了生成这些图表，使用定量聚合酶链反应（qPCR）测量每个基因在鳃中的表达，并将Ct值标准化为四个对照基因的平均Ct值以便更好地表示。

图4同样显示了Winnipeg River种群的湖鲟在适应不同温度和急性热应激后52个基因的表达模式。幼年湖鲟被分别适应16°C、20°C和24°C 30天后，其中一部分鱼经历了CTmax。为了生成这些图表，使用定量聚合酶链反应（qPCR）测量每个基因在鳃中的表达，并将Ct值标准化为四个对照基因的平均Ct值以便更好地表示。

急性热应激对免疫系统的影响在促炎基因的表达中更为明显（见图1g和2g）。在Burntwood River种群中，适应20°C的鱼类在CTmax后il8的表达显著下降（下降了0.39倍）。在Winnipeg River种群中，适应20°C和24°C 30天后，il8的表达显著增加（相对于16°C时增加了7–9倍），但在CTmax后这两种适应温度下的表达均下调（下降了0.22–0.23倍），与16°C适应温度下的上调3.3倍形成对比。il1b在适应20°C的Winnipeg River鲟鱼中的表达也显著下调（下降了0.21倍和0.34倍）。此外，mhc2a的表达模式在两个种群中也有所不同。在Burntwood River种群中，随着适应温度从16°C升至20°C，该基因的表达增加了3.84倍；而在Winnipeg River种群中，这一增长幅度分别为14倍和15倍。然而，在CTmax后，mhc2a的表达模式发生了变化：在适应16°C的Winnipeg River种群中显著上调（增加了4.4倍），而在适应20°C的Burntwood River种群中显著下调（下降了0.27倍）。

3.2 大西洋鲟和短吻鲟

Penny等人（2023年）测量的大西洋鲟和短吻鲟的CTmax值显示，大西洋鲟具有稍高的耐热性（0.65°C）（见表S4）。通过对这项实验中采集的样本在CTmax前后的基因表达进行分析，发现急性热应激显著上调了大西洋鲟和短吻鲟鳃组织（分别变化了1476–321倍）和肝组织（分别变化了17–73倍）中的hsp70a的表达（见图5）。同样，hsp90a在两种鲟鱼的鳃组织中（变化了12.5–12倍）和短吻鲟的肝组织中（变化了73倍）也上调。此外，hspa4a在短吻鲟的鳃组织中表达增加（变化了2倍）。在CTmax后，cirbp在大西洋鲟的鳃组织中表达下调（下降了0.8倍），但在短吻鲟的肝组织中表达上调（上升了1.3倍）。

图5显示了大西洋鲟（Acipenser oxyrinchus oxyrinchus）和短吻鲟（Acipenser brevirostrum）在CTmax后52个目标基因在肝和鳃中的相对表达。每种鲟鱼分别被适应10°C，然后经历CTmax。CTmax后的每个基因表达相对于CTmax前的部分鱼（即对照组）进行计算。对照组和CTmax组之间的统计显著性通过Mann–Whitney U检验确定。为了更好地表示，p值和表达倍数变化分别转换为log10和log2。水平虚线表示p值为0.05，垂直虚线表示一次表达变化。在大西洋鲟中，急性热应激显著下调了igfbp1（下降了0.44倍）和igfbp2（下降了0.62倍）在肝中的表达，而在鳃中上调了igf1（上升了2.7倍）、igf2（上升了3倍）、ldha（上升了1.29倍）和pck1（上升了6.9倍）（见图5a,b）。在短吻鲟中，急性热应激显著增加了cpt1a（上升了1.29倍）、pck1（上升了8倍）、igf2（上升了1.74倍）和igfbp2（上升了1.38倍）在鳃中的表达，以及ampk1a（上升了1.91倍）和ctsd（上升了1.92倍）在肝中的表达（见图5c,d）。在大西洋鲟中，ca在鳃（上升了1.39倍）和肝（上升了2.95倍）组织中显著上调。在短吻鲟中，atp6v1ba在肝中的表达显著上升（上升了1.66倍）（见图5c）。在短吻鲟的鳃组织中，没有观察到渗透调节基因的表达显著变化。急性热应激对与异生物质代谢和氧化应激反应相关基因的表达影响在鳃中比在肝中更为明显（见图5）。与湖鲟中的观察结果类似，急性热应激增加了大西洋鲟（3.75倍）和短吻鲟（7.26倍）鳃组织中cyp1a的表达（见图5b,d）。在大西洋鲟中，急性热应激显著上调了glul（上升了4.3倍）和gpx1a（上升了1.9倍）在鳃中的表达；而在短吻鲟中，只有sod1（上升了1.38倍）在CTmax后上调。相比之下，急性热应激并未影响两种鲟鱼肝组织中参与异生物质代谢和氧化应激反应的基因的表达（见图5a,c）。在大西洋鲟的鳃中，casp9的表达在CTmax后显著下调（下降了0.68倍）（见图5b）。相反，bcl2l1-xl在鳃中对急性热应激有显著的上调（上升了1.39倍）。与凋亡相关的基因在大西洋鲟的肝或短吻鲟的鳃或肝组织中均未显示出显著变化。参与糖酵解和厌氧代谢的基因仅在大西洋鲟的肝中上调。在大西洋鲟中，急性热应激显著上调了aldoa的表达（上升了1.6倍）；而在短吻鲟中，slc2a1b显著上调（上升了3.25倍）（见图5a,c）。在大西洋鲟的鳃组织中，急性热应激显著下调了免疫基因tnfa（下降了0.22倍）、mhc2a（下降了0.38倍）和il1b（下降了0.4倍）的表达；而在肝中，il1b（下降了0.5倍）和il8（下降了0.44倍）的表达也下调（见图5a,b）。在短吻鲟中，唯一受CTmax显著影响的免疫基因是tnfa，其在鳃中的表达下降了0.51倍（见图5c,d）。

3.3 主成分分析（PCA）

PCA用于研究所有基因表达在急性热应激下的整体变化，并确定基因表达模式差异的主要驱动因素。PCA显示急性热应激改变了所有三个物种和两种检测组织中的整体基因表达模式（见图6）。在两种湖鲟种群中，适应不同温度在急性热应激前后改变了48个基因的表达模式（见图6a1,b1）。第一个维度解释了所有PCA图中样本间约36.1%–58%的变化（见图6）。第二个维度中基因的贡献与湖鲟鳃组织、大西洋鲟鳃组织和短吻鲟鳃组织间不同温度处理下的差异基因表达更为一致（见图6a2,b2,c2,d2,f2）。相比之下，在短吻鲟的肝组织中，第一个维度中基因的贡献更紧密地反映了不同处理之间的差异基因表达模式（见图6e）。

PCA图显示了三种鲟鱼中研究的52个基因的表达模式的整体相似性，以及每个基因在PC1（Dim1）和PC2（Dim2）中的载荷得分图，展示了每个基因的贡献和方向。湖鲟（Acipenser fulvescens）被适应16°C、20°C和24°C，然后经历CTmax。大西洋鲟（Acipenser oxyrinchus oxyrinchus）和短吻鲟（Acipenser brevirostrum）在CTmax前被适应10°C。使用定量聚合酶链反应（qPCR）测量CTmax前后样本中每个基因的表达。为了生成PCA图，将每个基因的Ct值标准化为四个对照基因的平均Ct值。

4 讨论

本研究开发的跨物种Acipenser OpenArray?芯片能够扩增三种鲟鱼多个功能类别中的大量基因。相对基因表达分析表明，急性热应激改变了免疫系统、代谢、渗透调节、缺氧反应、凋亡、一般应激反应和氧化应激反应中基因的表达模式。这种表达模式受到适应温度、物种和所研究组织的影响。根据检测效率的评估，湖鲟鳃组织中的52个基因、大西洋鲟鳃和肝中的48个基因、短吻鲟鳃中的53个基因和肝中的52个基因适合进行相对表达分析。跨组织和物种，其中46个基因始终适合分析，可以用来评估这些鲟鱼的应激因素。未来的Acipenser芯片版本需要重新设计效率较低的检测方法，直到拥有适用于每个物种和组织的完整56个检测方法。

4.1 热激响应和有氧代谢基因

HSPs是细胞应激的典型标志物，它们的产生由多种因素触发，包括急性热应激（Sharp等人，1999年）。在研究的HSPs中，hsp70a和hsp90a在所有物种和组织的鳃中显著上调（分别变化了1476–321倍和17–73倍）（见图5）。同样，hsp90a在两种鲟鱼的鳃组织中（变化了12.5–12倍）和短吻鲟的肝组织中（变化了73倍）也上调。此外，hspa4a在短吻鲟的鳃组织中表达增加（变化了2倍）。在CTmax后，cirbp在大西洋鲟的鳃组织中表达下调（下降了0.8倍），但在短吻鲟的肝组织中表达上调（上升了1.3倍）。

图5显示了大西洋鲟（Acipenser oxyrinchus oxyrinchus）和短吻鲟（Acipenser brevirostrum）的肝和鳃中52个目标基因在CTmax后的相对表达。每种鲟鱼分别被适应10°C，然后经历CTmax。CTmax后的每个基因表达是相对于CTmax前的部分鱼（即对照组）计算的。对照组和CTmax组之间的统计显著性通过Mann–Whitney U检验确定。为了更好地表示，p值和倍数变化分别转换为log10和log2。水平虚线表示p值为0.05，垂直虚线表示一次表达变化。在大西洋鲟中，急性热应激显著下调了igfbp1（下降了0.44倍）和igfbp2（下降了0.62倍）在肝中的表达，而在鳃中上调了igf1（上升了2.7倍）、igf2（上升了3倍）、ldha（上升了1.29倍）和pck1（上升了6.9倍）（见图5a,b）。在短吻鲟中，急性热应激显著增加了cpt1a（上升了1.29倍）、pck1（上升了8倍）、igf2（上升了1.74倍）和igfbp2（上升了1.38倍）在鳃中的表达，以及ampk1a（上升了1.91倍）、ctsd（上升了1.92倍）在肝中的表达（见图5c,d）。在大西洋鲟中，ca在鳃（上升了1.39倍）和肝（上升了2.95倍）组织中显著上调。在短吻鲟中，atp6v1ba在肝中的表达显著上升（上升了1.66倍）（见图5c）。在短吻鲟的鳃组织中，没有观察到渗透调节基因的表达显著变化。急性热应激对与异生物质代谢和氧化应激反应相关基因的表达影响在鳃中比在肝中更为明显（见图5）。与湖鲟的观察结果类似，急性热应激增加了大西洋鲟（3.75倍）和短吻鲟（7.26倍）鳃组织中cyp1a的表达（见图5b,d）。在大西洋鲟中，急性热应激显著上调了glul（上升了4.3倍）和gpx1a（上升了1.9倍）在鳃中的表达；而在短吻鲟中，只有sod1（上升了1.38倍）在CTmax后上调。相比之下，急性热应激并未影响两种鲟鱼肝组织中参与异生物质代谢和氧化应激反应的基因的表达（见图5a,c）。在大西洋鲟的鳃中，casp9在CTmax后显著下调（下降了0.68倍）（见图5b）。相反，bcl2l1-xl在鳃中对急性热应激有显著的上调（上升了1.39倍）。与凋亡相关的基因在大西洋鲟的肝或短吻鲟的鳃或肝组织中均未显示出显著变化。参与糖酵解和厌氧代谢的基因仅在大西洋鲟的肝中上调。在大西洋鲟中，急性热应激显著上调了aldoa的表达（上升了1.6倍）；而在短吻鲟中，slc2a1b显著上调（上升了3.25倍）（见图5a,c）。在大西洋鲟的鳃组织中，急性热应激显著降低了免疫基因tnfa（下降了0.22倍）、mhc2a（下降了0.38倍）和il1b（下降了0.4倍）的表达；而在肝中，il1b（下降了0.5倍）和il8（下降了0.44倍）的表达也下调（见图5a,b）。在短吻鲟中，唯一受CTmax显著影响的免疫基因是tnfa，在鳃中下降了0.51倍（见图5c,d）。

3.3 主成分分析（PCA）

PCA用于研究急性热应激作用下所有基因表达的整体变化，并确定基因表达模式差异的主要驱动因素。PCA显示急性热应激改变了所有三个物种和两种检测组织中的整体基因表达模式（见图6）。在两种湖鲟种群中，适应不同温度在急性热应激前后改变了48个基因的表达模式（见图6a1,b1）。第一个维度解释了所有PCA图中样本间约36.1%–58%的变化（见图6）。第二个维度中基因的贡献更紧密地反映了湖鲟鳃组织、大西洋鲟鳃组织和短吻鲟鳃组织中不同温度处理之间的差异基因表达（见图6a2,b2,c2,d2,f2）。相比之下，在短吻鲟的肝组织中，第一个维度中基因的贡献更紧密地反映了处理之间的差异基因表达模式（见图6e）。

PCA图显示了三种鲟鱼中研究的52个基因的表达模式的整体相似性，以及每个基因在PC1（Dim1）和PC2（Dim2）中的载荷得分图，显示了每个基因的贡献和方向。湖鲟（Acipenser fulvescens）被适应16°C、20°C和24°C，然后经历CTmax。大西洋鲟（Acipenser oxyrinchus oxyrinchus）和短吻鲟（Acipenser brevirostrum）在CTmax前被适应10°C。使用定量聚合酶链反应（qPCR）测量CTmax前后的样本中每个基因的表达。为了生成PCA图，将每个基因的Ct值标准化为四个对照基因的平均Ct值。

4 讨论

本研究开发的跨物种Acipenser OpenArray?芯片能够在三种鲟鱼物种中扩增多种功能类别的广泛基因。相对基因表达分析表明，急性热应激改变了免疫系统、代谢、渗透调节、缺氧反应、凋亡、一般应激反应和氧化应激反应中基因的表达模式。这种表达模式受到适应温度、物种和所研究组织的影响。根据检测效率的评估，湖鲟鳃组织中的52个基因、大西洋鲟鳃和肝中的48个基因、短吻鲟鳃中的53个基因和肝中的52个此外，pck1在糖异生过程中起着关键的调节作用（Yu等人，2021年），在两种湖鲟种群中都表现出上调。这种pck1的上调也在大西洋鲟和短吻鲟的鳃组织中被检测到，尽管参与糖酵解的基因并未下调。在大西洋鲟的鳃组织中，ldha的表达也有所上调。研究表明，在其他鱼类中，ldha的表达也会因热应激而上调（Cheng等人，2018年）。ldha和pck1的上调可能表明，在急性热应激下，无氧糖酵解和糖异生机制会同时被诱导。然而，在短吻鲟的鳃组织中，cpt1a的表达却上调。cpt1a编码的蛋白质是脂肪酸氧化的关键限速酶（Schlaepfer & Joshi，2020年）。cpt1a表达的增加可能表明线粒体中对长链脂肪酸的氧化作用增强。总体而言，参与代谢的基因表达模式的变化显示，急性热应激会导致能量资源（如细胞内葡萄糖）的消耗，因为细胞会转向效率较低的ATP生成途径和无氧代谢。这种葡萄糖的消耗最终可能导致使用替代能源（如脂质），以及从非碳水化合物前体生成葡萄糖。在短吻鲟的肝脏中，ampk1a的表达也上调。由于ampk1a在细胞中作为能量传感器发挥作用，并且其激活依赖于AMP/ATP和/或ADP/ATP比例的增加（Ke等人，2018年），其上调可能是由于急性热应激期间ATP产生减少或需求增加的迹象。这种上调与slc2a1b和ctsd的上调并存，这可能是细胞为了增加葡萄糖的摄取和通过蛋白质分解来产生能量的策略。葡萄糖通常以糖原的形式储存在肝脏中，在应激条件下，糖原可以通过糖原分解作用被释放（Adeva-Andany等人，2016年；Rabasa & Dickson，2016年）。在受到热应激的水生物种中，已经报告了肝脏中糖原水平的下降以及ATP酶水平的升高（Han等人，2023年）。本研究中的这些对急性热应激的反应表明，短吻鲟的肝脏对ATP的需求增加，从而上调ampk1a以通过分解蛋白质、运输葡萄糖和糖原分解来为细胞提供能量储存分子。

4.2 氧化应激反应和凋亡

在多种鱼类中，观察到了具有抗氧化性质的基因（如gpx、sod和cat）的表达变化，这些变化发生在热应激之后（Liu等人，2024年；Roychowdhury等人，2021年）。在本研究中，所有三种物种的鳃组织在CTmax后都表现出cyp1a的表达上调。该基因在多芳烃的代谢中起着重要作用，通常通过激活芳香烃受体（Ah-R）来上调（Collier & Pritsos，2003年），同时它还参与抗炎分子（如环氧二十碳三烯酸）的生成，并通过细胞信号传导和免疫系统帮助维持正常的生理功能（Stading等人，2020年）。本研究及类似研究中还观察到促炎细胞因子（如白细胞介素）的上调（Guo等人，2023年；Liu等人，2022年；Pérez-Casanova等人，2008年；Zhao等人，2024年），这可能是由cyp1a上调引发的。虽然大西洋鲟的鳃组织中glul的表达上调，但在适应24°C温度的温尼伯河湖鲟的鳃组织中，其表达显著下调。glul编码的谷氨酸-氨连接酶是解毒氨的重要酶（Ip & Chew，2010年；Marginean等人，2013年）。据报道，在水生动物中，谷氨酸合酶的表达会因氨浓度的升高而上调（Banerjee等人，2018年；Liu等人，2014年）。由于温度升高会增加鱼类中氨的产生和排泄（Kieffer & Wakefield，2009年；Zheng等人，2008年），因此这种基因的上调可能是大西洋鲟对氨产生和释放增加的解毒反应。相比之下，温尼伯河湖鲟的鳃组织中其他氧化应激响应基因（如cat、gpx1a、nfe2、sod1和sod2）的表达下调，这可能表明这些细胞在急性热应激下的解毒能力减弱。然而，大西洋鲟和短吻鲟的鳃组织中，gpx1a和sod1的表达分别上调。这种增加可能是对过氧化氢或超氧阴离子生成增加的反应，这种现象已在多种鱼类中得到报道（Chen等人，2021年；Dash等人，2023年；Liu等人，2022年；Yu等人，2017年）。肝脏中氧化应激响应基因的表达没有显著变化，表明该器官对急性热应激的氧化应激反应敏感度较低或ROS的产生较少。在湖鲟中，急性热应激显著下调了促凋亡基因casp9和tp53的表达，尽管适应较高温度后30天内这些基因的表达有适度上调。在大西洋鲟的鳃组织中还观察到casp9的显著下调和bcl2l1-xl的上调。casp9编码的蛋白质在激活tp53依赖的凋亡过程中起重要作用（Wu & Ding，2002年）。然而，bcl2l1-xl是一种抗凋亡蛋白，通过调节ROS的产生来帮助细胞存活（Loo等人，2020年）。casp9和tp53的下调以及bcl2l1-xl的上调可能是急性热应激期间凋亡减少的迹象。

4.3 免疫响应基因

据报道，适应更高温度会降低湖鲟对病原体的免疫系统反应（Bugg等人，2023年）。然而，适应更高温度增加了两种湖鲟种群中mhc2a的表达，尽管这种增加仅发生在20°C的适应温度下（Burntwood River种群）。主要组织相容性复合体（MHC）II类通常由胸腺上皮细胞或抗原呈递细胞产生，其他细胞除非受到感染、炎症或创伤诱导的ifng刺激，否则不产生这种蛋白质（Reith等人，2005年）。同样，il8在两种种群中也表现出与mhc2a相似的上调模式。适应较高温度（20°C）后，湖鲟中报告了免疫响应基因（如myd88、c3和溶菌酶c）的上调；然而，适应较高温度的鱼类在暴露于细菌脂多糖（LPS）后，il1b的表达降低（Bugg等人，2023年）。此外，在适应24°C的Burntwood River种群中，il1b的表达显著下调。白细胞介素是一类具有促炎作用的蛋白质（Secombes等人，2011年）。这些基因表达的显著变化，以及鳃中mhc2a的上调，可能是鳃组织对急性热应激的炎症反应的迹象。在Burntwood River种群中，急性热应激导致il1b的表达下调；而在Winnipeg River种群中，il8的表达也下调。大西洋鲟的鳃组织中，il1b、tnfa和mhc2a的表达显著下调，而在肝脏中，il1b和il8的表达也下调。在短吻鲟中，尽管tnfa显著下调，但il1b和il8在鳃中的表达上调，肝脏组织中参与免疫系统的基因表达没有显著变化。il1b、il8和tnfa等基因编码的细胞因子在免疫系统中具有重要作用，尤其是在炎症过程中（Demir，2022年）。这些蛋白质通常由白细胞或其他非免疫细胞在炎症期间产生，通过激活其他白细胞、诱导其他细胞因子、抑制中性粒细胞粘附于血管内皮以及刺激血管生成等方式发挥作用（Koper-Lenkiewicz等人，2022年）。本研究中鲟鱼这些基因的差异表达模式可能归因于不同物种对热应激引起的炎症敏感性差异。

5 结论

总的来说，这些分子反应展示了鲟鱼物种对于热应激的不同反应，但也揭示了不同鲟鱼物种和种群共同采用的应对这一关键压力因子的机制。用于测量这些反应的实验方法在所评估的物种中具有广泛适用性，可用于评估不同生物学机制下的热应激反应。特别是，在所有研究中的鲟鱼中都观察到了HSPs的上调和大多数参与氧化应激反应及凋亡的基因的下调，这些现象可能作为热应激的生物标志物，尤其是在鳃组织中。基于鳃的检测方法可以用于非致命性评估鲟鱼对急性热应激的反应，并为未来研究或监测受威胁的野生种群提供新的见解。此外，本研究中涉及免疫响应或代谢的基因的物种特异性表达模式显示，不同物种和种群对热应激的生理反应不同，这可能表明在制定管理决策时需要考虑物种特性。

作者贡献

K.M.J.和N.J.B.参与了资金获取，参与了基因选择和Acipenser OpenArray?芯片的开发，并监督了研究工作。W.S.B.设计并进行了湖鲟的实验。F.M.P.和S.A.P.设计并进行了大西洋鲟和短吻鲟的实验。H.H.和K.M.设计并测试了OpenArray?芯片的引物和探针。H.H.进行了OpenArray检测，分析了数据并撰写了初稿。所有作者都阅读了手稿并提供了评论。

致谢

作者感谢Genome Canada资助的GEN-FISH项目和NSERC Discovery Grant对KMJ的资助。我们还要感谢Mark Shrimpton提供白鲟样本以用于引物测试。同时感谢曼尼托巴大学和新不伦瑞克大学的动物饲养设施工作人员的帮助。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

支持本研究发现的数据可向通讯作者索取。由于隐私或伦理限制，数据未公开。