利用吸收、偏振内禀发射和散射（APIES）技术实时监测蛋白质-脂质体相互作用动力学：对蛋白质晕的形成机制的探究

《Nanoscale》：Real-time monitoring of protein–liposome interaction kinetics using absorption, polarized intrinsic emission, and scattering (APIES): insights into protein corona formation

　　脂质体的稳定性受到它们进入生物环境后快速蛋白质吸附的强烈影响。这种动态的“蛋白质冠层”改变了膜的性质、渗透性和循环行为。蛋白质与脂质体相互作用的早期阶段以及涉及的具体过程并不经常被研究。为了填补这一空白，我们报告了首次应用同时吸收、偏振内散射（280纳米激发）和散射（APIES）光谱技术，并结合快速混合，以实现实时、二级分辨率地监测人血清白蛋白（HSA）与1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DMPC）脂质体（直径约150-160纳米）在离子强度不同的碳酸氢铵缓冲液（25至150毫摩尔/升）中的相互作用。动态光散射（DLS）和纳米粒子追踪分析（NTA）被用来测量粒子大小分布（PSD）的变化。APIES清楚地显示了一个三阶段相互作用过程：首先是快速的（0-200秒）蛋白质吸附阶段，没有渗透和渗透压引起的尺寸减小（约5-10%）；其次是渗透阶段（长达约30分钟），HSA进入脂质双层；最后是退火阶段（长达3小时），HSA-DMPC粒子的尺寸逐渐增大（约2-5%）。APIES通过恒定的吸光度（即没有蛋白质损失）、最小的光谱变化，但荧光带面积与瑞利-米散射带面积的比率（AFI/Ry）略有减小来表征第一阶段。第二阶段显示出恒定的吸光度、AFI/Ry的最小变化，但相对较大的蓝移（表明色氨酸环境的变化）。最后阶段显示出恒定的吸光度、AFI/Ry的逐渐增大（与粒子尺寸成线性相关）以及荧光强度的最小变化。APIES还通过AFI/Ry清楚地分辨出由于离子强度不同而产生的差异（电静力屏蔽效应），在25毫摩尔/升时减少了约20%，而在100-150毫摩尔/升时3小时后减少不到5%，以及高色散光谱位移（25毫摩尔/升时5.9±1.2纳米，150毫摩尔/升时3小时后3.0±1.2纳米）。DLS确认HSA-DMPC混合物在混合后200秒内显著减小，之后尺寸逐渐增大。NTA证实了离子强度对HSA-脂质体复合物尺寸和PSD的影响。

1. 引言

磷脂质体作为体外和体内的药物载体具有广泛的应用潜力。然而，当脂质体（或其他基于脂质的纳米粒子）被注射到含有多种复杂生物分子的真正生理环境中时，会发生多种相互作用。其中最重要的是蛋白质（如白蛋白）与脂质体表面的相互作用，形成“蛋白质冠层”。这一普遍原理最早由Vroman在1962年提出，表明蛋白质在较大颗粒表面的结合和解离是时间依赖的，由此提出了“蛋白质冠层”是一个随时间演变的动态实体。因此，形成在药物载体脂质体上的蛋白质冠层将影响其在体内的行为，尤其是在注入血液后。已有大量文献记录表明，纳米粒子（NPS）的物理化学性质、蛋白质来源以及环境因素（如蛋白质类型和浓度、溶液pH值和离子强度）共同塑造了蛋白质冠层。缓冲系统也起着关键作用，通过调节粒子大小、膜流动性和刚性来最小化蛋白质聚集同时保持脂质体稳定性。研究表明，增加盐浓度可以增强双层膜的刚性，从而稳定蛋白质的天然构象。

血浆成分显著影响脂质体的渗透性和稳定性，导致负载物的泄漏。例如，血清和某些成分会导致磷脂酰胆碱脂质体中捕获的染料在几秒钟内迅速丢失，这与结构变化有关。通常，关于蛋白质与脂质体相互作用的研究是在30分钟或更长时间的孵育后进行的，主要关注尺寸变化、组成或表面性质的变化。这是因为已知复杂的蛋白质冠层在注射后很快就会形成。然而，这意味着冠层形成的初始阶段（最初的几分钟）通常没有被测量或报道，这代表了一个重要的知识空白。蛋白质与脂质体（及其他脂质纳米载体）的结合会重塑双层结构并改变胶体行为，通常会导致尺寸分布的变化。可以使用动态光散射（DLS）和纳米粒子追踪分析（NTA）来监测尺寸变化。DLS是非破坏性的且相对快速，但由于它是基于强度加权的整体方法，在多分散样本中对大颗粒有偏倚，尺寸分辨率较差，无法提供真实的粒子大小分布（PSD）。NTA通过对单个颗粒进行数量加权追踪，提供了更准确和真实的PSD。不幸的是，它通常需要样品稀释（可能会改变动态平衡），需要足够高的颗粒-分散剂光学对比度，并且对生物源颗粒的尺寸限制大约为50纳米。

2. 实验

2.1 材料

1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DMPC）（850345P-200毫克，批号850345P-200 MG-B-282）购自Avanti Polar Lipids。HSA（A1887，批号SLMBM7779 V）购自Sigma Aldrich。氯仿（99%+, Extra Pure）和乙醇（99%+, Absolute, Extra Pure）购自Fisher Chemicals。NH4HCO3购自Fisher Chemicals，用于制备离子强度分别为25、50、100和150毫摩尔/升的碳酸氢铵（ABC）缓冲液，pH值约为8.0。所有材料均按接收状态使用。通过改变NH4HCO3的浓度来调整离子强度，未添加NaCl或其他盐类。使用校准的pH计测量缓冲液的pH值，并根据需要用稀NH4OH或稀醋酸调整至约8.0。

2.2 样品制备

在每种ABC缓冲液（25、50、100和150毫摩尔/升）中分别制备HSA储备溶液（5毫克/毫升），然后通过0.2微米膜过滤器（Whatman Cat. No. 6780-1320）过滤。所有后续较低浓度的HSA样品通过将这些过滤后的储备液稀释相应的ABC缓冲液来制备。准确称量约7毫克的DMPC脂质粉末到一个玻璃烧瓶中，并加入足够的氯仿以溶解并制备10毫克/毫升的溶液。然后在室温下减压蒸发有机溶剂约12小时，形成干燥的薄脂质膜。将得到的脂质薄膜重新悬浮在所需的ABC缓冲液中。使用Avanti mini-extrusion kit在25°C（即DMPC的相变温度以上）和200纳米聚碳酸酯过滤器（Whatman, 800281）通过挤出法制备大单层脂质体。对于每个实验条件，使用相同的ABC缓冲液从相应的储备液稀释脂质体。这种方法确保了所有实验过程中缓冲液成分、离子强度和pH条件的一致性。脂质与脂质体与蛋白质的比例计算在（表S1，补充信息）中。

2.3 方法

2.3.1 APIES分析

APIES测量使用Horiba Aqualog分光光度计（Horiba, Piscataway, NJ, USA）进行，该仪器配备了手动操作的线栅偏振器（Thorlabs）、温度控制的单比色皿架和快速混合附件（SFA-20, TgK Scientific Limited, UK）。APIES数据以每秒一次的曝光时间收集，使用固定的280纳米激发波长和240-800纳米的固定发射范围，光谱分辨率为0.41纳米。所有测量均在25°C的温度下使用Alpha RA 8恒温循环器（LAUDA, Germany）进行。光谱采用两种不同的偏振配置收集：垂直-垂直（VV）和垂直-水平（VH），并自动减去缓冲液空白光谱。这些研究未进行G因子校正，因此VH测量被视为准垂直偏振。所有吸光度测量都是使用垂直偏振光进行的。一个有用的参数是荧光与瑞利-米散射比率（AFI/Ry），通过计算荧光带面积（290-450纳米）与瑞利-米散射带面积（270-290纳米）的比率来获得。这使用Spectragryph v1.2软件包（F. Menges, Germany）完成，优先使用面积而不是简单的最大带强度，以减少颗粒引起的强度波动的影响。

2.3.2 颗粒大小分析

颗粒大小测量在25°C下使用Zetasizer Nano ZS90（Malvern Analytical Ltd, UK）的DLS进行，采用173°后向散射模式，样品置于石英比色皿中，水作为分散剂。分析使用Cumulants拟合来提取Z-平均流动直径（Dh）和多分散指数（PDI），以及分布拟合来提取更多关于样品多分散性的信息。所有这些都是使用Zetasizer软件V7.13完成的。对于HSA分析，使用标准蛋白质模型；对于脂质体分析，使用标准通用模型。每种情况下进行了10次20秒的运行，每个HSA和脂质体起始材料分别进行了六次重复实验。对于混合物，使用标准通用模型，进行单次10秒的测量，并对每次反应进行超过100次的连续测量。

ζ-电位测量使用Anton Parr Litesizer DLS 500（Anton Paar GmbH, Graz, Austria）进行，数据分析使用板载Kalliope Pro Ver. 4.4.0软件。每个样品测量三次，每次测量持续10分钟。HSA-脂质体样本仅在被孵育3小时后进行测量，因为此时样本被认为相对稳定。

2.4 监测蛋白质-脂质体相互作用

HSA和脂质体溶解在ABC缓冲液中，混合后的最终浓度分别为1 mg/mL的HSA和0.25 mg/mL的DMPC脂质体（HSA:脂质体比例=6563:1至9615:1，见表S1，补充信息）。首先，使用大约20 mL的缓冲液冲洗快速混合系统以去除任何残留的气泡。随后用HSA溶液（2 mg/mL溶于缓冲液中）进一步调节系统。然后将HSA（2 mg/mL）和脂质体（0.5 mg/mL）溶液分别装入两个驱动注射器中。在去除残留气泡后，同时触发驱动注射器以确保溶液快速混合，多余的溶液被导入废液注射器中。为了补偿驱动注射器和观察细胞之间管中的大约1.0 mL的引入口体积，每次测量前首先快速进行四次连续的驱动注射器注射以冲洗系统，并在第五次注射后立即收集数据。使用不同次数的注射进行测试（数据未显示）表明，在4次或5次注射后可以获得一致的数据和最佳的混合效果。每种蛋白质-脂质体相互作用在3小时内进行分析，在不同的时间点收集APIES数据。APIES测量使用1秒的积分时间，积分间隔时间等于积分时间本身。当总运行时间设置为50秒时，每次运行产生51个数据点。因此，在前100秒内，测量是通过两个连续的批次实验进行的，每个批次持续50秒，在相同的实验条件下进行。接下来的30分钟内，以1秒的间隔收集APIES数据（50个光谱）。随后，在设定的时间点记录数据：1小时、1.5小时、2小时、2.5小时，最后是3小时。在每种情况下，收集了50个1秒曝光的光谱，并对这些数据进行了平均处理。每种蛋白质-缓冲液组合都在不同的日子里独立测试了三次，使用的是新制备的脂质体。同时，我们尝试使用DLS测量HSA-脂质体混合物的粒径变化。样品通过在石英比色皿中加入500 μL的HSA（2 mg/mL），然后迅速加入等量的（500 μL）脂质体（DMPC，0.5 mg/mL）来制备。在比色皿中彻底混合后，将其插入DLS系统，并立即开始数据收集，无需任何平衡时间（添加和测量开始之间的时间约为10秒）。每次测量运行持续10秒。与APIES测量使用的时间间隔相同：0-0.5小时（连续10秒的DLS测量），30-60分钟（连续10秒的DLS测量）。对于1.5小时、2小时、2.5小时和3小时的时间点，分别进行了一系列20次10秒的测量。NTA使用NanoSight Pro（Malvern Instruments，英国）进行，采用488纳米的激光激发，通过斯托克斯-爱因斯坦方程计算单个粒子的粒径。对于HSA-脂质体混合物，在Eppendorf试管中迅速将1.0 mL的HSA（2 mg/mL）与1.0 mL的DMPC脂质体（0.5 mg/mL）混合，并在恒定25°C下孵育。在0.5小时、1.0小时、1.5小时、2.0小时、2.5小时和3.0小时时收集等分样品，然后以1:1000（v/v）的比例稀释在缓冲液中，再注入NTA细胞进行分析。每次测量包括5个11.5秒的视频（每秒65帧），平均每个帧捕获20到60个粒子。所有蛋白质-缓冲液组合都在不同的日子里独立测试了三次，使用的是新鲜制备的脂质体。同时，我们尝试使用DLS测量HSA-脂质体混合物的粒径变化。样品通过在石英比色皿中加入500 μL的HSA（2 mg/mL），然后迅速加入等量的（500 μL）脂质体（DMPC，0.5 mg/mL）来制备。在比色皿中彻底混合后，将其插入DLS系统，并立即开始数据收集，无需任何平衡时间（添加和测量开始之间的时间约为10秒）。每次测量运行持续10秒。使用与APIES测量相同的时间间隔：0-0.5小时（连续10秒的DLS测量），30-60分钟（连续10秒的DLS测量）。对于1.5小时、2小时、2.5小时和3小时的时间点，分别进行了20次10秒的测量。NTA使用NanoSight Pro（Malvern Instruments，英国）进行，采用488纳米的激光激发，通过斯托克斯-爱因斯坦方程计算粒径。对于HSA-脂质体混合物，在Eppendorf试管中迅速将1.0 mL的HSA（2 mg/mL）与1.0 mL的DMPC脂质体（0.5 mg/mL）混合，并在恒定25°C下孵育。在0.5小时、1.0小时、1.5小时、2.0小时、2.5小时和3.0小时时收集等分样品，然后以1:1000（v/v）的比例稀释在缓冲液中，再注入NTA细胞进行分析。每次测量包括5个11.5秒的视频（每秒65帧），平均每个帧捕获20到60个粒子。统计分析（单因素或双因素方差分析（ANOVA）使用GraphPad Prism版本10（GraphPad Software，加利福尼亚州圣地亚哥）进行，详细的统计分析部分包含在补充信息S-12中。所有定量数据表示为三次独立实验的平均值±标准差。

3. 结果与讨论

使用快速混合附件的APIES来监测在不同离子强度条件下HSA-脂质体相互作用的动力学。在比色皿内手动混合被发现是不一致的，在混合后的前200秒内产生了不可靠的测量结果。偏振技术能够调节灵敏度，其中PIESVH光谱测量最小化了瑞利-米散射的贡献，提供了更清晰和更真实的荧光发射表示，而在PIESVV光谱中，瑞利-米散射带得到了增强，使得这种偏振对粒径、浓度和分布的变化更加敏感。这里使用的缓冲液减法程序有效地仅去除了瑞利散射（即分子光散射），因此记录的瑞利-米带应该主要由米（即粒子）散射光组成。因此，当我们讨论（光）散射时，它仅指米/粒子散射。在这里，参数如：发射最大值（λmax）、发射强度、带轮廓以及同时测量的吸光度提供了这些相互作用在更长时间尺度上的更全面表征方法。通过DLS进行了粒径和zeta电位的分析，以提供关于相互作用的补充尺寸信息。

3.1 原料表征

我们首先表征了在不同离子强度下的ABC缓冲液溶液中脂质体（Lip.）和HSA的尺寸、zeta电位和最大发射波长（λmax）（表1）。选择这些参数是因为众所周知，静电相互作用和流体力学性质（粘度和扩散）都会影响相互作用过程。随着离子强度从25毫摩尔增加到150毫摩尔，HSA的粒径（Z-Average）（约10 ± 1纳米）和脂质体（148 ± 8纳米至约163 ± 10纳米）基本保持恒定。纳米粒子跟踪分析（NTA）证实了这一点，因为随着离子强度的变化，脂质体的尺寸分布没有显著变化（见图6A，下文）。HSA的多分散性（PDI）随着离子强度的增加而略微降低，从0.29 ± 0.03降低到0.26 ± 0.02，而脂质体的PDI始终较低（约0.1）。较高的HSA多分散性表明存在一些寡聚物或聚集物，因此需要对DLS数据进行分布拟合（见补充信息S1和S2）。这是因为用于生成Z-average参数的累积量拟合会产生这个代表整个粒子群体的单一平均尺寸，但由于DLS的强度加权性质，这种拟合会受到较大粒子的偏倚。这导致对于多分散样品的拟合不规则，因此它不是跟踪尺寸变化的准确参数。表1展示了不同缓冲液（25、50、100和150毫摩尔）中HSA和脂质体的尺寸和光谱特征数据。

离子强度
25毫摩尔
50毫摩尔
100毫摩尔
150毫摩尔

HSA
Z-Average (nm)
10.3 ± 0.7
10.4 ± 0.6
10.4 ± 0.2
10.1 ± 0.1

PDI
0.29 ± 0.03
0.28 ± 0.01
0.27 ± 0.01
0.26 ± 0.02

Peak 1 (dist.) (nm)
8.7 ± 0.3
9.3 ± 1.3
9.3 ± 0.6
9.3 ± 0.7

Pk 1 area int (%)
77.1 ± 5.5
79.0 ± 5.2
79.0 ± 3.3
80.5 ± 4.3

D (μ2 s?1)
48.0 ± 3.0
47.6 ± 2.5
47.4 ± 0.7
48.8 ± 0.6

Zeta potential (mV)
?15 ± 2.7
?17 ± 2.7
?14 ± 1.9
?9 ± 2.0

VV λmax (nm)
333.3 ± 0.3
333.3 ± 0.1
332.5 ± 0.5
333.4 ± 0.2

VH λmax (nm)
335.1 ± 0.3
334.8 ± 0.4
335.0 ± 0.2
335.1 ± 0.3

Liposomes
Z-Av. (nm)
150 ± 5
156 ± 10
148 ± 8
163 ± 5

PDI
0.12 ± 0.01
0.11 ± 0.01
0.11 ± 0.01
0.11 ± 0.02

Peak 1 (dist.) (nm)
173 ± 7
178 ± 12
169 ± 9
184 ± 4

Pk 1 area int (%)
100.0 ± 0.0
100.0 ± 0.0
100.0 ± 0.0
100.0 ± 0.0

D (μ2 s?1)
3.3 ± 0.1
3.2 ± 0.2
3.3 ± 0.2
3.0 ± 0.1

Zeta potential (mV)
?2 ± 0.6
0.7 ± 0.8
2.4 ± 0.9
2.3 ± 0.2

直径（Z-Av.，nm）、PDI、峰值1（nm）、峰值1面积强度百分比（峰值1面积积分）、D（μ2 s?1）、zeta电位（mV）和最大发射波长（λmax）在垂直-垂直（VV）和垂直-水平（VH）偏振配置下的数据。数据以平均值±标准差（n = 3天）表示。脂质体尺寸的变异性（以重复运行的标准差报告）归因于独立脂质体制备的批次间差异。对于每组实验，脂质体都是在不同的日子里新鲜准备的。同一DLS数据的强度分布拟合显示，离子强度对它们的影响相对较小。在这里，峰值1是存在的小分子物种，这个峰值的相对面积的变化是聚集程度的良好诊断指标。对于HSA，随着离子强度的增加，峰值1的尺寸和面积没有显著变化（都在误差范围内）。DMPC脂质体都是单分散的，且随着离子强度的增加尺寸略有增加：分布拟合显示峰值1从约169纳米增加到184纳米（这在统计上不显著，p > 0.05，详见补充信息）。对于脂质体，关于PC双层（POPC/DPPC/DMPC类似系统）的实验和模拟研究表明，盐诱导的有序/硬化减缓了脂质扩散，这与此处观察到的尺寸趋势一致。

对于HSA，在25至100毫摩尔的离子强度范围内，zeta电位保持大致恒定，在150毫摩尔时变得不那么负（pH约为8.0）（表1）。这可以归因于表面电荷密度的屏蔽，因为HSA带有负电荷，等电点（PI）约为4.8。对于脂质体，随着离子强度的增加，zeta电位逐渐增加，这与之前关于两性离子脂质系统的发现一致。这些研究表明，尽管净电荷为零，PC头基团由于在膜界面的不对称取向和水化层的结构，可以产生非零的表面电位。Garcia-Manyes等人报告称，DMPC囊泡在超纯水中表现出负的zeta电位（?12.0 ± 1.6 mV），随着离子强度的增加，这个值逐渐向正值偏移。需要注意的是，测量的zeta电位并不直接代表实际的表面电荷，而是Stern层和扩散层边界之间的静电势。因此，它提供了表面电位的一个有用的近似值，有助于解释观察到的相互作用。对于所有离子强度，HSA的发射最大值（λmax）在两种偏振状态下基本保持不变，VV约为333纳米；VH约为335纳米（表1），表明在此范围内离子强度不会显著改变HSA单个Trp的微环境（即，荧光团周围的极性/溶剂松弛没有可检测的变化）。VH光谱与VV光谱相比，λmax有大约2纳米的红色位移，这是由于偏振分辨测量中的检测几何形状：垂直（VH）偏振捕获了经历了更大取向去极化和溶剂松弛的荧光团的发射，这些通常与稍长波长的发射相关。这种小的VH > VV偏移是荧光各向异性测量的一个公认特征，其中没有应用G因子仪器响应（如本例）。

3.2 脂质体-HSA相互作用

为了研究动态的、时间依赖的蛋白质晕演变，我们使用了APIES数据，并与DLS测量进行了交叉参考。总体而言，APIES和DLS分析表明蛋白质-脂质体相互作用经历了三个动力学上不同的阶段：最初的快速吸附阶段（0-200秒），随后是渗透阶段（大约200-1800秒），然后是退火阶段（1-3小时）。发射与瑞利-米散射带面积的比值（AFI/Ry）是一个特别敏感的参数，用于区分细微的尺寸相关变化，而蛋白质发射的光谱位移与结构和环境变化有关。为了比较不同实验条件下的结果，并消除由仪器响应或灯强度引起的绝对信号强度的变化，我们通常使用标准化的AFI/Ry比值，其中值相对于初始时间点（t = 0）进行缩放，从而可以直接比较不同条件下的相对变化。由于每个单独的实验使用了新鲜的脂质体制备，这导致每次实验使用的脂质体大小略有不同。这些结果是导致实验中报告的误差条的重要原因，应通过批量生产脂质体来减少这些误差。

3.2.1 初始混合和吸附（0–200秒）

混合后立即，每秒使用单一280纳米激发波长和固定偏振（通常是VV）收集APIES数据。由于偏振器是手动操作的，因此需要单独的实验来收集不同偏振下的APIES数据。混合后的前50秒内，VV（图1A）和VH发射光谱（图1B）几乎没有变化。VV和VH光谱之间的主要区别在于对瑞利-米氏散射带的影响（图1C），在VH测量中这种效应不存在（由于偏振器交叉），从而提供了更清晰的发射光谱（图1D）。

图1显示了混合后前50秒内收集的HSA-脂质体相互作用的APIES光谱（280纳米激发）：(A) VV偏振，PIESVV；(B) VH偏振，PIESVH；在整个观察相互作用期间收集的平均PIES光谱：(C) 显示瑞利-米氏散射和内在荧光的PIESVV光谱，并突出了发射峰值的蓝移（λmax）；(D) 显示内在荧光和随时间变化的蓝移的PIESVH光谱。为了更清晰地显示信号变化，我们绘制了归一化荧光，通过将发射强度相对于t0时的初始强度进行缩放得到。混合后的前200秒内，VV（图2A和图S3B，补充信息）和VH光谱（图2B）的荧光强度都有轻微（约5%）下降，而发射峰值（λmax）保持不变（图2C/Fig. 2D）。这伴随着瑞利-米氏散射强度的轻微下降，介于4%到8%之间（图S3A，补充信息）。与VV相比，VH配置下观察到的较低发射强度是预期的，这是由于荧光发射的偏振特性造成的。在垂直偏振激发下，荧光团优先被激发，其跃迁偶极矩沿着激发偏振方向排列。因此，平行于激发偏振（VV）检测到的发射荧光通常高于垂直于激发偏振（VH）检测到的荧光，尤其是对于缓慢旋转的大分子或颗粒。此外，瑞利/米氏散射也依赖于偏振，在VV配置下更强，而在VH配置下减弱。因此，VV和VH之间的观察差异反映了系统的固有偏振行为，而不是样品浓度的任何差异。总体而言，这表明蛋白质要么没有与脂质体相互作用，要么只是表面吸附。280纳米处的吸光度也进行了监测，在此期间几乎没有变化（图2E和图S3C，补充信息），这表明所有蛋白质都保持溶解状态或在脂质体表面，且没有显著的离子强度效应。此外，归一化的AFI/Ry比率（VV偏振）也没有显著变化，<4%（图2F），然而，趋势依赖于离子强度。变化顺序不同，因为吸光度的变化主要是由于蛋白质含量（以及少量散射光的贡献），因此相对恒定，而AFI/Ry比率报告了发射和光散射的变化，这些变化由于离子强度对蛋白质在表面的吸附影响而更加显著。归一化的AFI/Ry比率随时间逐渐变化，在25 mM时降至0.97，在50 mM时升至0.99，在100 mM和150 mM时升至约1.01，这表明存在某种受离子强度调节的相互作用。我们提出，这与下面的数据一致，即HSA快速吸附在表面上，但不会穿透表面。这种吸附导致发射淬灭（图2A/Fig. 2B），因为HSA分子在表面更为集中，AFI/Ry比率的差异与相互作用的强度有关，这种强度受到电荷屏蔽的影响，并依赖于离子强度（见下文）。图2显示了在不同离子强度下混合HSA和脂质体后0–200秒内光谱性质随时间的变化：(A) 归一化的VV荧光强度（曲线下面积）；(B) 归一化的VH荧光强度（曲线下面积）；(C) VV激发下的发射峰值（λmax）；(D) VH激发下的发射峰值（λmax）；(E) 归一化的吸光度，以及(F) 归一化的AFI/Ry比率。另见图S3，补充信息。我们尝试在最初的200秒内进行时间分辨（10秒连续采集）尺寸测量，但这些测量产生了不准确的尺寸信息，并伴有较大的误差（图S4，补充信息）。这是因为三个原因：首先是其时间分辨率较差（每次测量至少10秒），其次需要平均多次测量以获得准确的尺寸数据，第三是由于其区分具有相似流体动力学尺寸的物种的能力有限（见补充信息中的双峰讨论）。然而，DLS确实提供了一个非常可靠和准确的参数，即通过派生计数率（DCR）测量的散射光强度（米氏散射或颗粒散射）。这是校正了衰减器设置的信号，代表了632.8纳米处实际散射光强度的准确测量，这取决于颗粒大小和颗粒数量。尽管对于所有离子强度，DCR下降了约30–35%（图3A和图S4A，补充信息），但这个结果本身不足以证明HSA-脂质体组装体的流体动力学尺寸减小。这种DCR的下降也可能归因于材料损失，但在这里并没有发生，因为吸光度信号（也包括来自脂质体的散射光贡献）没有减小。因此，DCR的下降很可能是由于颗粒尺寸减小（也见第1.5节，补充信息了解更多细节）。图3显示了HSA脂质体混合后前200秒的DLS数据：(A) 归一化的DCR随时间的变化；以及(B) 归一化的直径（Z-average，nm）随时间的变化。所呈现的数据是每种离子强度条件下三次独立实验的平均值和标准差。也有可能是由于HSA和脂质体的折射率之间存在显著差异而引起光学平滑效应，从而导致光散射减少。当HSA吸附时，它形成一个界面层，其折射率介于脂质双层和水介质之间。这一层平滑了颗粒-溶剂边界的折射率梯度，减少了整体散射效率，而没有显著改变颗粒尺寸。然而，我们没有证据支持这一点，因为这些测量方法（DLS和APIES）不够敏感。虽然可以使用单颗粒分析技术来探讨这一点，但这超出了本工作的范围。归一化（至t0）的颗粒尺寸直径（Z-average，图3B和图S4B，补充信息）显示颗粒尺寸略有减小（约10%）。使用离子强度和时间（t0vs. t200 s）作为因素，通过双向ANOVA分析了Z-Average尺寸（图S14A，补充信息）。只有在较低的离子强度（25和50 mM）下观察到颗粒尺寸的显著减少，而在100和150 mM下只观察到向较小尺寸的非显著趋势。尽管误差相对较大，但在不同测量中尺寸减小是可重复的。绘制前1800秒内的DLS测量结果（图S5，补充信息）证实，在混合后的这个初始阶段颗粒尺寸确实减小，且在低离子强度条件下的变化更大。然而，只有在50 mM情况下，这种变化在统计上是显著的（图S15，补充信息）。对DLS数据的分布拟合并没有提高尺寸测量的准确性，如图中从分布拟合中提取的主要峰（峰1）随时间的变化所示（图S4D，补充信息），因为尺寸值具有较大的误差和散布。准确的DLS尺寸测量需要更长的采集时间和多次测量运行的平均，这通常比这里的200秒观察窗口要长。因此，尽管我们无法准确追踪这一早期阶段脂质体或蛋白质的大小/贡献变化，但我们可以说尺寸有轻微的减小。在DCR之后，评估总体变化最可靠的参数是PDI，在混合后所有离子强度下都显著增加（图S4C，补充信息），这表明存在某种形式的蛋白质介导的大小变化或聚集。颗粒尺寸减小约10%应该导致米氏散射光强度减小约30%，这与632.8纳米处派生计数率的约30%减小一致（图3）。然而，AFI/Ry比率数据在低离子强度下仅减少了约4%，在高离子强度下根本没有变化（前200秒内比率保持不变），280纳米处的瑞利-米氏散射光强度仅减少了约10%（图S3A，补充信息）。我们注意到，使用缓冲液空白测量的瑞利贡献非常小，通常<2%，并且将保持不变。因此，632纳米和280纳米波长之间的观测差异可以通过280纳米处吸附的蛋白质层导致的吸光度增加来解释，这将减少颗粒的有效散射截面，从而在紫外区米氏散射的变化较小。

综合这些结果，证明蛋白质-脂质体相互作用正在发生，尽管我们无法在这段初始期间通过DLS准确测量脂质体的尺寸变化，但确实观察到了明显的减小。这种混合后脂质体 Immediate的意外收缩我们归因于HSA主要在表面结合层以及周围缓冲液中诱导的渗透压梯度。结合层中蛋白质浓度的升高会导致水从脂质体中流出，从而导致由于渗透脱水而尺寸减小。相反的情况，即HSA被封装在脂质体中的情况也受到渗透压的影响，导致膜流动性增加，尽管没有报道尺寸变化。

不同离子强度样品之间的变化可能是由于在较低离子强度下蛋白质-脂质体结合增强所致，因为它们的德拜长度较长（在25 mM时为1.93 nm，在150 mM时为0.78 nm）。这产生了更高的HSA表面浓度，从而增加了局部渗透压，导致颗粒尺寸减小。相反，较高的离子强度导致德拜长度缩短，这屏蔽了长距离静电相互作用，从而减慢了结合（较低的动力学常数），导致尺寸减小和光谱变化，正如这里所看到的。

3.2.2 渗透阶段（长达30分钟）

接下来的约30分钟内，发射参数发生了最大的变化（图4和图S6/7/8，补充信息），但颗粒尺寸的变化很小（图5和图S5，补充信息）。使用NTA的PSD分析（图6）也显示了此时低离子强度和高离子强度条件之间的显著差异。

图4显示了不同离子强度下蛋白质-脂质体时间依赖性荧光光谱变化随时间的变化：(A) 归一化的AFI/Ry比率（VV偏振）；(B) 归一化的荧光强度；(C) VV偏振下的发射峰值（λmax）变化；(D) VH偏振下的发射峰值（λmax）变化。更多细节，请参阅补充信息中的图S7/S8、表S2和图S18（统计分析）。

在不同离子强度25 (A)、50 (B)、100 (C) 和 150 (D) mM下孵育的HSA-DMPC脂质体复合物的平均颗粒直径（Z-average，黑色条形）和多分散指数（PDI，蓝色线条）的变化，持续时间长达三小时。t = 0、0.5和1.0小时的时间点是单个10秒的DLS测量结果。1.5小时、2小时、2.5小时和3小时的时间点是20次独立10秒测量的平均值。数据作为三天内三次不同实验的平均值和标准差呈现。高分辨率（所有10秒的单次测量）数据显示在图S5中，统计分析显示在图S14/S15/S16，补充信息中。

在不同离子强度下孵育的HSA-DMPC脂质体复合物的平均颗粒直径（Z-average，黑色条形）和多分散指数（PDI，蓝色线条）的变化，持续时间长达三小时。t = 0、0.5和1.0小时的时间点是单个10秒的DLS测量结果。数据作为三天内三次不同实验的平均值和标准差呈现。图S5显示了高分辨率（所有10秒的单次测量）数据，统计分析显示在图S14/S15/S16，补充信息中。图6

在不同ABC缓冲液离子强度（25 mM；50 mM；100 mM；150 mM）下，混合后不同时间（0.5小时、1小时、2小时和3小时）HSA-脂质体（HSA-Lip.）相互作用的NTA分析（归一化PSD）：(A) 25 mM；(B) 50 mM；(C) 100 mM；(D) 150 mM。(E) 平均直径随时间的变化图；(F) 模式直径随时间的变化图。APIES测量

混合后30分钟，低离子强度条件下的AFI/Ry比率（图4A和图S6A，补充信息）下降了约20%（25 mM），而高离子强度条件下的比率仅略有上升（参见图S6，补充信息中的高分辨率图）。对于所有离子强度，混合后30分钟内归一化荧光强度显著下降（图4B），并伴随着显著的蓝移（图4C/图2D，图S7A/C，以及表S2，补充信息）。在低离子强度下，变化程度更大：Δλmax = ?3.1 ± 1.6 nm（25 mM），相比之下150 mM为Δλmax = ?1.0 ± 0.9 nm。光谱变化归因于Trp214周围环境的变化，Trp214对极性变化非常敏感。这种蓝移表明Trp-214周围的局部极性降低和/或疏水性增加，这是由于HSA融入了极性较低的脂质双层微环境。在高离子强度下，蓝移较小，这是由于静电屏蔽作用减弱了HSA与脂质体的结合强度，从而导致HSA渗透脂质层的程度降低，这从内在发射的蓝移中可以看出。然而，在低离子强度下，较弱的电荷屏蔽作用允许与脂质体表面的更强静电相互作用，从而促进膜渗透，因此蓝移更大。这种行为与离子强度在调节蛋白质电学性质方面的普遍作用一致，在许多蛋白质-表面系统中，可以减少由吸附引起的结构扰动。混合后30分钟，与时间零点相比，吸光度仅有约1.0%的微小增加（参见图S8，补充信息），这表明蛋白质没有损失。

zeta电位测量

随着离子强度的增加，脂质体和HSA-脂质体混合物的ζ电位幅度都降低了（表1和图S9，补充信息），反映了电双层的压缩。然而，只有在培养3小时后才能对复合物进行zeta电位测量，因为每个样品需要约30时间进行三次重复测试，以判断系统相对稳定。HSA-脂质体混合物的ζ电位也呈现出向更负值的逐步变化，且这种变化与离子强度大致呈线性依赖。混合物的ζ电位幅度接近脂质体的值，与HSA的值有很大不同。这证实了测量结果代表了HSA-脂质体复合物，未结合的HSA贡献很小。这种与离子强度的线性依赖性与较高盐浓度下增强的静电屏蔽作用一致（更多细节参见补充信息）。

除了25 mM的情况外，所有HSA-脂质体复合物的ζ电位都比自由脂质体更负。Eisermann等人显示，含有越来越多膜相关蛋白的蛋白脂质体的zeta电位更接近中性，且变化的幅度与融入膜的蛋白量相关。由于25 mM的情况具有最负的值，我们推测这是由于表面HSA的量较多，这与Weecharangsan等人的报告相似。这也与观察到的在最低离子强度下最大的颜色变深现象相符，这应该与融入膜的HSA量有关。

DLS和NTA测量仅显示了脂质体组分的大小，而HSA的贡献在分布拟合中无法分辨。DLS得到的大小和PDI图（图5和图S5，补充信息）显示，在所有条件下，颗粒大小明显减小，同时PDI显著增加（相对于裸露的脂质体）。在这最初的30分钟内对大小变化的详细（每10秒一次）分析（图S5，补充信息）显示，几乎所有大小变化都发生在前200秒内，之后大小保持不变（50/100/150 mM）或逐渐增加（25 mM时约增加5 nm）。NTA（图6A–D和图S10/S11，补充信息）显示，裸露的脂质体显示出宽的、主要是单模式的分布，模式/平均大小约为100–180 nm，而从25 mM到150 mM的离子强度变化仅在轮廓上产生了轻微的变化（图S11A，补充信息）。与HSA混合后，大小分布变得依赖于时间和离子强度，30分钟后测量到的差异最大。低离子强度样品（25–50 mM）的大小分布更宽，大颗粒的比例也比高离子强度样品（100–150 mM）更大。这在大小测量中也得到了证实（图6E，F和表S3，补充信息），25 mM时的平均Dh为148 ± 3 nm，而150 mM时为118 ± 6 nm。需要注意的是，DLS和NTA的大小值不同，这是因为测量的根本性质不同。Z-平均值是通过累积量拟合得到的平均值，它是基于强度加权的，而NTA是基于单个颗粒追踪的平均值，更准确地反映了计数/占主导地位的颗粒群体。总体而言，APIES数据显示，蛋白质-脂质体的相互作用遵循类似的“先结合，再插入”的顺序，首先是快速的表面层次关联，随后是较慢的跨膜插入，这一点也得到了其他研究者的证实。这一发现也与Kristensen通过荧光相关光谱学（FCS）观察到的行为一致，他们发现血清诱导的聚乙二醇化和非聚乙二醇化脂质体的大小和均匀性都有所降低。有趣的是，他们报告的相互作用速率要慢得多，这可能是由于他们用于FCS测量的蛋白质：脂质体比例和浓度较低。相比之下，Galantai报告称，在磷酸盐缓冲液中，HSA与小（Dh约50 nm）DMPC脂质体孵育后，0.5小时和2.5小时时颗粒大小增加了。这些不一致之处凸显了HSA对脂质体大小的影响受多种因素的影响，包括脂质组成、蛋白质-脂质相互作用、实验条件和测量方法。

3.2.3

蛋白质晕的形成/演化（0.5–3小时）

APIES测量

在0.5到1小时之间，AFI/Ry比率仅略有变化，变化不到5%（图4A和图S6B，补充信息），除了150 mM的溶液外。然而，在接下来的两个小时里，所有离子强度下的比率都显著增加（图S19A/B，补充信息）。同样，在这30-60分钟的时间内，荧光强度相对恒定，随后逐渐增加（图4B）。这种变化在50和100 mM条件下具有统计显著性，但在25和150 mM条件下则不显著（图S19C，补充信息）。同时，280 nm处的吸光度增加了2-3%（图S8，补充信息）。混合后30-60分钟，λmax的变化较小（约1 nm）（图4C/图2D和图S7B/D，补充信息），表明渗透速率显著降低。在接下来的两个小时里，变化速率进一步减小（通常≤1 nm/h）。荧光强度的增加可能归因于Trp量子产率的增加，这是由于HSA融入脂质双层时移动性的降低和环境的改变。之前我们已经确定，在类似缓冲条件下，HSA在DMPC中的荧光寿命小于自由HSA的荧光寿命，并将这种现象（以及大的颜色变深）归因于一定程度的蛋白质展开和淬灭。然而，在那项研究中，我们没有量化强度变化，因此无法确认淬灭现象。在这里观察到的随时间增加的发射强度表明，随着HSA融入脂质双层，Trp的发射速率更高，量子产率也更大。HSA不太可能渗透到核心，因为核心是水相领域，因此人们可能会预期观察到红移，但这里并未发生。然而，Trp的光物理性质和寿命很复杂，需要进一步的研究来调查和验证这些假设。

在最初30分钟观察到的减少之后，HSA-脂质体复合物的大小逐渐增加（增加了1-5%），3小时后达到了比初始脂质体大小小约5-10 nm的值（图5A–D，表1和表S3，补充信息）。所有条件下的多分散性都保持较高，但在25/100 mM条件下更高（约0.22–0.25），相比于50/150 mM的样本。有趣的是，NTA观察到的高离子强度和低离子强度条件下的PSD差异逐渐消失（图S11，补充信息），并在3小时后完全消失，这表明系统接近于一个相似的稳态PSD，不管离子强度如何。这是由于静电屏蔽效应的差异，以及在高离子强度条件下蛋白质层的演化更慢，这一点通过DLS/APIES观察到并已在上面讨论。然而，我们在这里必须谨慎，因为NTA测量是在非常稀释的样品上进行的，因此在更浓缩的反应混合物中存在的任何可逆的关联/聚集可能已经解离。我们还发现，归一化的AFI/Ry比率和Z-Ave.的变化在所有离子强度条件下都呈线性相关（图S12A，补充信息），尽管大小测量的误差非常大。虽然NTA测量的归一化AFI/Ry比率和平均大小（图S12B，补充信息）仅在两种较高离子强度下显示出了强烈的尺寸趋势。这些差异可以归因于多种因素：首先，AFI/Ry比率使用的是瑞利-米氏光散射信号，在这个系统中主要是米氏（颗粒）散射光，这与DLS中测量的物理现象相同。因此，它们遵循相同的强度-尺寸趋势，只要发射强度没有因其他因素而显著变化，就会预期有线性相关性。相比之下，NTA的平均值是基于数量的测量，因此与散射光强度到颗粒大小的关系无关。

4. 结论

我们的最初假设是HSA与脂质体的初始相互作用非常快，因此需要一种更快的测量方法来准确监控这一过程。这里使用的Horiba公司的Aqualog多通道荧光计能够同时测量吸光度、瑞利-米氏（弹性）散射和内在荧光发射，具有可接受的硬件能力和时间分辨率（约1秒），这是标准扫描式光谱仪所缺乏的。因此，APIES方法能够同时测量吸光度、瑞利-米氏（弹性）散射和内在荧光发射，并具有秒级的时间分辨率，提供了对长时间内相互作用过程的实时洞察。APIES以高时间分辨率显示，HSA与脂质体形成单蛋白晕的过程是一个三阶段过程：首先是HSA在表面快速吸附，同时伴随着脂质体大小的轻微减少（0-200秒）；其次是重组阶段，吸附的HSA渗透到脂质双层中（3-30分钟）；最后是退火阶段，我们看到颗粒大小逐渐增加，同时蛋白质进一步渗透（>30分钟）。APIES通过恒定的吸光度（即没有蛋白质损失）、发射强度的轻微减少和AFI/Ry比率的减少来表征第一阶段，没有显著的光谱变化。第二阶段的特点是吸光度恒定，AFI/Ry比率的变化很小，但蓝移相对较大（表明色氨酸环境的变化）。最后阶段显示出吸光度恒定，AFI/Ry比率逐渐增加，荧光强度也逐渐增加，发射最大值的变化很小。在评估离子强度影响方面，APIES清晰地展示了静电屏蔽和蛋白质-脂质结合在控制蛋白质冠层形成中的双重作用，这与先前关于蛋白质-纳米粒子相互作用对离子强度和缓冲条件敏感性的报告一致。67,68 静电屏蔽调节吸附过程：在低离子强度下，屏蔽作用较弱，因此结合更容易发生；而在高离子强度下，电荷效应被强烈屏蔽，减少了静电驱动力，从而减缓了吸附速度。51–54 所有这些效应都在同时测量的APIES参数变化中得到了体现：吸光度反映了溶液中蛋白质的浓度，AFI/Ry比率显示了颗粒大小的变化，发射最大值表明了膜穿透的程度，荧光强度同时反映了溶液浓度和荧光团的环境。最终，在所有条件下，标准化的AFI/Ry比率与Dh（Z-平均值）的变化呈线性相关，提供了一个准定量的尺寸模型来追踪尺寸变化。通过双向方差分析（S1.12节SI）评估了测量光谱参数和DLS获得的尺寸数据随时间和离子强度变化的统计显著性。总体而言，APIES在生成具有统计显著性测量参数（AFI/Ry比率、发射强度和λmax）方面优于DLS，这些参数可以用来监测不同阶段下的蛋白质-脂质体相互作用（表S4，SI）。因此，在这种实验配置中，可以很容易地追踪趋势和差异，然而，提取定量动力学数据需要进一步优化以提高信噪比、减少测量误差并增加统计显著性。然而，在这里，重复测量之间最大的误差来源是每次实验都手动制备的脂质体本身的内在变异性。在这种情况下，提取定量结合动力学数据将需要更多的重复次数（9次或更多）和更一致的脂质体制备。仅基于尺寸表征的方法，如DLS和NTA，提供的关于结合-相互作用过程的信息较少。NTA在解析粒度分布（PSD）方面表现更好，并显示了高离子强度和低离子强度之间的差异，但对相互作用过程的其它方面提供的信息很少。ζ-电位测量反映了表面电荷分布和界面双层的状态，确实显示了离子强度如何影响蛋白质-脂质体的结合，但这是一种间接的结合测量方法。53,54 与更复杂的基于FCS的分析方法59相比，后者需要稀释和更复杂的实验程序，APIES实施起来更为简便，无需标记，适用于临床相关浓度，并具有更高的时间分辨率。尽管这里使用的荧光光谱仪的初始成本可能与NTA或先进的多角度DLS系统相当，但每台仪器的测试成本几乎可以忽略不计，因为比色皿可重复使用，没有昂贵的试剂或耗材，而且灯源的使用寿命很长，更换成本相对较低。总之，APIES提供了一种新的、快速的、无创的、稳健的方法，用于监测蛋白质-脂质体（或纳米粒子）相互作用，时间分辨率为约1秒，只需要使用标准电子表格进行简单的数据分析。因此，APIES方法可以作为一项成本效益高的体外测试方法的基础，用于筛选纳米粒子配方与蛋白质的相互作用。作者贡献

王华杰：构思、设计并执行实验、分析数据、准备所有图表、撰写和编辑手稿。艾伦·莱德：构思、监督、提供资源、撰写和编辑手稿。利益冲突

Horiba Scientific（美国新泽西州）是NBL的合作伙伴，并提供了本研究中使用的Aqualog光谱仪。他们没有参与研究的任何设计、实施、结果分析或论文撰写。作者声明没有其他利益冲突。数据可用性

本文的数据，包括DLS数据表、ζ-电位图、2D发射光谱和吸光度值，均可免费以Excel文件格式在NBL实验室页面的Zenodo存储库中获取：https://zenodo.org/communities/nano-bio-lab/。DOI是https://doi.org/10.5281/zenodo.19827043。补充信息（SI）：额外的实验和统计分析数据。参见DOI：https://doi.org/10.1039/d6nr00519e。致谢

本出版物的研究部分得到了中国国家留学基金委员会对HW（编号202308310150）和戈尔韦大学的资助。我们感谢Horiba（美国新泽西州皮斯卡特威）提供了本研究中使用的Aqualog仪器。参考文献