针对单克隆抗体低pH病毒灭活中微尺度平台集成反馈控制的原位pH测量

《Biotechnology Progress》：On-deck pH measurement with integrated feedback control on a micro-scale platform for monoclonal antibody low pH viral inactivation

　　

随着对高效单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）制造需求的日益增长，高通量工艺开发（high throughput process development, HTPD）平台的采用正在加速，这使得下游操作的快速自动化筛选成为可能。然而，诸如低pH病毒灭活（low pH viral inactivation, VI）等非色谱步骤在自动化工作流中的集成仍然受限，这主要归因于缺乏用于精确、原位（on-deck）pH测量和控制的微尺度方法。本研究展示了一种使用固定在96孔微孔板内的光学pH传感器的自动化pH测量和反馈控制系统的开发与实施。该方法能够实现对VI所需酸性范围内pH的非侵入式实时监测，并且完全兼容标准的液体处理平台。通过集成反馈控制算法，实现了在酸化和中和阶段自主添加酸和碱以达到精确的目标pH值。通过对测量条件（包括离子强度调整）的优化，该方法实现的测量pH值与预期pH值之间具有高度一致性。该系统进一步与Sartobind? Q和阳离子交换色谱（cation exchange chromatography, CEX）步骤集成，展示了一个端到端的自动化工作流程。在受控负载条件下对CEX性能的系统评估使得分离行为的直接可视化和次优操作区域的早期识别成为可能，证明了该平台扩展实验空间和加速机理工艺理解的能力。这项工作建立了一个具有pH控制功能的微尺度全自动下游平台，弥补了一项关键技术空白，并推进了用于生物制药纯化的端到端HTPD系统的愿景。

该研究针对单克隆抗体（mAb）下游纯化过程中低pH病毒灭活（VI）步骤难以实现自动化集成的瓶颈问题，开发了一套基于微尺度平台的光学pH原位测量与反馈控制系统，并在《Biotechnology Progress》上发表了相关成果。研究背景源于上游生产力的提升已将工艺瓶颈转移至下游，尽管高通量工艺开发（HTPD）在色谱操作中已广泛应用，但非色谱步骤如低pH VI因缺乏合适的微尺度pH调控手段而长期依赖人工操作，阻碍了全流程自动化及单元操作间相互依赖性的研究。为此，研究人员构建了以固定化光学传感器为核心的检测体系，将其嵌入96孔微孔板底部，利用Spark?多功能酶标仪读取荧光强度比，结合双寿命参比技术消除光程差异，并通过添加氯化钠调控离子强度以解决低电导下的测量偏差。在此基础上，团队利用Momentum?调度软件结合Python脚本建立了闭环反馈控制策略，实现了对酸化与中和过程的自动滴定。此外，为了解决大体积稀释样品的混合均一性问题，研究者设计并3D打印了带倾角的200 mL槽式载体配合BioShake模块进行物理振荡。结果显示，该方法在6 mS/cm电导率下测量偏差小于2%，反馈控制系统实现了目标pH的精确收敛，且混合均一性参数M₆₀达到0.97，同时避免了高速震荡导致的蛋白聚集。将系统应用于CEX色谱研究发现，缓冲液pH从5.3升至5.7可显著改善单体与高分子量组分（HMWC）的分离度。结论指出，该集成平台成功填补了HTPD中非色谱步骤自动化的技术空白，为mAb下游工艺提供了可扩展、端到端的自动化解决方案。

关键技术方法包括：基于PreSens GmbH光学传感器spot的荧光比率法pH检测体系构建与校准；利用Momentum?软件与Python脚本开发的自动化反馈控制算法；为解决大规模稀释样品混合问题设计的定制化3D打印槽式载体及其配套的物理混合策略；以及涵盖蛋白A色谱、低pH VI、Sartobind? Q膜吸附及CEX的多单元操作集成自动化流程。样本来源于CHO细胞培养产生的完全人源IgG1κ mAb澄清收获液。

研究结果部分：在“3.1 集成pH测量方法的开发”中，研究人员通过调整离子强度发现，在未添加NaCl时，光学传感器与参比电极间存在显著差异（p < 0.05）；当添加40 μL 1 M NaCl使电导率达6 mS/cm时，偏差降至统计不显著水平（p > 0.05），验证了离子强度对光学pH测量的关键影响及优化方案的必要性。在“3.2 pH测量反馈控制策略的开发”中，通过对比实验证明，自动化反馈控制相比手动滴定大幅缩短了处理时间，尤其在样本量增大时体现出阶梯式缩放优势，且实现了酸化与中和阶段的无人值守精确pH调控。在“3.3 在自动化微尺度平台内的集成”中，针对200 mL槽式载体的混合效率评估表明，采用6次吸排循环结合200 rpm轨道震荡的策略，可在避免蛋白聚集（HMWC增幅最小）的同时实现M₆₀= 0.97的高效混合，媲美实验室规模混合效果。在“3.4 pH对阳离子交换色谱性能影响的评估”中，研究发现当平衡及洗脱缓冲液pH为5.3时，单体峰展宽且与HMWC共洗脱；而当pH提升至5.7时，峰形尖锐且HMWC与单体分离度显著提高，证明了该平台可用于快速筛选影响杂质清除的关键工艺参数。

讨论与结论部分总结：该研究成功开发并集成了一套自动化原位pH测量与反馈控制系统，利用固定在96孔板内的光学传感器实现了非侵入式检测，经离子强度优化后测量值与参考值高度吻合。实施的反馈控制策略实现了酸化和中和阶段的自主精确调节，消除了人工干预。通过与Sartobind? Q及CEX的联用，证实了该平台支持端到端自动化执行。应用于CEX的研究表明，该平台能在恒定上样条件下评估缓冲液pH对分离性能的影响，直观展示分离行为并早期识别次优条件。这项工作解决了限制HTPD平台集成非色谱单元操作的技术缺口，结合自动传感、反馈控制和序列操作，增强了工艺的稳健性和可重复性。展望未来，该集成方法为扩展至缓冲液置换、病毒过滤和制剂开发等其他非色谱操作奠定了基础，通过引入互补的分析传感器和先进控制算法，推动平台向全面的过程分析技术（PAT）框架迈进，最终确立为一个可扩展的端到端自动化系统，加速mAb下游生产的数据驱动型工艺开发。