氟化两亲性树状大分子用于提升PET成像在癌症检测中的应用

《Small》：Fluorinated Amphiphilic Dendrimer to Improve PET Imaging of Cancer

　　摘要

早期和准确的肿瘤检测是成功管理癌症的关键。基于纳米技术的生物医学成像通过提高敏感性和特异性提供了强大的潜力来增强肿瘤检测，特别是通过增强的渗透性和保留（EPR）效应。然而，成像剂的亚最佳生物分布通常与显著的肝脏保留相关。尽管氟化化合物在自然环境中很少见，但由于氟的高电负性、其强烈的诱导效应以及C-F键的低极化性，它们提供了独特的物理化学性质，从而具有卓越的化学稳定性和生物惰性。在这里，我们报道了一种用于正电子发射断层扫描（PET）肿瘤成像的氟化超分子树状纳米系统。该系统是通过用正电子发射放射性核素镓-68（常用作PET）标记的两亲性氟化树状大分子的自组装构建的。这种氟化放射性示踪剂具有纳米级尺寸，并具有高放射化学纯度和稳定性。与非氟化类似物相比，氟化系统表现出较低的肝脏积累、改进的药代动力学以及在原位和异位小鼠胶质母细胞瘤和胰腺腺癌异种移植模型中显著增强的肿瘤摄取。这些结果表明，氟化是一种优化成像剂药代动力学和生物分布的有效策略，从而实现更准确和有效的肿瘤检测。

1 引言

生物成像在癌症管理中起着至关重要的作用，用于准确诊断和治疗。在成像模式中，正电子发射断层扫描（PET）因其高灵敏度和定量能力而脱颖而出，是评估分期、分级以及监测治疗反应和抗肿瘤效果的有力工具[1-4]。然而，进一步提高靶向特异性和空间分辨率仍然非常有需求。基于纳米技术的成像通过利用增强的渗透性和保留（EPR）效应以及每个纳米粒子上的放射性核素数量增加，为解决这些挑战并提高成像的敏感性和特异性提供了有希望的途径。EPR效应是固体肿瘤及其微环境的特征，这与它们与正常组织的解剖学和病理生理学差异有关，使得纳米粒子能够进入肿瘤组织并在那里积累，这是由于血管通透性和淋巴系统的受损[5]。因此，肿瘤病变中的成像剂局部浓度可以显著增加，从而提高成像的敏感性和特异性。树状纳米系统由于其明确的结构、多价性和可调的功能性，在生物医学成像应用中特别有吸引力[6-8]。我们之前已经开发了用于正电子发射断层扫描（PET）、单光子发射计算机断层扫描（SPECT）和磁共振成像（MRI）的自组装超分子树状纳米系统[9, 10, 11, 12]。这些树状纳米系统是通过由长疏水烷基链和小的亲水性聚（酰胺胺）（PAMAM）树状部分组成的两亲性树状大分子的自组装构建的，并用PAMAM树状部分标记了示踪剂。具体来说，用[68Ga]Ga3+放射性核素标记的两亲性树状大分子用于PET（图1A中的[68Ga]Ga-1）。我们的进一步研究表明，纳米粒子表面电荷显著影响生物分布，略微正的表面电荷与负电荷相比显示出较低的肝脏摄取[13]。最近，我们发现即使保持相同的亲水性树状部分，修改疏水域也可以显著改变生物分布，导致在肝脏中大量积累[14]。这些发现突显了内部分子组成的关键作用。

2 材料与方法

2.1 原材料

树状大分子1是根据我们小组发表的既定协议合成的[9]。NODA-GA(tBu)3从CheMatech（法国迪戎）购买。透析管从Sigma Aldrich（法国圣昆汀法拉维耶）购买。放射性标记的质量控制分析是在Instant Thin Layer Chromatography (iTLC, Agilent Technologies, 加利福尼亚州圣克拉拉)上使用MiniGITA放射色谱系统（Elisia-Raytest, 比利时安格勒）进行的。

2.2 核磁共振

核磁共振（NMR）实验在300K下使用Bruker Avance DRX 500 NMR光谱仪（德国卡尔斯鲁厄）进行，1H NMR在500 MHz下，19F NMR在470 MHz下，13C NMR在126 MHz下。

2.3 质谱

高分辨率质谱实验使用Synapt G2 HDMS四极杆/飞行时间质谱仪（英国曼彻斯特）进行，必要时使用电喷雾源，在正模式或负模式下操作。

2.4 两亲性树状大分子1的合成

树状大分子1的合成和表征按照我们之前的研究[9]进行。

2.5 两亲性树状大分子F0的合成

在氩气氛围下，将含叠氮基的氟化链（29 mg，0.070 mmol）和炔基末端的PAMAM树状部分（42 mg，0.066 mmol）溶解在THF（6.0 mL）中，然后加入CuSO4·5H2O（1.0 mg，0.0035 mmol）在水（1.0 mL）中，以及抗坏血酸钠（1.5 mg，0.0070 mmol）在水（1.0 mL）中。然后在氩气氛围下于50°C下搅拌3小时，直到反应完成，通过薄层色谱（TLC）分析确定。然后减压去除溶剂，将得到的残渣溶解在20 mL CH2Cl2中，并用饱和的0.10 M乙二胺四乙酸（EDTA）溶液（10 mL×2）洗涤，用饱和NaHCO3溶液（10 mL×2）洗涤，再用盐水（10 mL）洗涤。有机相用无水Na2SO4干燥，过滤并浓缩。粗产物通过硅胶柱色谱纯化，使用CH2Cl2/MeOH洗脱，得到相应的带酯末端的氟化两亲性PAMAM树状大分子，为无色油（56 mg，产率：81%）。在冰浴中的甲醇（2.0 mL）中，向上述得到的树状大分子溶液（30 mg，0.029 mmol）中缓慢加入乙二胺（EDA）（0.60 mL，8.7 mmol）。反应混合物在30°C下搅拌3.0天，直到反应完成，通过IR分析确定。然后减压蒸发溶剂，得到的残渣通过透析（透析管，MWCO 1000，每小时更换一次透析液）和冻干纯化。重复透析和冻干操作3次，得到树状大分子F0，为白色固体（33 mg，产率：99%）。1H NMR（400 MHz，CD3OD）δ 7.91 (s, 1H), 4.39 (t, J = 7.1 Hz, 2H), 3.81 (s, 2H), 3.25 (m, 12H), 2.83–2.69 (m, 20H), 2.57 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 2.43 (t, J = 6.8 Hz, 4H), 2.36 (t, J = 6.8 Hz, 8H), 2.14 (tt, J = 19.0, 8.1 Hz, 2H), 1.90 (p, J = 7.2 Hz, 2H), 1.59 (p, J = 7.5 Hz, 2H), 1.46–1.26 (m, 14H)。19F NMR（376 MHz，CD3OD）δ -82.55 (br, 3F), -115.51 (br, 2F), -124.41 (br, 2F), -127.16 (br, 2F)。HRMS-ESI(+): C48H90F9N16O6 [M+3H]3+的计算 m/z为385.9023，实测值为385.9031 (+ 0.8 ppm)。

2.6 两亲性树状大分子F1的合成

向3.0 mL无水二甲亚胺（DMF）中的NODA-GA(tBu)3（125 mg，0.23 mmol）溶液加入苯并三唑-1-氧基三吡咯啶磷鎓六氟磷酸盐（PyBOP，120 mg，0.23 mmol）和N-甲基吗啉（NMM，32 μL，0.29 mmol）。混合物搅拌15分钟，然后加入F0（22 mg，0.019 mmol）的无水DMF（1.5 mL）溶液，然后在氩气氛围下于30°C下搅拌3.0天。接着加入20 mL乙酸乙酯，混合物用饱和NaHCO3溶液（3 × 4.0 mL）洗涤。然后有机层用无水MgSO4干燥，过滤并在减压下蒸发。得到的残渣通过三次用5.0 mL DCM/戊烷 v/v 0.1/1混合物沉淀纯化，然后溶解在TFA/CH2Cl2混合物（3.0 mL，v/v = 1/1）中，并在氩气氛围下于30°C下搅拌24小时。蒸发溶剂后，通过透析（透析管，MWCO 2000）和冻干纯化。重复透析（每小时更换一次透析液）和冻干操作4次，最终得到树状大分子F1，为白色固体（38 mg，产率：77%）。1H NMR（500 MHz，CD3OD/D2O）：δ 8.27 (s, 1H), 4.43 (s, 2H), 3.74-3.65 (m, 22H), 3.50-3.16 (m, 84H), 3.05-2.70 (m, 30H), 2.49-2.31 (br, 8H), 2,11-1.85 (m, 14H), 1.52 (br, 2H), 1.37-1.17 (br, 14H)。19F NMR（470 MHz，CD3OD/D2O）：δ -88.09 (br, 3F), -115.05 (br, 2F), -125.20 (br, 2F), -126.84 (br, 2F)。13C NMR（126 MHz，D2O）：δ177.48, 176.30, 174.37, 173.66, 177.63, 137.50, 128.17, 66.80, 58.33, 53.23, 52.31, 51.60, 50.86, 50.51, 50.32, 50.02, 47.51, 39.99, 39.55, 35.48, 33.73, 31.25, 30.83, 30.59, 30.11, 29.94, 29.82, 29.66, 29.59, 28.39, 27.10, 26.22, 20.79）。ESI(-) HRMS：C108H177F9N28O342?的计算同位素最大值为m/z 1291.1439，实测值为m/z 1291.1429 (+0.8 ppm)。

2.7 用非放射性镓-69标记的两亲性树状大分子F1的合成

将树状大分子F1（4.9 mg，1.9 μmol）溶解在2.0 mL H2O中。向此溶液中加入1.0 mL [69Ga]GaCl3（1.4 mg，8.3 μmol）溶液（1.0 mM HCl），并用0.20 m醋酸铵调节pH值至4.5。混合物在25°C下搅拌15分钟。得到的粗产品通过透析（透析管，MWCO 2000）纯化，得到相应的[69Ga]Ga-F1溶液。ESI(+) HRMS：C108H170F9Ga4N28O343+的计算同位素最大值为m/z 951.3105，实测值为m/z 951.3102 (-0.3 ppm)。

2.8 透射电子显微镜

使用JEOL 2100F分析电子显微镜（日本东京）进行透射电子显微镜（TEM）观察，以200 kV的加速电压表征纳米粒子的大小和形态。树状大分子在milliQ水中以1.0 mg/mL的浓度分散，涡旋30秒，然后稀释至1.6 μg/mL，接着将4.0 μL的样本滴加到镀碳的铜网上，并在25°C下干燥15分钟。然后用3.0 μL的铀酰醋酸盐（2.0%水溶液）染色网格5秒，测量前用滤纸去除多余的铀酰醋酸盐。

2.9 动态光散射分析

进行动态光散射（DLS）分析以确定纳米粒子的大小和大小分布。具体来说，首先将树状大分子在milliQ水中以0.50 mg/mL的浓度分散，涡旋30秒，然后使用带有标准633 nm激光的Zetasizer Nano ZS（英国Malvern）在25°C下测量新鲜溶液。测量使用一次性耐溶剂微比色皿（ZEN0040）进行大小和大小分布的测量，以及使用一次性折叠毛细管zeta cell（DTS1070）进行zeta电位的测量。所有实验都重复三次。

2.10 临界胶束浓度

使用Nile Red作为荧光探针，通过荧光光谱法测定临界胶束浓度（CMC）。准备了浓度从1.0 × 10?7到2.0 × 10?4 mol/L的[69Ga]Ga-F1树状大分子溶液，最终水中的Nile Red浓度为3.0 × 10?6 mol/L。溶液涡旋10分钟并在室温下放置2小时以促进胶束形成，然后进行荧光测量。荧光光谱在635 nm的发射波长下使用F-4500荧光分光光度计（CARY Eclipse）在室温下记录。激发波长为550 nm。归一化的荧光强度作为树状大分子浓度的函数进行分析。

2.11 等温滴定 calorimetry

在37°C下使用MicroCal PEAQ-ITC calorimeter（英国Malvern）进行等温滴定 calorimetry实验，缓冲液pH = 6.5。细胞体积为208 μL。在缓冲液中研究了Ga3+和F1的络合热力学参数。具体来说，向200 μM的F1溶液中（浓度远高于其CMC）逐步注射2.0 μL体积的8.0 mM GaCl3，共18次。为了确定CMC值，将2.0 μL的[69Ga]Ga-F1树状大分子缓冲溶液（浓度为1200 μM）以150秒的间隔注入到充满HEPES缓冲液的 calorimeter样品细胞中，共18次。所有溶液和缓冲液在每次实验前在室温下搅拌600 rpm下脱气30分钟。仔细清洗后，用部分缓冲液预冲洗细胞。在填充细胞和注射器后，启动了搅拌，并让系统热平衡30分钟。

2.12 用镓-68对树状大分子进行放射性标记

将新鲜制备的1.0摩尔/升醋酸铵溶液（0.060毫升）加入0.050毫升的1或F1树状大分子溶液（50微克/50微升，位于milliQ水中）。向该溶液中加入0.50毫升从药用级68锗/68镓发生器（Galliapharm，Eckert & Ziegler Berlin，德国）中新鲜洗脱出的[68Ga]GaCl3溶液，使用0.10摩尔/升的盐酸。溶液在室温下孵育10分钟。然后将pH值为5.0的溶液用10微升0.10摩尔/升的NaOH中和至pH值7.0，并进行涡旋混合。无需进行离心或纯化步骤。所得到的复合物的放射性化学纯度超过95%，如先前研究所示[9]。这种放射性化学纯度是通过iTLC（固相：iTLC-SG（Agilent，Les Ulis，法国）；流动相：0.10摩尔/升柠檬酸钠，pH值5.0）来确定的。溶液被稀释到适当的浓度，然后用于体外和体内研究，无需进一步纯化。

2.13 放射性标记的稳定性

通过将0.10毫升的放射性示踪剂溶液分别加入0.40毫升的人血清和0.40毫升的0.9% NaCl中，评估了[68Ga]Ga-1@和[68Ga]Ga-F1@的放射性标记稳定性。所有放射性标记的树状大分子的稳定性在25°C和37°C下分别检测了4小时，分别在0.9% NaCl和人血清中。放射性化学纯度的稳定性在标记后0小时、1小时、2小时和4小时使用iTLC和miniGITA放射色谱仪（Elysia Raytest，Angleur，比利时）进行了检测。

2.14 正辛醇/水分配系数测定

使用正辛醇/水分配方法评估了镓-68放射性标记的纳米示踪剂的亲脂性。简要来说，将100微升的[68Ga]Ga-F1@或[68Ga]Ga-1@与400微升蒸馏水混合，然后加入500微升的正辛醇。将两相体系剧烈涡旋3分钟后，以6000转/分钟的速率离心5分钟以实现相分离。分别收集每相的100微升样品，并使用γ计数器测量放射性。log P值计算为正辛醇相中的放射性与水相中放射性比值的对数。[68Ga]Ga-1@的log P值为-0.58 ± 0.47，[68Ga]Ga-F1@的log P值为-1.0 ± 0.1。

2.15 动物护理和使用

所有使用动物的程序均得到了机构动物护理和使用委员会（C2EA-71，INT，Aix-Marseille大学）以及法国高等教育和研究部（项目编号#32157、#31843和#14177）的批准，并按照欧盟指令2010/63/EU和ARRIVE 2.0指南[21]进行。动物被安置在温度和湿度受控的笼子里，每天进行监测，可以自由摄取水和商业饲料。选择每种肿瘤模型的小鼠品系经过了之前的验证和既定协议，以确保可重复性，并遵循减少原则（3R），避免额外的优化研究，以确保每种模型的移植和生长动力学。

2.16 健康小鼠的生物分布

九周大的健康瑞士雄性小鼠（Charles River，n = 24）在异氟醚麻醉（2.0%）下，通过尾静脉注射4.1 ± 0.76 MBq的[68Ga]Ga-1@或3.7 ± 0.50 MBq的[68Ga]Ga-F1@，每组十二只小鼠，持续两小时。每组中有六只小鼠被注射用于拍摄，然后进行两小时的动态PET/CT采集。在[68Ga]Ga-F1组中，有一只小鼠因注射时出现外渗而被排除。每组还有六只小鼠用于血液取样分析。动态小动物PET/CT成像使用NanoScan PET/CT扫描仪（Mediso，Budapest，匈牙利）进行。PET采集参数包括4次迭代、1–3的符合窗口和10厘米的视野（FOV）。CT扫描在与PET相同的视野下进行，参数如下：35千伏电压、300毫秒的暴露时间、480个投影和半圆形采集方法。CT重建使用Nucline软件（v.3.04.025.0000，Mediso，Budapest，匈牙利）进行，考虑了衰减校正。PET数据在以下时间框架内重建：0–5分钟、6–10分钟、11–15分钟、16–20分钟、21–25分钟、26–30分钟、31–45分钟、46–60分钟、61–75分钟、76–90分钟、91–105分钟和106–120分钟。使用VivoQuant软件（v.3.52022 patch1，Invicro，美国）在衰减和衰变校正后的PET/CT图像上确定了感兴趣的定量体积（VOIs）。基于CT的VOIs是手动定义的，用于评估和比较树状大分子制剂在特定器官（包括大脑、心脏、肝脏、肺、肾脏、膀胱和肌肉）中的积累情况，基于PET信号量化。结果以每克组织的注射剂量百分比（%ID/cm3）表示。在注射后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、75分钟、90分钟和120分钟采集血液样本，并在衰变校正后使用gamma计数器（Wizard 2480，Perkin-Elmer）进行分析。在注射后两小时，两只组的小鼠都被安乐死，收集器官（肾脏、肝脏、心脏、肺、肠道、脾脏、胰腺、骨骼和肌肉），用PBS（Eurobio-scientific，Les Ulis，法国）清洗，称重并通过gamma计数进行分析。结果经过衰变校正，并以%ID/g表示。

2.17 胰腺癌异种移植模型

通过将1 × 10^6个SOJ-6细胞（原发性胰腺腺癌细胞，0.025毫升Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640培养基（ThermoFisher Scientific，Waltham，美国）与10%胎牛血清和0.025毫升Matrigel Matrix（Corning，纽约，美国）共程注射到NMRI裸鼠（Janvier Labs，n = 5）体内，建立了人类胰腺腺癌异种移植模型。每只小鼠的胰腺中注射1 × 10^6个SOJ-6细胞/50微升。动物休息三周。在注射放射性示踪剂前一天，五只携带SOJ-6肿瘤的小鼠被注射了CT造影剂（ExiTron nano 12000，100微升，视网膜后注射，Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国）。然后在异氟醚麻醉（2%）下，这些小鼠的尾静脉中注射3.8 ± 0.31 MBq的[68Ga]Ga-1@和4.8 ± 0.4 MBq的[68Ga]Ga-F1@，维持2小时，之后开始20分钟的PET/CT静态采集。另外在注射后4小时再进行了一次PET/CT静态采集，以评估晚期生物分布。

2.18 胶质母细胞瘤异种移植模型

通过在无胸腺裸鼠（Charles River，Wilmington，MA，n = 6，每组）的黑侧腹部皮下注射5.0 × 10^6个U87细胞（人类胶质母细胞瘤）与0.050毫升PBS（Lonza，Basel，瑞士）和10%胎牛血清（经过胰蛋白酶处理（0.05% Trypsin-EDTA，Lonza）中，建立了异种胶质母细胞瘤模型。动物随后休息三周。这些小鼠在异氟醚麻醉（2%）下，通过尾静脉注射5.0 ± 0.24 MBq的[68Ga]Ga-1@和5.5 ± 0.7 MBq的[68Ga]Ga-F1@。注射后2小时和4小时分别进行了PET/CT静态采集。此外，还通过立体定向注射将0.5 × 10^6个U87细胞（3.0微升，含Mg2+/Ca2+）到8周大的雌性无胸腺裸鼠（Janvier Labs，n = 8）的左纹状体中，建立了原位人类胶质母细胞瘤异种移植模型。使用Hamilton微注射器在立体定向下进行注射。三周后，这些小鼠在异氟醚麻醉（2%）下，通过尾静脉注射5.4 ± 1.1 MBq的[68Ga]Ga-1@和5.2 ± 0.53 MBq的[68Ga]Ga-F1@。注射后4小时进行了PET/CT静态采集。

2.19 PET/CT采集和图像处理

使用NanoScan PET/CT扫描仪（Mediso，Budapest，匈牙利）进行了20分钟的静态小动物PET/CT成像。PET采集参数包括4次迭代、1–3的符合窗口和10厘米的视野（FOV）。CT扫描在与PET相同的视野下进行，参数如下：平均持续时间6分钟、35千伏电压、300毫秒的暴露时间、480个投影和半圆形采集方法。CT重建使用Nucline软件（v.3.04.025.0000，Mediso，Budapest，匈牙利）进行，考虑了衰减校正。使用VivoQuant软件（v.3.52022 patch1，Invicro，美国）在衰减和衰变校正后的PET/CT图像上确定了感兴趣的定量体积（VOIs）。基于CT的VOIs是手动定义的，用于评估和比较树状大分子制剂在特定器官（包括大脑、心脏、肝脏、肺、肾脏、膀胱和肌肉）中的积累情况，基于PET信号量化。结果以每克组织的注射剂量百分比（%ID/cm3）表示。

2.20 非室模型药代动力学分析

使用PKanalix软件v2023（Lixoft，Antony，法国）进行了非室模型分析（NCA）。NCA用于通过血浆浓度-时间曲线下的面积（AUCinf）和外推到无穷大的值来描述器官暴露情况，以及每种制剂的主要药代动力学参数：清除率、半衰期和分布体积。

2.21 统计分析

所有统计分析均使用Prism v9.0（GraphPad，San Diego，CA，美国）进行。数据以平均值±标准差（SD）的形式呈现。数据的正态性通过Shapiro-Wilk检验进行验证。当比较两个以上具有一个因素的组时，数据提交给单因素ANOVA，随后进行Dunn-?idák的事后检验；当比较两个以上具有两个因素的组时，数据提交给双因素ANOVA，随后进行Dunn-?idák的事后检验。P < 0.05表示统计显著。

3 结果

3.1 氟化树状大分子的可靠合成及其与Ga3+的螯合

氟化两亲性树状大分子F1的合成（图2A）始于树状大分子前体F0，通过铜催化的点击化学方法将带有叠氮基的氟化链与炔基终止的PAMAM树状骨架连接起来（图2A；方案S1）。类似于树状大分子1的合成[9]，F0与试剂NODA-GA(tBu)3结合，随后进行脱保护反应，得到氟化树状大分子F1（图2A）。使用1H、13C和19F NMR以及高分辨率质谱（HRMS）分析了F1的化学结构和完整性。具体来说，19F NMR谱显示了与氟化树状大分子相对应的特征信号：四个19F NMR峰被分配到碳链上连接的相应氟化实体（图S2）。此外，NOTA笼的特征信号在1H和13C NMR中也很明显。进一步的HRMS确认了分子质量和完整性：双电荷物种的实验质量/电荷与理论分子量相差小于0.8 ppm。图2A显示了氟化树状大分子F1及其螯合物[69Ga]Ga-F1和[68Ga]Ga-F1与非放射性同位素[69Ga]Ga3+和放射性同位素[68Ga]Ga3+的化学合成过程。（i）CuSO4、抗坏血酸钠、THF/H2O、25°C、15分钟；（ii）乙二胺、甲醇、30°C、72小时；（iii）NODA-GA(tBu)3、PyBOP、NMM、DMF、30°C、72小时；（iv）TFA、CH2Cl2、30°C、16小时；（v）[69Ga]GaCl3、1.0摩尔盐酸、0.20摩尔醋酸铵、25°C、15分钟。（B）高分辨率质谱显示了三电荷物种[[69Ga]Ga-F1+3H]3+的特征同位素模式。插图显示了计算出的同位素模式。（C）用于Ga3+与树状大分子F1螯合的等温滴定热量计（ITC）曲线。插图显示了滴定过程中测量的热功率与时间的关系。（D）热力学参数总结表，包括占据NOTA大环的N数、ΔG吉布斯能量、ΔH焓、ΔS熵、CMCITC和CMCfluo，分别通过等温滴定热量计和Nile red方法获得。使用69GaCl3与F1螯合后，通过透析去除游离的69Ga3+，得到了非放射性树状大分子[69Ga]Ga-F1（图2A）。HRMS显示了三电荷物种[69Ga]Ga-F1+3H]3+的特征同位素模式和确切的分子量，与理论预测相符（图2B）。为了支持[69Ga]Ga-F1的可靠合成，进一步使用等温滴定热量计（ITC）（图2C）研究了F1与69Ga3+之间的复合体形成。Ga3+与F1之间的结合能力表明了复合体的自发形成（ΔG = ?6.72 kcal/mol），这是由于焓（ΔH = ?5.39 kcal/mol）和熵（ΔS = ?1.33 kcal/mol）的平衡和有利贡献（图2D）。最后，通过ITC得到的占据位点数4.02（图2D）与[69Ga]Ga-F1复合体的理论化学计量比4:1接近。

3.2 [69Ga]Ga-F1自组装成小而均匀稳定的纳米粒子

由于[69Ga]Ga-F1具有内在的两亲性，它在水溶液中自发自组装。透射电子显微镜（TEM）的结果显示，[69Ga]Ga-F1自组装成小型、均匀且呈球形的纳米胶束（此后简称为[69Ga]Ga-F1@），平均直径约为28纳米（图3A）。通过动态光散射（DLS）分析进一步证实了溶液中纳米胶束的有效形成，其平均尺寸为31纳米（图3C），这与TEM分析结果一致。我们使用了一种广泛报道的方法——利用尼罗红（Nile Red）进行荧光光谱测定，确定了[69Ga]Ga-F1的临界胶束浓度（CMC），结果约为80微摩尔（图S3）。这一数值与使用冰点渗透压法（ITC）得到的结果（92微摩尔，图2C,D）相符。

4. 讨论
我们之前报道了基于自组装树状大分子的放射性示踪剂[68Ga]Ga-1@，该示踪剂利用电子顺磁共振（EPR）驱动的肿瘤积累和树状大分子的多价性，在多个临床前模型中的PET成像效果优于临床标准示踪剂[18F]FDG [9]。然而，由于其显著的肝脏摄取现象，我们决定在两亲性树状大分子的疏水结构中引入氟基团，从而得到了氟化树状大分子[68Ga]Ga-F1。这种结构修改有效地调节了生物分布，减少了在肝脏中的滞留，并在多个肿瘤模型中提高了肿瘤与背景的对比度，同时没有影响放射性标记的质量或自组装行为。据我们所知，这是第一个通过氟化两亲性树状大分子来生成自组装的超分子纳米系统，以改善生物分布和肿瘤成像效果的例子。氟在药物化学中被广泛用于提高生物活性、增强代谢稳定性以及改善药物和候选药物的生物利用度和药代动力学 [16, 18, 19]，因为氟具有最高的电负性，且C-F键具有强烈的诱导效应和卓越的稳定性，同时保持生物惰性 [15, 20]。氟化或全氟化基团也常常会导致分子间的强烈相互作用，有时会导致溶解度降低 [17]。有趣的是，在我们的案例中，氟化并没有引起溶解度问题，氟化树状大分子自发地自组装成了小型且均匀的纳米胶束[68Ga]Ga-F1@。更重要的是，氟化并没有影响使用镓-68的放射性标记质量：其放射化学纯度超过了95%，并在37°C的人类血清中至少保持了4小时的稳定性（图4），证实了其与PET成像协议的完全兼容性。在健康小鼠中的体内PET/CT成像和体外伽马计数显示，[68Ga]Ga-F1@的生物分布明显优于[68Ga]Ga-1@（图5A,B）。注射后120分钟时，[68Ga]Ga-F1@在肝脏、心脏、肺部、肌肉和大脑中的PET信号显著降低（分别降低了3.00 ± 0.58 %ID/cm3 vs 4.31 ± 1.01 %ID/cm3、4.11 ± 0.71 %ID/cm3 vs 5.92 ± 1.35 %ID/cm3、2.29 ± 0.30 %ID/cm3 vs 2.91 ± 0.67 %ID/cm3、0.76 ± 0.23 %ID/cm3 vs 1.30 ± 0.68 %ID/cm3、0.95 ± 0.07 %ID/cm3 vs 1.00 ± 0.16 %ID/cm3，****p <0.0001），而在膀胱和肾脏中的PET信号则显著增加（分别增加了27.45 ± 2.99 %ID/cm3 vs 12.15 ± 2.71 %ID/cm3、5.15 ± 1.11 %ID/cm3 vs 4.84 ± 1.21 %ID/cm3，****p <0.0001）。此外，氟化还提高了[68Ga]Ga-F1@在健康动物中的生物分布（图5A,B）。

3.5 氟化作用提高了放射性标记的纯度和稳定性
用放射性[68Ga]GaCl3对1和F1进行进一步标记后，分别得到了[68Ga]Ga-1@和[68Ga]Ga-F1@。这两种标记物的放射化学纯度均高于95%，并在25°C和37°C的生理血清中至少保持了4小时的稳定性（图4；表S1和S2）。有趣的是，与[68Ga]Ga-1@相比，氟化使得[68Ga]Ga-F1@的亲油性略有下降（log P = -1.0 ± 0.1 vs -0.58 ± 0.47）。这并不令人惊讶，因为氟化通常会同时改变分子的亲水性和疏水性。

3.4 氟化作用在健康动物中改善了生物分布
首先在健康动物中通过PET成像和伽马计数研究了体内生物分布（图5）。[68Ga]Ga-F1@的PET信号量显著低于[68Ga]Ga-1@（分别在肝脏降低3.00 ± 0.58 %ID/cm3 vs 4.31 ± 1.01 %ID/cm3，****p <0.0001；在心脏降低4.11 ± 0.71 %ID/cm3 vs 5.92 ± 1.35 %ID/cm3，****p <0.0001；在肺部降低2.29 ± 0.30 %ID/cm3 vs 2.91 ± 0.67 %ID/cm3，****p <0.0001；在肌肉降低0.76 ± 0.23 %ID/cm3 vs 1.30 ± 0.68 %ID/cm3，***p = 0.0004；在大脑降低0.95 ± 0.07 %ID/cm3 vs 1.00 ± 0.16 %ID/cm3，***p = 0.0001），而在膀胱和肾脏中的PET信号则显著增加（分别增加27.45 ± 2.99 %ID/cm3 vs 12.15 ± 2.71 %ID/cm3，****p <0.0001；在肾脏增加5.15 ± 1.11 %ID/cm3 vs 4.84 ± 1.21 %ID/cm3，****p <0.0001）。相反，[68Ga]Ga-F1@在注射后120分钟时的PET信号比[68Ga]Ga-1@更高（分别在膀胱增加27.45 ± 2.99 %ID/cm3 vs 12.15 ± 2.71 %ID/cm3，****p <0.0001；在肾脏增加5.15 ± 1.11 %ID/cm3 vs 4.84 ± 1.21 %ID/cm3，****p <0.0001）。注射后2小时对健康小鼠进行PET/CT生物分布研究，使用[68Ga]Ga-1@（n = 6）或[68Ga]Ga-F1@（n = 5）（图5A,B）。统计分析通过双向方差分析（two-way ANOVA）进行，结果在时间和培养条件上均无显著差异。

3.4 氟化作用在健康动物中改善了生物分布
通过在健康动物中进行PET成像和伽马计数，首次研究了[68Ga]Ga-F1的体内生物分布（图5）。与[68Ga]Ga-1相比，[68Ga]Ga-F1在肝脏、心脏、肺部、肌肉和大脑中的PET信号显著降低（分别在肝脏降低3.00 ± 0.58 %ID/cm3 vs 4.31 ± 1.01 %ID/cm3、4.11 ± 0.71 %ID/cm3 vs 5.92 ± 1.35 %ID/cm3、2.29 ± 0.30 %ID/cm3 vs 2.91 ± 0.67 %ID/cm3、0.76 ± 0.23 %ID/cm3 vs 1.30 ± 0.68 %ID/cm3、0.95 ± 0.07 %ID/cm3 vs 1.00 ± 0.16 %ID/cm3，****p <0.0001；而在膀胱和肾脏中的PET信号显著增加（分别在膀胱增加27.45 ± 2.99 %ID/cm3 vs 12.15 ± 2.71 %ID/cm3，****p <0.0001；在肾脏增加5.15 ± 1.11 %ID/cm3 vs 4.84 ± 1.21 %ID/cm3，****p <0.0001）。注射后2小时对主要器官进行体外伽马计数（图5C），数据结果显示[68Ga]Ga-F1在肝脏中的PET信号量显著低于[68Ga]Ga-1（分别在肝脏降低1.95 ± 0.51 %ID/g vs 3.82 ± 0.94 %ID/g，****p <0.0001；在脾脏降低1.20 ± 0.33 %ID/g vs 2.30 ± 0.50 %ID/g，***p = 0.0001；在肠道降低0.92 ± 0.18 %ID/g vs 1.90 ± 0.33 %ID/g，**p = 0.0016；在心脏降低1.96 ± 0.68 %ID/g vs 3.04 ± 0.60 %ID/g，***p = 0.0002；在肺部降低2.90 ± 0.93 %ID/g vs 4.40 ± 1.20 %ID/g，****p <0.0001；在骨骼降低0.55 ± 0.16 %ID/g vs 1.30 ± 0.19 %ID/g，*p = 0.0264）。在肾脏中未发现显著差异（分别在肾脏降低5.42 ± 0.96 %ID/g vs 5.11 ± 1.01 %ID/g，图5C）。

3.5 氟化作用改善了药代动力学参数
通过对动态PET信号量的非室模型药代动力学分析，得出[68Ga]Ga-F1的血浆清除率显著高于[68Ga]Ga-1（分别为2.56 ± 0.36 mL/h vs 1.08 ± 0.62 mL/h，**p = 0.0011，图6A）。[68Ga]Ga-F1的分布体积（Vd）也显著大于[68Ga]Ga-1（分别为8.60 ± 1.88 mL vs 5.66 ± 1.39 mL，*p = 0.0151，图6B）。[68Ga]Ga-F1的血浆半衰期也显著短于[68Ga]Ga-1（分别为2.21 ± 1.02 h vs 4.86 ± 2.19 h，*p = 0.0227，图6C）。[68Ga]Ga-F1在主要器官中的总暴露量（AUCinf）低于[68Ga]Ga-1，尤其是在肝脏（分别为22.9 ± 6.8 %ID/g.h vs 102.9 ± 53.1 %ID/g.h，****p <0.0001）和心脏（分别为25.9 ± 6.3%ID/g.h vs 52.6 ± 14.9 %ID/g.h，*p = 0.0455），而在大脑（分别为6.4 ± 0.8 %ID/g.h vs 9.8 ± 2.2 %ID/g.h，P = 0.7923）和肺部（分别为16.4 ± 3.6 %ID/g vs 27.7 ± 11.6 %ID/g，P = 0.3870）中也较低，图6D）。药代动力学数据：（A）血浆清除率，（B）分布体积，（C）血浆半衰期，（D）肝脏、心脏、大脑和肺部的暴露量（AUCinf）分别为[68Ga]Ga-1和[68Ga]Ga-F1。数据平均值±标准差（n = 6）通过非配对t检验（A, B和C）或单向方差分析（D）进行检验，*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。

3.6 氟化作用改善了肿瘤模型的PET成像
鉴于氟化纳米系统的良好生物分布，我们进一步使用PET成像在原位胰腺腺癌小鼠模型和异位胶质母细胞瘤小鼠模型上进行了肿瘤检测。在两种肿瘤异种移植模型中，[68Ga]Ga-F1@的PET成像背景更低，图像对比度更好（图7A,D）。在原位胰腺腺癌SOJ-6小鼠模型（n = 5）中，注射后2小时[68Ga]Ga-F1@在肝脏中的PET信号量显著降低了45%（分别为3.4 ± 0.78 %ID/cm3 vs 6.1 ± 1.5 %ID/cm3，**p = 0.0093），注射后4小时进一步降低了56%（分别为2.8 ± 0.6 %ID/cm3 vs 6.4 ± 1.7 %ID/cm3，**p = 0.0089，图7B）。相反，[68Ga]Ga-F1@的肿瘤与肝脏的PET信号比率在注射后2小时显著增加了36%（分别为0.83 ± 0.31 vs 0.53 ± 0.26，*p = 0.0428），注射后4小时进一步增加了19%（分别为1.02 ± 0.39 vs 0.83 ± 0.31，*p = 0.0316，图7C）。通过PET/CT成像在注射后2小时对[68Ga]Ga-1@和[68Ga]Ga-F1@在健康小鼠体内的分布进行了比较（图7）。在原位SOJ-6胰腺腺癌模型中，注射后2小时[68Ga]Ga-F1@在肝脏中的PET信号量降低了45%（分别为3.4 ± 0.78 %ID/cm3 vs 6.1 ± 1.5 %ID/cm3，**p = 0.0093），而在注射后4小时进一步降低了56%（分别为2.8 ± 0.6 %ID/cm3 vs 6.4 ± 1.7 %ID/cm3，**p = 0.0089），图7B。在异位U87胶质母细胞瘤模型中，注射后2小时[68Ga]Ga-F1@的肿瘤与肝脏的PET信号比率显著增加了36%（分别为0.83 ± 0.31 vs 0.53 ± 0.26，*p = 0.0428），注射后4小时进一步增加了19%（分别为1.02 ± 0.39 vs 0.83 ± 0.31，*p = 0.0316，图7C）。比较[68Ga]Ga-1@和[68Ga]Ga-F1@在肿瘤成像中的表现，使用PET/CT代表图像（图A,B）。在原位SOJ-6胰腺腺癌模型中，注射后2小时[68Ga]Ga-1@或[68Ga]Ga-F1@的PET/CT代表图像（n = 5），并用橙色虚线标出（图A）。相关PET信号量在肝脏中的定量结果（图B）以及肿瘤与肝脏的比率（图C）。在异位U87胶质母细胞瘤模型中，注射后2小时[68Ga]Ga-1@或[68Ga]Ga-F1@的PET/CT代表图像（n = 5），并用红色虚线标出（图D）。相关PET信号量在肝脏中的定量结果（图E）以及肿瘤与肝脏的PET信号比率（图F）。在原位U87胶质母细胞瘤模型中，注射后4小时[68Ga]Ga-1@和[68Ga]Ga-F1@的PET/CT代表图像（n = 8），并用红色虚线标出（图G）。相关PET信号量在肝脏中的定量结果作为肿瘤与背景（小脑）的比率（图H），以及在肝脏中的比率（图I）和肿瘤与活体组织的比率（图J）（图J）。数据通过双向方差分析（two-way ANOVA）进行检验（B, C, E, F），以及配对t检验（H, I, J）：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。同样，在异位U87胶质母细胞瘤模型中，注射后2小时[68Ga]Ga-F1在肝脏中的PET信号量显著低于[68Ga]Ga-1（分别为3.66 ± 0.59 %ID/g vs 6.53 ± 0.95 %ID/cm3，***p = 0.0001），注射后4小时进一步降低了57%（分别为2.83 ± 0.50 %ID/cm3 vs 6.55 ± 0.9由于这两种纳米系统在表面都具有相同的化学树状结构实体，并且具有相似的ζ电位（分别为+12 mV和+9 mV），因此表面电荷无法解释它们之间的差异。氟化疏水核心的作用显得至关重要，这与我们之前的研究结果一致，即内部化学实体和疏水性可以决定该纳米系统在体内的命运[14]。除了C-F键的固有性质（高电负性、强诱导效应、生物代谢惰性[17, 23]）之外，较低的肝脏摄取量也可能反映了纳米粒子表面蛋白质层的改变。这一假设可以通过未来的蛋白质层谱分析和体外细胞摄取实验来验证。关于体内结构完整性，对于这类系统来说，直接表征生物矩阵中的自组装纳米粒子在分析上仍然具有挑战性[9-12]；然而，有几项间接证据表明纳米粒子在体内不会发生显著降解：在人类血清中，[68Ga]Ga-F1@的放射性标记稳定性超过95%，持续时间为4小时；[68Ga]Ga-F1@的骨骼滞留量明显低于[68Ga]Ga-1@（分别为0.55 ± 0.16% vs 1.30 ± 0.19% ID/g，*P = 0.0264），而骨骼滞留量是[68Ga]Ga-F1@释放[68Ga]Ga3+的一个敏感指标[24]；此外，整体的生物分布模式也与纳米粒子未发生降解的情况相符。从安全角度来看，[68Ga]Ga-F1@相比[68Ga]Ga-1@较低的骨骼滞留量是令人放心的，因为已知氟在长期暴露下会在骨骼中积累[25]。在所给剂量下（小鼠剂量<0.0023 mg F/kg），氟的暴露量远低于欧盟食品安全局（EFSA）规定的每日安全限值[26]，并且在整个研究过程中未观察到任何毒性的迹象或不适症状。尽管如此，专门的代谢分析以及长期毒性测试仍被确定为未来转化研究的目标。改进的药代动力学特性直接转化为在三种独立肿瘤模型中的更佳肿瘤成像效果（见图6）。在原位胰腺腺癌细胞模型中，注射后2小时肝脏摄取量减少了44%，4小时减少了56%，从而显著提高了肿瘤与肝脏的比值。在外部胶质母细胞瘤模型中也观察到了类似的减少趋势（2小时减少超过40%，4小时减少超过57%）。最引人注目的是，在原位胶质母细胞瘤小鼠模型中，[68Ga]Ga-F1@的脑肿瘤与小脑的比值明显高于[68Ga]Ga-1@，其中小脑被用作内部参照。据我们所知，这是首次证明仅通过氟化处理，无需主动靶向，就能在全身给药后提高脑肿瘤的成像效果，而大多数研究依赖于主动转运机制来穿越血脑屏障[27-30]。总体而言，氟化树状纳米系统主要器官暴露量的减少、更快的分布以及肿瘤靶向性的优化，促使我们探索一种诊疗一体化的方法。这个树状纳米平台可以通过添加靶向配体来进一步提高肿瘤特异性。下一步将开发和评估引入分子靶向机制，以补充现有的被动EPR靶向方法，并考虑药物装载问题。作为主动靶向的具体概念验证，我们目前正在评估[68Ga]Ga-F1@的RGD功能性衍生物，旨在将整合素介导的肿瘤靶向作用添加到此处展示的良好被动生物分布特性中。正在研究的主要假设是，主动RGD靶向将进一步提高肿瘤摄取量，同时保持氟化处理带来的低肝脏滞留效果：这种组合在非氟化纳米平台上很难实现。这些结果将在即将发表的论文中报告。

5 结论

本研究开发的基于氟化树状聚合物的PET放射性示踪剂[68Ga]Ga-F1@在体内表现显著优于其非氟化版本[68Ga]Ga-1@，包括较低的肝脏摄取量、增强的肾脏清除率以及更高的肿瘤与背景图像对比度。这项研究表明，明智地在纳米材料中引入氟基团是一种独特且有前景的方法，可以调节纳米示踪剂的药代动力学特性和生物分布，从而实现更有效和准确的肿瘤成像。作者贡献

PG、BG和LP协调了项目；TR、LD和ZL合成了这些化合物；TR、TCD、LD和BL进行了表征实验；EL进行了ITC实验；BL、TCD、AB和VN进行了放射合成；BL、TCD、PG和LB负责体内成像采集和图像处理；JO和FG进行了药代动力学分析；TR、LD、EL、BL、TCD、LB、VN、SP、PG和LP分析了数据；TR、BL、TCD、PG、JO、FG、FDG、BG和LP共同撰写了论文。TR、BL、AB、EL、SP、PG和LP修订了手稿。所有作者都对手稿进行了校对。

致谢

本研究得到了法国国家抗癌联盟（EL2016, EL2021 LNCCLiP, LP；博士奖学金，TD, ZL）、法国国家研究署在ERA-NET EURONANOMED欧洲研究项目“NAN-4-TUM”（LP）框架下的支持，以及在2022年“THERAnanoSTIC”项目框架下的支持（PG），欧盟H2020研究与创新计划NMBP“SAFE-N-MEDTECH”（2019-2023）（授权协议编号814607，TR, LP），欧盟Horizon Europe研究与创新计划Cancer Mission“HIT-GLIO”（2023-2027）（编号101136835，LP）以及中国国家留学基金管理委员会（LD）的支持。部分工作由法国生命成像网络的成员机构完成（授权编号ANR-11-INBS-0006，CERIMED, BG, PG）。作者感谢Sandrine Pons女士、Nadhumati Abdou女士、Michel Skandalovski先生和Samy Vigier先生的技术支持。开放获取出版物的资金由COUPERIN CY26提供。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明

支持本研究结果的数据可向相应作者提出合理请求后获得。