一种仿生相分离水凝胶能够增强局部化学病毒疗法的效果，从而根除复发性胶质母细胞瘤

《Journal of Controlled Release》：A biomimetic phase-separating hydrogel potentiates local chemo-virotherapy to eradicate recurrent glioblastoma

　　

胡雅杰|农世彦|曾志伟|谭银秋|方翔|钟文静|王朝阳|隋晓峰|张鸿波|刘琪|王翠凤|徐洪超

中山大学药学院，中国广州 510006

摘要

将局部溶瘤病毒疗法与化疗相结合是一种预防胶质母细胞瘤（GBM）复发的合理策略，然而病毒与药物之间的物理和生物学不兼容性限制了它们的联合使用。受病毒液-液相分离（LLPS）的启发，我们开发了一种仿生相分离水凝胶（PSgel），能够实现溶瘤单纯疱疹病毒2型（HSV-2）和多激酶抑制剂索拉非尼的空间隔离和持续释放。从机制上讲，这种化疗-病毒组合共同降低了抑制性组蛋白标记H3K27me3的水平，从而逆转了表观遗传学耐药性。此外，这种组合还能协同重塑免疫抑制性的肿瘤微环境，表现为招募CD8⁺ T细胞和Iba-1⁺小胶质细胞。在临床上相关的术后GBM小鼠模型中，我们证明PSgel介导的HSV-2和索拉非尼联合给药能有效抑制肿瘤复发并显著延长总体生存期。这些发现表明，仿生相分离是一种解决药物-病毒不兼容性、克服表观遗传学耐药性并增强局部化疗疗效的结构性方法。

引言

胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最常见和最具侵袭性的原发性脑肿瘤，占所有恶性中枢神经系统肿瘤的50%以上[1]、[2]。目前GBM的标准治疗方法是最大限度的手术切除，随后进行辅助放疗和基于替莫唑胺（TMZ）的化疗[3]。尽管采取了这些措施，复发仍然几乎不可避免，五年生存率低于10%[4]、[5]。这种治疗失败的主要原因是GBM向周围脑实质的弥漫性浸润，这阻碍了彻底的手术清除[6]。因此，持续的残余肿瘤细胞会促进复发，这些细胞对标准化疗具有内在抗性，并能建立一个高度免疫抑制性的肿瘤微环境[7]、[8]。因此，开发有效的治疗策略需要清除浸润性GBM细胞并逆转免疫抑制性的肿瘤微环境。

溶瘤病毒（OVs）是治疗GBM的一种有效策略，它们既能直接裂解肿瘤细胞，又能刺激强烈的抗肿瘤免疫反应[9]。

然而，临床转化受到给药障碍的严重限制。由于全身给药受到血脑屏障（BBB）的阻碍，临床策略转向了向肿瘤团块或术后切除腔内的局部给药[10]。这种方法绕过了BBB，在残余疾病部位实现了高治疗浓度，使用诸如DNX-2401和G47Δ等药物在试验中取得了令人鼓舞的结果[11]、[12]。尽管如此，局部给药的“裸”病毒颗粒的有效性仍然有限。通过脑脊液（CSF）的快速清除以及先天免疫系统的即时中和，治疗窗口被大大缩短，阻碍了病毒的持续复制[13]、[14]。此外，液体制剂容易泄漏到相邻的健康组织中，引发了关于脱靶毒性的担忧[15]。为了解决这些问题，人们广泛探索了使用水凝胶支架来为OVs提供物理保护并实现局部持续释放[16]、[17]。然而，传统设计存在一个根本性的难题：具有松散网络的基质容易导致“突然释放”，而具有密集交联或强静电相互作用的基质则可能将病毒过度束缚，这种过度限制类似于黏膜屏障，严重阻碍了病毒进入肿瘤[18]。

此外，尽管溶瘤病毒疗法在临床上取得了一些成功，但单药治疗的效果往往不足，因此人们正在探索与化疗联合使用的策略以增强抗肿瘤效果[19]、[20]。目前，许多临床试验正在评估各种OVs（例如腺病毒、牛痘病毒和单纯疱疹病毒）与标准化疗药物（如吉西他滨和铂类药物）在多种实体肿瘤中的联合使用。这些联合方案通常包括已建立的化疗药物，如吉西他滨和铂类药物，以及靶向激酶抑制剂如索拉非尼[21]。值得注意的是，索拉非尼通过阻断Raf、VEGFR和PDGFR信号通路直接诱导肿瘤细胞凋亡和坏死[22]。这种多靶点抑制作用使其成为OVs的理想伙伴，因为它们的组合可以协同诱导肿瘤细胞死亡并全面重塑免疫抑制性的微环境[23]、[24]。然而，这种联合策略的临床转化受到OVs与化疗药物之间内在生物学冲突和物理化学不兼容性的严重阻碍。化疗可能会耗尽病毒复制所需的增殖肿瘤细胞，或者无差别地杀死病毒诱导的抗肿瘤免疫细胞。此外，直接暴露于高浓度的化疗药物会导致病毒不可逆的失活，从而影响其感染性[25]。因此，通过专门的给药系统克服这些兼容性问题是将这种协同作用转化为临床实践的先决条件。

液-液相分离（LLPS）是一种关键的生物物理机制，通过形成核仁和应激颗粒等生物分子凝聚体来分隔生化反应，而无需边界膜[26]。基于这一自然策略，LLPS已被用于设计水凝胶给药系统，应用于递送复杂的生物制剂，如线粒体和干细胞[27]、[28]、[29]、[30]、[31]。值得注意的是，LLPS在病毒学中起着关键作用；病毒已经进化出利用宿主细胞的LLPS机制来形成“病毒工厂”。这些有利于复制的凝聚体集中了病毒蛋白和核酸，促进了病毒颗粒的组装，并帮助病毒逃避宿主的先天免疫监视[9]、[32]、[33]。

在这里，我们受到病毒相分离自我保护机制的启发，并结合了我们之前关于双相给药系统的研究[34]、[35]，设计了一种仿生相分离水凝胶（PSgel）。该系统利用LLPS形成油包胶的双相结构，其中疏水性多激酶抑制剂索拉非尼（Sora）被分隔到基于鲨烯的油滴中，而两亲性的溶瘤单纯疱疹病毒2型（HSV-2）则优先定位于油-胶界面。这种隔离将病毒与小分子抑制剂物理分离，保持了病毒的活力，并实现了两种药物的持续释放。我们假设这种联合给药系统（HSV-2/Sora共载PSgel，HS@PSgel）可以协同增强化疗-病毒治疗效果，并重塑免疫抑制性的肿瘤微环境，从而抑制GBM的复发。

小节片段

HSV-2在GBM细胞中表现出依赖于Nectin-1的选择性溶瘤作用

我们首先研究了HSV-2在人类细胞系U-87 MG和小鼠细胞系GL261中的感染效果和毒性。结果表明，在U-87 MG细胞中，编码有GFP的HSV-2的溶瘤能力与感染率正相关，同时感染倍数（MOI）也有所增加（图1A、D、E 和表S1）。与先前的研究[36]、[37]一致，GL261细胞对HSV-2感染不敏感，且没有显著的毒性（图1B、D、F 和表S1）。

讨论

术后复发仍然是GBM管理中的主要挑战，突显了当前标准治疗方法在清除残余疾病方面的局限性。虽然最近批准的溶瘤HSV-1（G47Δ）展示了病毒治疗的潜力，但其更广泛的临床应用受到生理屏障的阻碍，特别是脑脊液的快速清除和先天免疫系统的中和。在这项研究中，我们建立了一种局部给药策略

试剂和抗体

索拉非尼（Cat# HY-10201）、吉西他滨（Cat# HY-17026）、替莫唑胺（Cat# HY-17364）、顺铂（Cat# HY-17394）、吉非替尼（Cat# HY-50895）和鲨烯（Cat# HY-N1214）购自MedChemExpress（美国新泽西州蒙茅斯 junction）。荧光异硫氰酸酯（FITC；Cat# 46425）、Hoechst 33342（Cat# H1399）和DAPI（Cat# 62248）购自Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）。溶瘤单纯疱疹病毒2型（HSV-2，BS-001）由拜晖生物制药（中国武汉）提供。

CRediT作者贡献声明

胡雅杰：撰写——初稿、方法学、正式分析。农世彦：撰写——初稿、方法学、正式分析。曾志伟：方法学、正式分析。谭银秋：方法学、正式分析。方翔：方法学、正式分析。钟文静：方法学、正式分析。王朝阳：方法学、正式分析。隋晓峰：研究、概念化。张鸿波：资金获取、撰写——审阅与编辑。刘琪：方法学、资金支持

利益冲突声明

作者声明没有竞争性财务利益。

致谢

本工作得到了中国国家自然科学基金（82073772, 82260578）、广东省基础与应用基础研究基金（2026A1515012480, 2023A1515010613, 2021B1515140044）、广东省科技计划（2025A0505020041）、东莞市科学技术局（20221800905702）以及深圳市科技计划（JCYJ20210324122214040）的支持。

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