微藻蛋白-海藻酸钠冷冻凝胶增强鼠李糖乳酪杆菌GG的冻干保护、胃肠道稳定性及控释

《Journal of Controlled Release》：Microalgal protein–alginate cryogels for enhanced lyoprotection, gastrointestinal stability, and controlled release of Lacticaseibacillus rhamnosus GG

　　

本研究阐明了微藻蛋白，特别是螺旋藻（SPI）、小球藻（CPI）及其等比例混合物，在构建基于海藻酸钠（NaAlg）的冷冻凝胶以及在调节鼠李糖乳酪杆菌GG（LGG）的存活率和粘附特性中的作用。所有基质均确保了LGG在冷冻干燥过程中的近乎完全保存（~10 log CFU g?1），反映了通过蛋白-多糖网络内的冷冻浓缩、氢键作用和玻璃化作用实现的协同稳定。储存稳定性主要受水活度和温度控制，但与热物理特性密切相关：较高的玻璃化转变温度（Tg）和玻璃态条件显著降低了失活动力学，其中基于SPI的冷冻凝胶表现出最长的保质期（在aw0.11、20 °C条件下长达320天）。在半动态消化过程中，依赖于蛋白的胶体转变决定了LGG的保护和释放。SPI系统形成了致密胃部聚集体，限制了酶的扩散并实现了受控的肠道释放，导致优异的消化后活力（~9.6 log CFU g?1），而CPI和SPI:CPI基质则显示出更大的损失。这些功能差异在机制上与冷冻凝胶的微观结构特征相关联，包括高孔隙率（76–78%）结构、蛋白特异性的孔壁形态和聚集行为，尽管其整体机械性能（如刚度和硬度）相似。SPI冷冻凝胶保留了LGG细胞对肠上皮细胞共培养模型粘液层的粘附（4.8 log CFU cm?2），显示出与消化后活力之间的强相关性。总之，微藻蛋白，特别是SPI，控制了冷冻凝胶结构、物理状态和胶体行为之间的相互作用。这使得该系统具有高冻干保护性、延长保质期以及改善的胃肠道存活率和细胞粘附特性，匹配或超过了传统的冻干微载体。

该研究发表于《Journal of Controlled Release》，针对活体药物载体（Living drug carriers）在临床转化中面临的加工稳定性差、保质期短及胃肠道应激存活率低的核心挑战，探讨了利用微藻蛋白替代传统动物源性蛋白构建新型益生菌输送系统的可行性。研究人员聚焦于微藻蛋白——钝顶螺旋藻（Spirulina, SPI）和蛋白核小球藻（Chlorella, CPI）及其1:1混合物（SPI:CPI）——与海藻酸钠（Sodium alginate, NaAlg）复合制备冷冻凝胶（Cryogels），旨在阐明其对鼠李糖乳酪杆菌GG（Lacticaseibacillus rhamnosus GG, LGG）的保护机制及功能性调控作用。研究结果表明，微藻蛋白的种类显著影响了冷冻凝胶的微观结构、热物理状态及胶体行为，其中SPI基质的综合表现最优，为解决益生菌递送中的关键技术瓶颈提供了新的策略。

为实现上述目标，研究人员采用了多项关键技术方法。首先，通过冷冻凝胶化技术（Cryogelation）在亚零度条件下构建了多孔互穿网络结构，并系统评估了不同蛋白组分对基质架构的影响。其次，利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析了蛋白质二级结构的化学相互作用。第三，通过测定玻璃化转变温度（T_g）等热物理参数，建立了基质物理状态与储存稳定性的关联模型。第四，采用半动态体外消化模型模拟胃肠道环境，追踪LGG的释放动力学及存活率。最后，利用肠上皮细胞共培养模型评估了LGG对粘液层的细胞粘附能力。

研究结果显示：

蛋白二级结构（Protein secondary structure）：

通过FTIR光谱分析发现，所有样品均表现出蛋白质二级结构的特征谱带，包括酰胺I带（1700–1600 cm^?1，C=O伸缩振动）、酰胺II带（1600–1500 cm^?1，N-H弯曲/C-N伸缩）和酰胺III带（1400–1200 cm^?1）。这些结果表明微藻蛋白与海藻酸钠之间形成了复杂的分子间相互作用，为基质提供了结构基础。

结论（Conclusions）：

本研究证实微藻蛋白-海藻酸盐冷冻凝胶是一种稳健且多功能LGG细胞稳定与控释平台。在所有配方中，冷冻干燥产生的宏观多孔网络提供了极佳的冻干保护，蛋白-海藻酸盐基质有效稳定了脱水过程中的LGG。尽管蛋白来源调节了微观结构和胶体特征的细微差异，但SPI基质在半动态消化中形成了致密的胃内聚集体，限制了酶扩散并实现了受控的肠道释放，从而获得了最高的消化后活力（~9.6 log CFU g^?1）和细胞粘附性（4.8 log CFU cm^?2）。此外，较高的玻璃化转变温度（T_g）和玻璃态条件显著降低了失活动力学，使得SPI基冷冻凝胶在20 °C、低水活度（a_w0.11）条件下保质期长达320天。总体而言，微藻蛋白（特别是SPI）通过调控冷冻凝胶的结构、物理状态和胶体行为，实现了高冻干保护性、延长保质期及改善的胃肠道转运功能，其性能匹配或超越了传统冻干微载体。

CRediT作者贡献声明（CRediT authorship contribution statement）：

Jennyfer Fortuin负责撰写-审阅和编辑、撰写-初稿、调研、资金获取、形式分析、概念化；Frédéric Addiego、Jerome Bour、Servane Contal、Beno?t Marcolini负责调研；Claire Gaiani负责撰写-审阅和编辑、调研；Marcus Iken负责撰写-审阅和编辑；Vincenzo Fogliano负责撰写-审阅和编辑、监督、概念化；Christos Soukoulis负责撰写-审阅和编辑、监督、概念化、调研、资金获取、形式分析、项目管理。

利益冲突声明（Declaration of competing interest）：

PM International AG对本研究的设计、数据收集与分析、出版决定或手稿的准备没有影响。LIST附属作者声明，该研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的财务关系的情况下进行的。

致谢（Acknowledgements）：

本研究由卢森堡国家研究基金（FNR）与PM-International AG共同资助（项目：ALGPRO，项目编号：15878670，资助计划：Industrial Fellowships）。感谢D. Odelli博士和L. You硕士分别在Zeta电位分析和粒度分析方面的协助，以及他们在消化实验期间的技术支持。