亚甲基插入揭示磷酸-磷酸距离在脱氧核糖核酸酶I切割中的重要性

《RSC Chemical Biology》：Methylene insertion reveals the importance of phosphate–phosphate distance in DNase I cleavage

　　

脱氧核糖核酸酶I（DNase I）是人血清中一种主要的核酸内切酶，可切割双链DNA（dsDNA）。尽管其活性在序列偏好和结构要求方面已被表征，但化学修饰对切割活性的影响仍未得到充分探索。在此，研究人员报道，在DNA底物的特定位置插入亚甲基会以一种位置依赖的方式显著改变DNase I的切割活性，根据插入位点的不同导致活性增强或抑制。这些发现表明，化学修饰可用于调节DNase I的活性，并提示局部结构，特别是磷酸基团之间的距离，对DNase I的切割具有显著影响。

该研究针对脱氧核糖核酸酶I（DNase I）在DNA纳米技术应用中易受降解的问题展开。DNase I作为人血清中的主要核酸内切酶，能够切割双链DNA（dsDNA）产生5'-磷酸化片段，这对DNA折纸、四面体DNA纳米结构（TDNs）等DNA基药物输送系统（DDS）的体内应用构成了挑战。虽然磷硫酰化等骨架修饰已被用于提高核酸酶的耐受性，但精确控制特定位点酶切活性的策略仍然有限。既往研究表明，DNase I诱导DNA发生约20°弯曲并使小沟增宽约3 ?，且氨基酸残基如R111、H134和H252能够识别切割位点附近的磷酸基团。然而，由于DNase I与DNA之间存在多重相互作用，究竟哪种相互作用对控制酶活性最为关键尚不清楚。为了阐明这一问题，研究人员采用了一种能够区分糖基和磷酸基团识别相对贡献的方法，即通过比较在C5'或C3'位置插入亚甲基（分别为5'-HMT和3'-HMT）对核酸酶降解敏感性的差异，以此评估磷酸-磷酸距离在DNase I切割机制中的重要性。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：首先，通过固相合成法结合标准亚磷酰胺化学制备了含有单磷酸（PO）连接及周围均为磷硫酰化（PS）连接的寡核苷酸（ON），并利用高效液相色谱（HPLC）进行纯化与表征；其次，采用紫外熔解实验（UV melting experiments）测定修饰后DNA双链的熔解温度（T_m）以验证其结构稳定性；随后，建立了DNase I切割分析体系，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并定量切割产物，通过比较初始反应速率估算催化效率比（η_T5/η_TT）；最后，通过分析不同序列背景下修饰底物的切割模式，探究了磷酸-磷酸距离变化对酶活性的影响。

在结果部分，合成与表征显示，5'-HMT和3'-HMT修饰均使双链DNA的T_m值轻微下降约1-2 °C，但仍保持足够的结构稳定性。在单磷酸位点实验中，研究人员发现5'-HMT修饰（T5）使DNase I的催化效率提高了约4.2倍，而3'-HMT修饰（3T）则完全抑制了酶的切割，即使将DNase I浓度提高一百倍也未观察到切割产物。序列偏好研究表明，这种效应在不同碱基环境中具有普适性，所有含5'-HMT的底物均表现出更快的切割速率，而所有含3'-HMT的底物均表现出极高的抗性。在相邻磷酸位点实验中，通过设计ooTT、TToo等序列发现，5'-HMT抑制了其下游+1位置的切割，而3'-HMT则完全抑制了切割位点0的切割，但对远端位点的切割影响较小。

讨论部分指出，通过对比5'-HMT和3'-HMT对DNase I活性的截然相反的调控作用，研究人员推断磷酸-磷酸距离的精确性，尤其是切割位点上游与R111残基相互作用的磷酸距离，对DNase I的识别和切割至关重要。尽管亚甲基插入通常会增加糖基的柔性，但实验结果排除了糖基柔性是主要决定因素的可能性。结论部分总结道，本研究系统性地评估了位置特异性亚甲基插入对DNase I活性的影响，揭示了切割位点上游磷酸-磷酸距离的重要性，并强调了R111相互作用的关键作用。这一发现不仅提供了一种通过精确控制DNA结构来调节酶活性的新框架，也修正了传统认为亚甲基插入仅用于增强抗酶解能力的认知，为核酸基技术的开发提供了重要的理论基础。该论文发表于《RSC Chemical Biology》。