《RSC Chemical Biology》：Igalan attenuates sepsis-induced inflammation through covalent targeting of the NLRP3 inflammasome pathway
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巨噬细胞在脓毒症（一种需要紧急干预的危及生命的全身性炎症综合征）中发挥关键作用。遗憾的是，目前尚无针对这一特定病理机制的获批药物。本研究鉴定出天然化合物Igalan，其可选择性破坏巨噬细胞介导的炎症级联反应。机制研究表明，Igalan可减轻氧化应激并维持线粒体
巨噬细胞在脓毒症（一种需要紧急干预的危及生命的全身性炎症综合征）中发挥关键作用。遗憾的是，目前尚无针对这一特定病理机制的获批药物。本研究鉴定出天然化合物Igalan，其可选择性破坏巨噬细胞介导的炎症级联反应。机制研究表明，Igalan可减轻氧化应激并维持线粒体完整性。至关重要的是，研究人员揭示Igalan可共价修饰NLRP3（NLR家族pyrin结构域包含蛋白3）的NACHT结构域，从而不可逆地抑制炎症小体的激活及随后的促炎信号传导。体内研究显示，Igalan具有显著的治疗效果，可减轻LPS（脂多糖）攻击的斑马鱼的全身性炎症，并在小鼠脓毒症模型中保护肺损伤和肠屏障功能障碍。总之，该研究确立了Igalan作为一种具有转化潜力的治疗脓毒症的共价NLRP3抑制剂的地位。
研究人员针对脓毒症治疗中缺乏特异性靶点药物的现状，对天然产物Igalan的抗脓毒症机制进行了系统解析。该研究揭示了Igalan作为一种新型共价NLRP3抑制剂的作用机制，证实了其在体外细胞模型及体内斑马鱼和小鼠脓毒症模型中的显著疗效，相关成果发表于《RSC Chemical Biology》。研究首先通过化学蛋白质组学结合分子对接技术，鉴定出NLRP3是Igalan的关键作用靶点，并明确了其共价修饰的具体位点。随后，研究人员利用荧光探针检测、蛋白免疫印迹及酶活性分析等手段，阐明了Igalan通过修饰NLRP3的NACHT结构域，抑制其ATP酶活性及构象变化，从而阻断炎症小体组装的分子机制。在体内外实验中，研究人员构建了LPS诱导的巨噬细胞炎症模型、斑马鱼全身炎症模型以及小鼠脓毒症模型，评估了Igalan对氧化应激、线粒体功能、炎性因子释放及组织病理损伤的改善作用。
关键技术方法包括：利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行化学蛋白质组学分析以鉴定Igalan修饰的靶蛋白；采用分子对接模拟预测Igalan与NLRP3的结合模式；通过荧光探针（DCFH-DA、MitoSOX、JC-1）检测细胞内及线粒体活性氧（ROS）水平和线粒体膜电位；运用蛋白免疫印迹（Western blotting）分析NLRP3炎症小体激活及相关蛋白（GSDMD、IL-1β）的表达；利用酶联免疫吸附试验（ELISA）定量细胞上清及血清中炎性因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）水平；构建LPS诱导的斑马鱼和小鼠脓毒症模型评估体内药效。
研究结果如下：
Igalan抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症反应：通过CCK-8法确定Igalan的非细胞毒性浓度范围后，研究人员发现Igalan能以浓度依赖方式显著抑制LPS刺激的iBMDM和RAW264.7巨噬细胞中一氧化氮（NO）的产生，并降低IL-1β、TNF-α和IL-6等促炎因子的合成，表明其具有显著的抗炎活性。
Igalan通过减轻氧化应激缓解LPS诱导的线粒体功能障碍：利用DCFH-DA和MitoSOX染色发现，Igalan可有效抑制LPS诱导的巨噬细胞内总ROS及线粒体超氧化物（mitochondrial superoxide）的过度产生。同时，JC-1染色结果显示Igalan能显著阻止LPS引起的线粒体膜电位（ΔΨm）崩溃，证实其通过清除ROS维持了线粒体结构与功能的完整性。
Igalan通过共价修饰NLRP3阻断炎症小体信号传导以抑制巨噬细胞活化：化学蛋白质组学分析鉴定出140个Igalan修饰的蛋白，其中NLRP3被重点关注。分子对接及高分辨质谱验证Igalan通过其α,β-不饱和酮结构与NLRP3的Cys704发生迈克尔加成（Michael addition）形成共价连接。该修饰位于NLRP3的过渡性富含亮氨酸重复序列（trLRR）结构域，能够稳定NACHT与LRR结构域间的界面，阻止NLRP3激活所需的构象变化，进而抑制NLRP3炎症小体的组装、GSDMD的切割及IL-1β的成熟。突变救援实验进一步证实，Cys704位点的突变（C704S）完全消除了Igalan对IL-1β释放的抑制作用。
Igalan抑制斑马鱼和小鼠脓毒症模型中的LPS诱导炎症：在斑马鱼模型中，Igalan显著降低了LPS诱导的全身性ROS水平。在小鼠模型中，Igalan预处理显著抑制了血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的释放。组织病理学分析显示，Igalan减轻了LPS引起的肺部单核巨噬细胞浸润及小肠黏膜损伤，并通过下调肺组织中TNF-α的表达及恢复肠道紧密连接蛋白ZO-1的水平，有效保护了肺和肠道的组织屏障功能。
讨论与结论部分总结：讨论指出，脓毒症病理生理学主要由NLRP3炎症小体信号驱动。本研究确立了Igalan通过共价修饰Cys704，限制NLRP3 NACHT结构域的ATP水解依赖性构象变化，从而抑制炎症小体组装的机制。尽管化学蛋白质组学显示在2 μM浓度下核糖体等结构蛋白被修饰，但低丰度的NLR通路被确认为功能性关键靶点。分子对接表明Cys704的修饰形成了空间“锁”，使NACHT结构域维持在自抑制状态。此外，研究指出了iBMDM与RAW264.7细胞表型差异对药敏性的影响，并承认绘制Igalan的全景脱靶图谱仍是未来的目标。结论重申，Igalan是一种通过抑制ATP酶活性阻断NLRP3炎症小体组装的潜在脓毒症治疗药物。
