新型4原子连接子实现PROTAC开发与成像

《RSC Chemical Biology》：A new 4-atom linker enables PROTAC development and imaging

　　

蛋白水解靶向嵌合体（Proteolysis Targeting Chimeras, PROTACs）是一种异双功能分子，已成为一类极具前景的药物。在其结构组件中，连接子部分在调节其生物活性和理化性质方面起着关键作用。目前的PROTAC设计策略涉及利用更短且更刚性的连接子，以限制三元复合物内可能的构象数量。研究人员假设，采用短的双炔间隔基作为两个配体之间的连接子可以产生高效能的PROTACs。在此，研究人员报告了一系列带有双炔基团的低纳摩尔级BRD4降解剂，这些降解剂能够招募CRL4CRBNE3连接酶复合物。除了提供高活性降解剂外，这种拉曼活性的双炔基团还能够通过受激拉曼散射（Stimulated Raman Scattering, SRS）显微镜技术，在微摩尔浓度下实现对细胞内药物摄取的无标记可视化。这项工作展示了基于双炔的PROTAC连接子在药物开发以及解决该领域内理解PROTAC细胞摄取机制和细胞内定位这一关键挑战方面的潜力。

论文解读：新型双炔连接子赋能PROTAC的高效降解与无标记成像

研究背景与现状

蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）作为一种新兴的药物模式，通过招募泛素蛋白酶体系统（UPS）实现靶蛋白的降解。然而，PROTAC的设计仍面临巨大挑战，特别是连接子（Linker）的化学空间探索有限。传统观点认为较短且刚性的连接子有助于限制三元复合物的构象自由度，从而增强复合物稳定性并降低分子量，但最优连接子的筛选往往耗时漫长。此外，尽管PROTAC在药物研发中进展显著，但在高分辨率成像领域仍显滞后，关于其细胞内摄取机制、定位及分布的研究手段匮乏，这限制了对其作用机制的深入理解。现有的成像方法往往需要引入荧光标签，可能干扰分子本身的药代动力学性质。

研究目的与意义

针对上述问题，研究人员旨在评估一种刚性的4原子双炔连接子（diyne spacer）在PROTAC开发中的应用潜力。该研究不仅期望通过这种新型连接子获得高效能的降解剂，更试图利用其独特的拉曼活性，通过受激拉曼散射（SRS）显微镜技术实现无需化学标记的药物细胞内追踪。这项由Slavena等人在《RSC Chemical Biology》发表的研究，首次将双炔连接子同时用于增强PROTAC的药效学特性和作为内源性拉曼探针，为解决PROTAC领域的“连接子工程”和“药物成像”两大难题提供了创新思路。

关键技术方法

研究人员主要采用以下技术手段：首先，通过有机合成构建了四种基于BRD4抑制剂(+)-JQ1和CRBN配体（来那度胺或其类似物1）的不同连接位点PROTAC分子（LS1-LS4）。其次，利用蛋白质印迹法（Western blot）和高内涵免疫荧光成像评估化合物对BRD4等BET家族蛋白的降解效率及半数降解浓度（DC₅₀）。第三，应用表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）技术测定二元及三元复合物（BRD4:PROTAC:CRBN）的结合动力学与协同性因子（α值）。第四，结合分子动力学模拟预测并验证了刚性连接子对三元复合物构象的限制作用。最后，利用多模态受激拉曼散射（SRS）显微镜，在细胞沉默区（~2200 cm^?1）对含双炔基团的PROTAC进行无标记、定量的亚细胞定位成像。

研究结果

1. 含双炔PROTAC的设计与合成

研究人员设计了两种连接位点不同的PROTAC系列：LS1和LS2通过(+)-JQ1苯环的对位连接，而LS3和LS4则通过酯基部分连接。所有化合物均通过Cadiot–Chodkiewicz偶联或酰胺键形成反应合成，纯度经LC-MS验证大于95%。

2. 短双炔连接子PROTAC是高活性的BET降解剂

Western blot分析显示，连接在对位的LS1和LS2表现出显著的BRD4降解能力，效果与阳性对照MZ1相当，且在300 nM浓度下可实现超过90%的降解。相比之下，连接在酯基的LS3和LS4活性较低。定量全细胞蛋白质组学分析进一步证实，LS1和LS2能有效下调BRD2、BRD3和BRD4。

3. BRD4的剂量和时间依赖性UPS降解

LS1和LS2表现出典型的钩状效应（hook effect），即在高浓度下因形成二元复合物而导致降解效率下降。免疫荧光实验显示，LS1和LS2处理导致BRD4核内斑点（puncta）减少，其DC₅₀值分别为35 nM和36 nM，优于MZ1并媲美ARV825。机制研究表明，预先使用蛋白酶体抑制剂MG132或neddylation抑制剂MLN4924处理可完全阻断LS2介导的降解，证实了该过程依赖于泛素蛋白酶体系统（UPS）。

4. 三元复合物建模与表面等离子共振（SPR）

计算建模显示，LS1的刚性结构极大地限制了BRD4与CRBN的相对取向，仅产生4种可行的构象。SPR实验数据表明，LS1和LS2均能与BRD4^BD1及CRBN形成稳定的三元复合物，并表现出正向协同性（positive cooperativity），其α值分别为3.1和高达31.1，表明连接子设计促进了复合物的稳定形成。

5. 通过SRS显微镜对LS1进行无标记可视化

SRS成像显示，在10 μM和1 μM的处理浓度下，LS1主要在细胞核周围的网状结构中积累，并与内质网（ER）共定位。定量分析表明，细胞内药物浓度相比处理浓度富集了50至200倍。有趣的是，尽管BRD4位于核内，LS1在核内的信号相对较弱，但在使用MG132抑制蛋白酶体后，LS1信号显著聚集在核仁聚集物中，提示其与底物蛋白的结合。

结论与讨论

本研究成功设计并合成了一系列基于4原子双炔连接子的PROTAC分子。研究发现，将对位连接的LS1和LS2不仅是高效的BRD4降解剂，其DC₅₀值达到纳摩尔级别，更重要的是，这种刚性连接子通过限制构象熵，促进了具有正向协同性的稳定三元复合物的形成。

从机制上看，该工作通过SPR和分子动力学模拟揭示了刚性双炔连接子如何精确桥接BRD4与CRBN，减少了非生产性构象的产生。在应用层面，该研究最具突破性的贡献在于利用了双炔基团的拉曼活性。研究人员证明，无需任何外源荧光标记，即可利用SRS显微镜在药物筛选常用的微摩尔浓度下实时观测PROTAC在活细胞内的动态分布。这不仅解决了传统标记可能干扰分子行为的难题，还意外发现PROTAC主要富集于内质网区域，即使其靶标位于细胞核内。

这项研究的意义在于，它不仅丰富了PROTAC连接子的化学工具箱，提供了一种兼具高降解效率和成像能力的新型分子架构，也为未来研究PROTAC的跨膜转运机制、耐药细胞的药物分布以及优化药物递送策略提供了强有力的可视化工具。