与饲料限制引起的奶牛、母羊和山羊乳脂分解相关的变量在物种间的特异性特征

《Journal of Dairy Science》：Species-specific characteristics of variables associated with milk lipolysis induced by a feed restriction in cows, ewes and goats.

　　劳伦斯·伯纳德|安德里亚·劳|凯瑟琳·于尔托|海伦·拉罗克|穆里尔·邦内|克里斯泰尔·塞博|米莱娜·德洛西埃尔
克莱蒙奥弗涅大学，INRAE，VetAgro Sup，UMR Herbivores，法国63122圣热纳斯-尚帕内勒

**摘要**
反刍动物的乳脂分解是一个主要问题，因为它会影响乳品的质量及其加工性能。先前的研究表明，类似的饮食限制会显著增加奶牛的乳脂分解，而减少了母羊的乳脂分解，并对山羊没有影响。本研究确定了与乳脂分解相关的多个变量，这些变量与奶牛、母羊和山羊的种类无关。为了探讨类似饮食限制对三种反刍动物（奶牛、母羊和山羊）乳脂分解的影响，进行了三项实验。这些实验采用2×2交叉设计，包括两种处理方式：“不限”（NR）组动物自由采食100%的日粮代谢量（DMI），以及“限制”（REST）组动物自由采食65%的DMI。研究人员测量了79个与产奶量、乳成分和乳脂分解相关的参数，以便进行种内和种间分析。对于种内分析，研究了各物种内部变量之间的相关性；对于种间分析，采用了两种方法：第一种是冗余分析（RDA），用于整合探索参数、饮食限制组及乳脂分解水平之间的关联趋势；第二种是多元整合方法（MINT），利用性能指标、乳汁和血浆参数来识别跨物种的潜在结构和共同协方差模式。结果发现：
1. REST组与NR组以及高乳脂分解组之间存在明显分离；
2. 所有物种对饮食限制的反应一致，表明存在共同的代谢反应。
我们的综合分析表明，饮食限制与乳脂分解之间存在强烈的物种间交互作用，即不同物种对饮食限制的反应存在显著差异。值得注意的是，奶中的尿素含量与奶牛的高乳脂分解相关。MINT方法未能提供关于乳脂分解相关的稳健跨物种潜在结构和共同协方差模式的视觉证据。在饮食限制期间，不同物种的脂肪组织动员情况不同，这体现在体脂动员范围及营养节省途径（如尿素生成）上，这可能是导致物种间乳脂分解反应差异的原因之一。

**解释性总结**
尽管饮食限制会增加奶牛的乳脂分解，从而影响乳品的技术特性和感官质量，但它会减少母羊的乳脂分解，并对山羊没有影响。本研究旨在探讨在相同限制饮食条件下，奶牛、母羊和山羊的差异变量，以识别与乳脂分解相关的参数之间的潜在协方差模式。通过对79个来自类似饮食限制研究的共同变量进行跨物种整合分析，得出了以下结果：
- 不同物种对饮食限制的反应强度不同；
- 不同物种在饮食限制下的脂肪组织动员情况不同；
- 乳脂分解和LPL活性表现出物种特异性反应；
- 奶中的尿素含量在不同物种中都与乳脂分解相关；
- 在奶牛中，尿素含量可能促进乳脂分解。

**引言**
乳脂分解是指乳脂中的甘油三酯（占乳脂的主要成分>98%）被脂肪蛋白酶（LPL；EC: 3.1.1.34）降解的过程，这会影响最终乳制品的质量及其加工适用性。这一过程会导致游离脂肪酸（FFA，包括短链脂肪酸和反式脂肪酸）的释放，其氧化会改变乳品的感官品质。此外，部分甘油的释放还会引起挤奶机中的泡沫现象，并影响乳品加工过程（如奶油分离阶段）。在影响乳脂自发性分解的因素中，饮食限制是显著增加奶牛乳脂分解的因素（Hurtaud等人，2023年），而在相同水平下，它会导致母羊乳脂分解减少（Bernard等人，2024年），对山羊则没有影响（Bernard等人，2026年）。假设在饮食限制期间，反刍动物会经历能量负平衡（Moore和DeVries，2020年；Pierre和Brulé，1981年），从而产生和分泌多种物质（如蛋白质、代谢物、脂质和脂肪酸）（Xu等人，2020年）。其中一些物质可能作为激活剂或抑制剂与LPL相互作用，或影响乳脂微粒膜（MFGM）的结构和稳定性，进而调节乳脂分解水平。研究表明，脱脂乳蛋白（Delosière等人，2023年）和原始乳脂（Bernard等人，2025年）与奶牛在饮食限制期间的乳脂分解增加有关。此外，母羊乳中的乳脂分解过程也涉及脱脂乳蛋白（Delosière等人，2025年）。然而，母羊和山羊对饮食限制的乳脂分解反应差异的原因尚不完全清楚。对于奶牛而言，乳脂分解是一个严重问题，因为其阈值仅为0.89 mEq/100 g脂肪。鉴于气候变化和饲料短缺可能增加奶牛的饮食限制情况，这一点尤其重要。目前，虽然奶羊的乳脂分解问题尚未受到重视，但随着市场上超新鲜奶羊产品数量的增加（例如在法国），这一情况可能会改变。在山羊中，脂肪乳脂分解会导致乳汁和奶酪等乳制品出现异味（Deeth，2006年）。因此，在法国某些具有原产地保护（PDO）的山羊奶酪产品规范中，会规定乳脂分解水平。在一些山羊养殖场，春季和夏季的乳脂分解水平会急剧上升，超过1.77 mEq/100 g脂肪（Raynal-Ljutovac，2003年）。因此，为保持乳品质量，必须持续监测乳脂分解，特别是在三种主要反刍动物（奶牛、母羊和山羊）中。本研究测量了经历饮食限制的奶牛（Hurtaud等人，2023年）、母羊（Bernard等人，2024年）和山羊（Bernard等人，2026年）的产奶量和乳成分、血液代谢物及乳脂分解参数。我们利用这些相似的饮食限制实验设计，结合三个奶牛物种的数据集进行了分析。在中午时分，提供了第二顿奶料，包括100克的乳用浓缩饲料和300克大麦。傍晚的挤奶时间是在16:30，在此期间，作为第三顿奶料提供了400克的乳用浓缩饲料，并在挤奶过程中分配给动物。为了确保每只山羊的摄入量相似并减少饲料摄入量的潜在差异，动物被固定在喂食架上。最后分配了三分之一的浓缩饲料（乳用浓缩饲料）。每天收集并称量被拒绝的饲料，以评估每组山羊的DMI（日摄入量）。

### 样本收集和实验室分析
根据先前论文中描述的采样协议和分析程序，测定了每个实验期间的饲料摄入量、实验日粮的化学组成和乳产量。对于所有物种，动物每天在挤奶厅被挤奶两次，每次挤奶时都会单独记录乳产量。

乳脂肪（包括游离脂肪酸FFA，作为乳脂肪度SL的指标）、蛋白质、乳糖含量和体细胞计数（SCC）是每周从两次连续的挤奶中使用相同方法测定的。使用中红外光谱仪（MilkoScan FT+光谱仪，Foss，Hiller?d，丹麦）来确定脂肪和蛋白质含量，而流式细胞术用于量化SCC。无论物种如何，用于测定SL、FFA谱型、乳脂肪球直径、乳蛋白和矿物质成分的乳样都是在同一挤奶过程中收集的。在每个实验期结束时（即小反刍动物经过4天饲料限制或奶牛经过5天饲料限制后），从早晨和傍晚的奶罐中单独收集乳样，然后根据后续分析需要将其储存在+4°C或-20°C。使用铜皂法测量牛奶中的SL、FFA（对于奶牛（MyLab，Janzé，法国）、母羊（LIAL，Aurillac，法国）和山羊（LILCO乳品实验室，Surgères，法国）的乳样）。奶中的FFA是在收集后24小时测定的（在+100°C下处理3分钟）。各物种之间的SL测量结果被认为是可比较的。对于所有3个实验，都按照Bernard等人（2005年）的方法，在早晨挤奶时测量了乳中的LPL（EC 3.1.1.34活性）。

### 血液采样
在每个实验期的最后一周，使用含肝素和EDTA的试管（VT-050SHL，Venoject，Terumo Europe，Leuven，比利时）从奶牛的尾部和母羊及山羊的颈静脉中采集血液样本。血液离心后，血浆被储存在-20°C直至分析。使用与先前描述的方法相同的方法测定血浆中的葡萄糖、尿素、乙酸盐、非酯化脂肪酸（NEFA）、甘油三酯、胆固醇、乳糖、β-羟基丁酸、胰岛素、IGF1和催乳素的浓度（Hurtaud等人，2023年）。有关动物、实验设计、处理、测量、样本收集和实验室分析的更多详细信息，可以参考Hurtaud等人（2023年；Bernard等人，2024年，2026年）的研究。

### 统计分析
#### 数据预处理和Spearman相关性
表1展示了包含79个变量的结构化列表，这些变量按领域分类：性能、乳成分、脂肪球和酪蛋白参数、血浆和激素参数以及采样时间（早晨/傍晚）。跨物种的综合分析集中在所有3个物种（奶牛、母羊、山羊）的饲料限制研究中测量的79个参数上。有一只饮食受限的母羊（e38_REST）的早晨脂肪分解值记录为0，该值用饮食受限母羊的平均值进行了插补。观察到每物种的早晨和傍晚脂肪分解（Lipo_cs_m, Lipo_cs_ev）以及早晨和傍晚SCC（SCC_m, SCC_ev）的单变量分布高度右偏。为了满足线性建模的假设，这些变量在R（v4.4.0）中进行了对数转换。计算Spearman相关性以评估同一物种内变量对之间的相似性。为了确保跨物种测量的可比性，所有变量随后在物种内进行了中心化和标准化。最后，使用k最近邻方法（k=3）填补了每个物种中的缺失值（分别占奶牛、母羊和山羊的0.7%、0.8%和0.2%的数值）。

#### 表1
表1列出了所有3个物种（奶牛、母羊、山羊）在饲料限制研究中测量的79个变量的结构化列表，按领域（性能、乳成分、脂肪球和酪蛋白参数、血浆和激素参数；以及采样时间（早晨/傍晚）进行分类。变量包括缩写、名称、单位和显著性。

#### 变量分类
- **变量缩写** | **变量名称** | **采样时间** | **单位** | **显著性**
| --- | --- | --- | --- | --- |
| Milk_yield | 乳产量 | 天/公斤 | % | 每天乳产量 |
| Fat_cont | 乳脂肪含量 | 天/克 | % | 每天乳脂肪含量 |
| Prot_cont | 蛋白质含量 | 天/克 | % | 每天乳蛋白质含量 |
| SCC | 体细胞计数 | 10^3/毫升 | 个/毫升 | 每天乳细胞数量 |
| BW | 体重 | 公斤 | 公斤 | 体重 |
| CP_m | 粗蛋白 | 克/公斤早乳 | % | 乳总蛋白含量 |
| NPN_m | 非酪蛋白氮 | 克/公斤早乳 | % | 乳非酪蛋白氮 |
| urea_m | 尿素 | 毫克/升 | 每天早乳 | 每升乳尿素含量 |
| Cas_m | 酪蛋白 | 克/公斤早乳 | % | 乳酪蛋白含量 |
| Protein_m | 真正蛋白质 | 克/公斤早乳 | % | 乳真正蛋白质含量 |
| Sol PROT | 可溶性蛋白 | 克/公斤早乳 | % | 乳可溶性蛋白质含量 |
| Cas_Ratio_m | 酪蛋白/真正蛋白质比率 | % | 乳酪蛋白/真正蛋白质比率 |
| LPL_Activ_m | 乳脂蛋白酶活性 | 毫摩尔/分钟/毫升 | 早乳 |
| Lipo_cs_m | 脂肪分解（铜皂法） | 毫当量/100克脂肪 | 早乳 |
| Lipo_cs_ev | 脂肪分解（铜皂法） | 毫当量/100克脂肪 | 晚乳 |
| D43_D | 脂肪球直径4.3 | 微米 | 乳脂肪球直径 |
| D32_D | 脂肪球直径3.2 | 微米 | 乳脂肪球直径 |
| D10_D | 脂肪球直径10 | 微米 | 乳脂肪球直径 |
| D50_D | 脂肪球直径50 | 微米 | 乳脂肪球直径 |
| D90_D | 脂肪球直径90 | 微米 | 乳脂肪球直径 |
| S_m | 脂肪球表面积 | 平方米 | 乳脂肪球表面积 |
| CAS_D10_m | 酪蛋白微粒直径10 | 微米 | 乳酪蛋白微粒直径 |
| CAS_D32_m | 酪蛋白微粒直径3.2 | 微米 | 乳酪蛋白微粒直径 |
| CAS_D43_m | 酪蛋白微粒直径4.3 | 微米 | 乳酪蛋白微粒直径 |
| CAS_D50_m | 酪蛋白微粒直径50 | 微米 | 乳酪蛋白微粒直径 |
| CAS_D90_m | 酪蛋白微粒直径90 | 微米 | 乳酪蛋白微粒直径 |
| Plas_acet | 血浆乙酸盐 | 毫摩尔/升 | 血浆乙酸盐 |
| Plas_nefa | 血浆非酯化脂肪酸 | 毫克/升 | 血浆非酯化脂肪酸 |
| Plas_bhb | 血浆β-羟基丁酸 | 毫克/升 | 血浆β-羟基丁酸 |
| Plas_glu | 血浆葡萄糖 | 毫克/升 | 血浆葡萄糖 |
| Plas_lactose | 血浆乳糖 | 毫克/升 | 血浆乳糖 |
| Plas.Tag | 血浆甘油三酯 | 毫克/升 | 血浆甘油三酯 |
| Plas_urea | 血浆尿素 | 毫克/升 | 血浆尿素 |
| Plas_chol | 血浆胆固醇 | 毫克/升 | 血浆胆固醇 |
| prolactin | 血浆催乳素 | 纳克/毫升 | 血浆催乳素 |
| insulin | 血浆胰岛素 | 纳克/毫升 | 血浆胰岛素 |
| IGF1 | 类胰岛素生长因子-1 | 纳克/毫升 | 类胰岛素生长因子-1 |

#### 跨物种整合分析
冗余分析（RDA）结合了线性模型框架和通过主成分分析（PCA）进行降维，以建模多变量数据（Legendre P.和Legendre L., 2012）。RDA通过将响应变量矩阵（这里是每个物种在饲料限制试验中测量的79个参数）与包含重复动物效应、处理组（限制与非限制）和处理×物种（奶牛、母羊、山羊）交互作用的响应变量矩阵进行回归；注意，没有包括物种的主效应，因为它与个体动物效应混淆。随后使用PCA对拟合值进行降维，以计算最佳解释响应数据全局变化的正交轴，这些轴是解释变量的线性组合。这里我们使用vegan包（v2.6–6.1）进行了部分RDA。通过比较完整模型和空模型并使用F统计量以及999次随机排列的个体内置换测试（即vegan中的默认值）来评估RDA的总体显著性（Legendre等人，2011）。

#### 跨物种水平整合的多变量方法
我们使用多变量整合方法（MINT）（Rohart等人，2017a）来对3个物种的79个参数进行水平整合。MINT旨在建立一个共同的投影空间，以便识别能够最大化跨物种早晨和傍晚脂肪分解水平（Lipo_cs_m, Lipo_cs_ev）协方差的变量线性组合。在这里，我们在R（v4.4.0）中使用mixOmics包（v6.28.0；Rohart等人，2017b）进行了MINT。我们使用了无变量选择的偏最小二乘（PLS）回归模式，并特别关注根据它们在第一个MINT组件上的载荷绝对值对变量进行排名，该组件与早晨和傍晚脂肪分解的协方差最大。载荷强度正或负的变量对应于那些在物种间共享信息的变量，从而可能代表描述跨物种早晨和傍晚脂肪分解水平的可重复参数特征。

#### 结果
我们之前对奶牛、母羊和山羊进行的实验结果表明，饲料限制显著降低了乳产量并改变了这3个物种的代谢参数（补充表S1）。这些结果被重新用于识别与乳脂肪分解相关的动物或代谢特征，无论物种如何。

#### 跨物种共变量的相关性矩阵
从每个物种的79个参数之间的Spearman相关性（表1）中，发现奶牛（图1A）、母羊（图1B）和山羊（图1C）的相关模式相似，尽管强度不同，其中山羊的相关性强度最高。补充表S2报告了显著相关性的值及其相应的FDR，从而完成了图1（可在INRAE仓库（recherche.data.gouv.fr）上查看，链接：https://entrepot.recherche.data.gouv.fr/privateurl.xhtml?token = 4ed006f0-6c42-481a-aef2-c710f7b2439e）。因此，我们将重点缩小到3组变量：46个与乳参数相关的变量（图2），24个与脂肪球和酪蛋白参数相关的变量（图3），以及14个与血浆参数相关的变量（图4），所有这些变量都包括了早晨和傍晚乳样的SL水平（Lipo_cs_m, Lipo_cs_ev）。附加的表S2包含了这些图表中显著相关性的数值（及其相关的FDR），可以通过以下链接获取：https://entrepot.recherche.data.gouv.fr/privateurl.xhtml?token = 4ed006f0-6c42-481a-aef2-c710f7b2439e。下载：下载高分辨率图像（1MB）；下载：下载全尺寸图像。

图2. 物种特异性的Spearman相关性分析，涉及牛奶参数。对46个牛奶参数以及早晨和傍晚自发性脂肪分解进行了Spearman相关性分析；测量对象包括奶牛（A）、母羊（B）和山羊（C）。在每个图中，仅显示FDR小于5%的相关性。强烈的正相关和负相关分别用蓝色和红色表示。下载：下载高分辨率图像（610KB）；下载：下载全尺寸图像。

图3. 物种特异性的Spearman相关性分析，涉及脂肪球和酪蛋白参数。对24个脂肪球和酪蛋白参数以及早晨和傍晚自发性脂肪分解进行了Spearman相关性分析；测量对象包括奶牛（A）、母羊（B）和山羊（C）。在每个图中，仅显示FDR小于5%的相关性。强烈的正相关和负相关分别用蓝色和红色表示。下载：下载高分辨率图像（375KB）；下载：下载全尺寸图像。

图4. 物种特异性的Spearman相关性分析，涉及血浆参数。对14个血浆参数以及早晨和傍晚自发性脂肪分解进行了Spearman相关性分析；测量对象包括奶牛（A）、母羊（B）和山羊（C）。在每个图中，仅显示FDR小于5%的相关性。强烈的正相关和负相关分别用蓝色和红色表示。

在牛奶参数中（图2），各物种之间的相关模式相似，但整体强度呈递减趋势：山羊 > 奶牛 > 母羊。在山羊牛奶中，SL与所有蛋白质参数（Prot_cont、Crude protein、Casein、TrueProtein、Soluble_Prot）以及可溶性磷呈负相关。在奶牛牛奶中，SL也与所有蛋白质参数呈负相关，但不如山羊明显，可溶性磷除外。同时，LPL活性与山羊牛奶、Fat_yield和Prot_yield呈正相关。而在奶牛牛奶中，LPL活性与牛奶、Fat_yield和Prot_yield呈负相关。母羊牛奶的结果介于两者之间，这些参数之间没有明显的相关性。

在脂肪球和酪蛋白参数的相关性中（图3），各物种之间的模式有所不同。特别是，在山羊中观察到的SL与脂肪球表面（S_m）之间的轻微正相关在奶牛和母羊中未见。SL与酪蛋白胶束直径（CAS_D）之间的相关性也存在差异。此外，山羊中酪蛋白胶束的直径与S_m高度相关，而在奶牛中无相关，在母羊中则呈负相关。

在血浆和激素参数中（图4），SL仅在奶牛中与IGF1呈负相关，在母羊中与血浆NEFA（plas_nefa）呈负相关，在山羊中与血浆葡萄糖（plas_glu）呈负相关。SL在奶羊和山羊中与血浆醋酸盐呈正相关，但早晨和傍晚的水平略有差异。

为了全面了解处理措施及处理措施与物种相互作用对每种动物各变量的影响，我们进行了部分RDA分析，考虑到了每个个体的重复测量数据（图5）。RDA显示变量与处理组（F = 22.594，P < 0.001）和处理措施与物种相互作用（F = 10.754，P < 0.001）之间存在统计学上的显著关联。根据处理组（NR vs REST）的分组可以通过第一个RDA组分解释，而脂肪分解高的动物（奶牛REST、母羊NR、山羊NR）与脂肪分解低的动物（奶牛NR、母羊REST、山羊REST）则通过第二个RDA组分区分开来（图5A）。在RDA 1轴上，3个物种对饲料限制的反应一致，表明对处理措施有共同的代谢反应。相比之下，在与脂肪分解相关的轴（RDA 2轴）上，各物种对饲料限制的反应差异显著。奶牛和母羊对限制的反应方向相反，而山羊在REST组与NR组之间有较大的重叠，表明饲料限制对山羊的脂肪分解影响较小或没有影响（图5A）。例如，血浆NEFA（plas_nefa）和LPL活性（LPL.activ_m）在RDA 1轴上的负荷为正，表明这些变量与R组有正相关，但奶牛的数据集部分解释了这一结果。与脂肪分解相关的变量（RDA 2轴）反映了与潜在的多变量梯度的相关性，而不是与牛奶脂肪分解直接无关的物种独立关系。

综上所述，不同物种之间的相关性模式存在差异，但总体强度顺序为：山羊 > 奶牛 > 母羊。在山羊牛奶中，SL与所有蛋白质参数（Prot_cont、Crude protein、Casein、TrueProtein、Soluble_Prot）以及可溶性磷呈负相关。在奶牛牛奶中，SL也与所有蛋白质参数呈负相关，但程度较轻，可溶性磷除外。同时，LPL活性与山羊牛奶、Fat_yield和Prot_yield呈正相关。而奶牛牛奶中的LPL活性与牛奶、Fat_yield和Prot_yield呈负相关。母羊牛奶的结果介于两者之间，这些参数之间没有明显的相关性。

在脂肪球和酪蛋白参数的相关性中（图3），各物种之间的模式不同。特别是，山羊中SL与脂肪球表面（S_m）之间的轻微正相关在奶牛和母羊中未观察到。SL与酪蛋白胶束直径（CAS_D）之间的相关性也存在差异。此外，山羊中酪蛋白胶束的直径与S_m高度相关，而在奶牛中无相关，在母羊中则呈负相关。

在血浆和激素参数中（图4），SL仅在奶牛中与IGF1呈负相关，在母羊中与血浆NEFA（plas_nefa）呈负相关，在山羊中与血浆葡萄糖（plas_glu）呈负相关。SL在奶羊和山羊中与血浆醋酸盐呈正相关，早晨和傍晚的水平略有差异。

为了深入了解处理措施及其与物种相互作用对每种动物各变量的影响，我们进行了综合探索性分析（Integrative exploratory analysis），并考虑了每个个体的重复测量数据（图5）。RDA显示变量与处理组（F = 22.594，P < 0.001）和处理措施与物种相互作用（F = 10.754，P < 0.001）之间存在统计学上的显著关联。根据处理组（NR vs REST）的分组可以通过第一个RDA组分解释，而脂肪分解高的动物（奶牛REST、母羊NR、山羊NR）与脂肪分解低的动物（奶牛NR、母羊REST、山羊REST）则通过第二个RDA组分区分开来（图5A）。在RDA 1轴上，3个物种对饲料限制的反应一致，表明对处理措施有共同的代谢反应。而在与脂肪分解相关的轴（RDA 2轴）上，不同物种对饲料限制的反应差异显著。奶牛和母羊对限制的反应方向相反，而山羊在REST组和NR组之间的重叠较大，表明饲料限制对山羊的脂肪分解影响较小或没有影响（图5A）。例如，血浆NEFA（plas_nefa）和LPL活性（LPL_activ_m）在RDA 1轴上的负荷为正，表明这些变量与R组有正相关，但奶牛的数据集部分解释了这一结果。与脂肪分解相关的变量（RDA 2轴）反映了与潜在多变量梯度的相关性，而不是与牛奶脂肪分解直接无关的物种独立关系。

图5. 使用RDA进行跨物种多变量分析，涉及性能、牛奶和血浆参数。（A）RDA组分1和2，点代表具有给定处理组的个体动物（R = 限制饮食，NR = 非限制饮食）。椭圆代表每种物种和处理组组合的95%置信水平的多变量t分布。点和椭圆的颜色根据物种划分（奶牛 = 蓝色，母羊 = 绿色，山羊 = 红色），较浅的颜色对应NR组，较深的颜色对应R组。第一个轴可以解释NR和R组之间的区别，第二个轴可以解释脂肪分解水平的高低。（B）每个参数在RDA轴1上的负荷，从负到正排序。负值与NR处理相关，正值与R处理相关。（C）每个参数在RDA轴2上的负荷，从负到正排序。负值表示与脂肪分解相关的变量，正值表示与脂肪分解相反的变量。

在RDA 2轴（图5C）上，可溶性蛋白质（Soluble PROT_m）和晨牛奶中的蛋白质含量（Prot_cont_m）的正面负荷表明与脂肪分解水平呈负相关，而晨牛奶中的尿素（urea_m）、晨牛奶LPL活性（LPL.activ_m）和血浆尿素（plas_urea）的较高值与较高的脂肪分解水平相关。因此，RDA（图5）支持以下结论：饲料限制会引起一般的代谢反应（RDA 1轴），但强调了物种特异性的甚至在脂肪分解方面的相反反应（RDA 2轴）。

在RDA之后，我们进行了MINT水平整合分析，以探索3个物种异构数据集中的共享结构，并将其与SL关联起来。MINT评分图显示物种和处理之间有广泛的重叠，没有明确的 clustering或与牛奶脂肪分解相关的方向性梯度。前两个MINT轴仅解释了少量的脂肪分解变异性（分别为18%和6%）（图6A）。此外，代表脂肪分解值的颜色梯度显得模糊且结构不明确。通过关注第一个轴上负荷绝对值最大的前20个变量（图6B），我们注意到大多数变量与脂肪分解水平呈负相关，包括晨牛奶和晚牛奶中的可溶性磷（Sol_Phos_m、Sol_Phos_ev）和可溶性蛋白质（Soluble PROT_ev）。我们注意到血浆醋酸盐（plas_acetate）和晚牛奶中的尿素（Urea_ev）与脂肪分解水平呈正相关。然而，我们未能证明这些负荷是否始终由所有物种驱动，或者是否受到一个或两个物种的显著影响。结合RDA结果（图5）来看，MINT分析似乎减弱了先前在RDA的脂肪分解相关轴上观察到的显著物种特异性和相反的反应。

图6. 使用MINT进行跨物种水平整合。（A）MINT组分1和2，点代表具有给定处理的个体动物。点的颜色根据早晨和傍晚脂肪分解测量的平均值（Lipo_cs_m、Lipo_cs_ev）划分，形状表示物种（奶牛 = 圆形，母羊 = 三角形，山羊 = 方形）。第一个MINT轴对应于最大化与两个脂肪分解测量值协方差的轴；正值倾向于表示较低的脂肪分解水平，负值倾向于表示较高的脂肪分解水平。（B）前20个参数在MINT轴1上的负荷，按绝对值排序。负值与晨和傍晚脂肪分解呈正相关，正值与晨和傍晚脂肪分解呈负相关。

讨论

我们之前对奶牛、母羊和山羊的实验清楚地表明，短期饲料限制显著降低了这些物种的牛奶产量并改变了代谢参数。在这项工作中，我们使用共同的营养不足情况研究了物种特定和/或共同的牛奶脂肪分解反应。

饲料限制对奶牛反刍动物生理的影响

三种研究物种的血浆中非酯化脂肪酸（NEFA）的增加清楚地表明，短期饲料限制会触发脂肪组织的动员，以补偿营养摄入的减少，并反映了哺乳动物的系统性负能量平衡（Drackley, 1999; Contreras et al., 2017）。因此，一周的饲料限制预计会触发脂肪组织的脂肪分解，以维持能量供应（Gross et al., 2011），而糖原生成的氨基酸则优先用于乳糖合成，乳糖是牛奶体积的主要渗透驱动因素（Maxin et al., 2013, Mehaia, 1995）。

所有三种物种在饲料限制期间都会动员脂肪组织，但奶牛、母羊和山羊之间的脂肪分解强度、调节和代谢后果有所不同。在奶牛中，脂肪组织成为主要的能量来源，伴随着持续的NEFA释放和脂肪组织重塑（脂肪细胞大小减小、炎症和应激反应）（Contreras et al., 2017）。当这种动员强烈且持续时间较长时，可能导致奶牛出现代谢紊乱，如酮症、乳腺炎敏感性和/或脂肪肝。与奶牛类似，母羊的喂食不足会显著降低从头开始的脂肪生成，促进脂肪组织中的甘油三酯水解，并刺激脂肪分解，导致血浆NEFA浓度升高（Bonnet et al., 2000, Broderick and Clayton, 1997）。然而，母羊更容易出现高酮血症（妊娠/哺乳期毒血症），这反映了它们对脂肪动员和酮体产生的强烈依赖（Harmeyer and Schlumbohm, 2006）。同样，随着能量平衡的变化，绵羊牛奶中的脂肪浓度变化较大，表明绵羊牛奶中的脂肪酸主要来源于身体脂肪的动员（Pulina et al., 2006）。与奶牛和母羊相比，山羊通常被认为具有更高的代谢灵活性，因为它们能承受反复的喂食不足-再喂食周期，同时肝脏功能相对保持良好，临床紊乱较少（Gindri et al., 2024, Goselink et al., 2015）。一项关于哺乳期山羊的转录组研究证实了山羊脂肪组织的高度可塑性，研究表明它们的脂肪组织能够快速调整其脂质代谢、应激反应和炎症途径以应对饲料剥夺（Faulconnier et al., 2011）。在我们的研究中，虽然饲料限制导致奶牛牛奶中的SL增加，LPL活性和MFG直径也增加（表S1），但在母羊中却导致牛奶脂肪分解减少，这与LPL活性降低无关，但与MFG直径增加有关。最后，在山羊中，饮食限制并未显著影响牛奶脂肪分解水平或MFG直径，而观察到了牛奶LPL活性的显著降低（表S1）。牛奶SL的物种特异性差异可能反映了脂肪组织代谢、泌乳的内分泌调节和脂肪动员能力的已知物种间差异，尤其是在饲料限制条件下。

关于脂肪分解的物种特异性相关性

一致的相关模式，特别是牛奶参数之间的相关性，可能表明脂肪分解的调节机制相似，尽管在不同物种间的强度有所不同。由于不同物种对饲料限制的反应不同，因此测量变量之间的相关性也存在显著差异。例如，牛奶SL与蛋白质参数之间的负相关强度具有物种特异性，部分原因是由于牛奶中的蛋白质含量在不同物种间差异较大（奶牛为3.1至3.5克/100克（美国农业部，2024年；联合国粮食及农业组织，2013年），山羊为2.6至4.1克/100克（Raynal-Ljutovac et al., 2008年），母羊为4.7至7.2克/100克（Raynal-Ljutovac et al., 2008年）。此外，蛋白质浓度不同，酪蛋白胶束的组织和矿化也具有一定的反刍动物特异性（Raynal-Ljutovac et al., 2008年）。这些物种间牛奶成分模式的差异可能与它们各自的分泌机制有关（Raynal-Ljutovac和Lagriffoul，2010年）。此外，牛奶中的LPL主要与酪蛋白胶束相关，而在山羊奶中，它则更多地与脂肪球相关（Chilliard等，1984年）。因此，不同物种间脂肪球和酪蛋白胶束的差异可能部分解释了它们对脂肪分解酶（SL）反应的不同。仅在对山羊的研究中观察到SL与脂肪球表面积（S_m）以及酪蛋白尺寸参数之间存在正相关关系。与牛奶（43%）相比，山羊奶中含有更高比例（63%）直径小于3微米的脂肪球（Mehaie，1995年；Attaie和Richter，2000年）。此外，Cebo等（2012年）报告称，在山羊中，α(s1)-酪蛋白（CSN1S1）位点的遗传多态性会导致O/O基因型山羊的脂肪球直径比A/A基因型更小。另外，也有研究表明O/O基因型山羊的牛奶脂肪分解酶活性更高（Chilliard等，2006年；Valenti等，2010年）。这被认为与脂肪球直径较小有关，从而为消化酶（如LPL）提供了更大的作用表面。与此假设一致的是，我们之前的研究显示O/O基因型山羊的牛奶脂肪分解酶活性高于A/A基因型山羊（Bernard等，2026年）。同样，Remeuf等（2001年）报告称O/O基因型山羊的牛奶酪蛋白含量较低，总钙含量较高，pH值更高，酪蛋白胶束体积更小、水分含量更低且矿化程度更低。这种现象可以用CSN1S1 O/O基因型乳腺上皮细胞中蛋白质及其他牛奶成分分泌的变化来解释（Chanat等，1999年）。我们还发现，仅在对母羊的研究中，血浆中的游离脂肪酸（NEFA）水平与脂肪分解酶活性呈负相关。这一结果反映了不同物种间脂质动员能力的差异，因为体脂储备较高的母羊比其他反刍动物更倾向于动员脂肪组织。牛奶脂肪分解酶活性的物种特异性差异反映了已知的脂肪组织代谢、泌乳的内分泌调节以及哺乳动物在饲料受限时的脂质动员能力差异。我们还注意到血浆中NEFA与乙酸之间的负相关关系，这可能表明反刍动物微生物群对饲料限制有特定适应性，促进了血液中乙酸的产生和循环（Loor等，2016年），这与传统上在饲料限制模型中观察到的NEFA变化相符。

通过多变量综合统计方法，我们发现了与多种物种脂肪分解相关的变量。如RDA分析所示，无论物种如何，牛奶和血浆中的尿素以及牛奶中的LPL活性都与早晨和晚上的脂肪分解活动有最强的正相关关系。值得注意的是，尿素在RDA和MINT分析中都被显著提及。尽管物种对饲料限制的反应存在差异，但牛奶或血浆尿素浓度与牛奶LPL活性之间的这种关联在三种物种中是一致的。具体来说，在饲料限制条件下，牛奶和血浆中的尿素含量在牛中均有所增加，而在母羊中则下降，在山羊中保持不变。这种物种特异性的反应可能是由于整体身体代谢或瘤胃消化过程的差异所致。在脂肪组织动员过程中，能量和氮代谢的变化可能导致牛奶中尿素含量的变化，从而在不同物种间观察到不同的尿素反应。例如，奶牛在过渡期表现出显著的脂肪动员，这与能量和氮代谢的变化相关，通常伴随牛奶中尿素含量的增加（Szura等，2020年）。关于尿素代谢，母羊对尿素具有较高的耐受性，因为肾脏和唾液腺中尿素的再循环是维持奶羊氮利用效率的关键机制，即使在饲料限制期间也是如此（Lobley等，2000年）。更具体地说，羔羊对低蛋白饮食的生理适应性包括肾脏对尿素的重新吸收和回收率增加，以及尿素向胃肠道的清除率增加（Marini等，2004年；Matthews等，2019年）。一项包含母羊研究的荟萃分析证实，饲料限制会刺激肾脏对尿素的再循环，从而减少其尿液损失并增加瘤胃微生物对其的利用，从而表现出较高的尿素耐受性和高效的代谢适应性（Batista等，2017年）。关于山羊的脂肪动员研究显示，其代谢反应与母羊和奶牛不同，这也与牛奶中尿素含量无显著差异相吻合（Sauvant等，1979年）。最近的研究还表明，Tsiplakou等（2011年）发现在相同饮食条件下，山羊和绵羊的皮下脂肪组织中脂肪生成基因的表达存在显著差异。Fougère等（2018年）比较了喂食含淀粉、植物油或鱼油的山羊和奶牛的代谢反应和牛奶成分。这两项研究表明，山羊的脂肪动员和能量调节方式与母羊和奶牛不同，且牛奶中的尿素含量没有显著变化。总体而言，这些结果表明尿素不能作为跨物种饲料限制的通用指标。需要进一步研究以确定尿素是否可以作为脂肪分解酶活性的有效指标。

先前比较不同放牧反刍动物消化和瘤胃功能的数据表明，动物物种对瘤胃细菌结构有明显影响（Ferreira等，2017年）。另一项关于奶牛和山羊的研究显示，反刍动物物种对脂质补充剂引起的瘤胃微生物群反应有显著影响（Corral-Jara等，未发表数据）。基于这些发现，我们假设饲料限制会导致不同物种的瘤胃微生物群反应不同，其中小型反刍动物（特别是母羊）的瘤胃微生物群能够更快地适应，而奶牛则适应较慢。另一种假设是，高血浆和牛奶尿素含量的微生物群可能导致能够激活脂肪分解酶的分子合成，或者尿素本身可能影响有利于LPL活性的参数（如MFGM的不稳定性等）。因此，尿素可能通过破坏血小板细胞膜中的磷脂酰丝氨酸来削弱脂肪球膜（Gatidis等，2010年）。此外，牛奶中的尿素还能直接与膜脂质相互作用（通过形成氢键），防止膜因脱水而发生从液态到凝胶状态的转变。尿素还能直接与蛋白质相互作用，并在体外导致蛋白质变性（Maiti和Daschakraborty，2021年）。因此，尿素可能与MFGM脂质和蛋白质的直接相互作用解释了脂肪球膜的弱化，从而促进了LPL的作用，尤其是奶牛中的脂肪分解。

结论

饲料限制在三种物种中都引发了一致的执行代谢反应。然而，这也显示出在牛奶脂肪分解方面存在明显的物种特异性甚至相反的反应。在饲料限制期间，不同物种的脂肪组织动员情况不同，这体现在动员的体脂范围以及相关的节俭营养物质途径（如尿素生成）上。这可能部分解释了不同物种对牛奶脂肪分解反应的差异。我们的研究表明，牛奶中的尿素与脂肪分解活动密切相关。特别是在牛奶中，尿素可以激活LPL并与MFGM中的脂质和蛋白质相互作用，从而促进脂肪分解。