在放牧条件下补充乳酸菌（Lactobacillus spp.）：对初乳期甲烷排放量和牛奶产量的影响

《Journal of Dairy Science》：Lactobacillus spp. supplementation under grazing conditions: Methane and milk production responses during early lactation

　　斯里莫尔·苏坦·奈尔（Sreemol Suthan Nair）|S. 理查德·O·威廉姆斯（S. Richard O. Williams）|奥丹·S·奥尼尔（Aodán S. ó Neachtain）|雷纳塔·托涅利（Renata Tognelli）|莫妮克·J·伯克豪特（Monique J. Berkhout）|苏巴什·昌德拉（Subhash Chandra）|巴勃罗·S·阿尔瓦雷斯-赫斯（Pablo S. Alvarez-Hess）|朗·程（Long Cheng）|乔·L·雅各布斯（Joe L. Jacobs）

**能源、环境与气候行动部，维多利亚农业研究**
**维多利亚州埃林班克，邮编3821，澳大利亚**

**摘要**
体外和体内研究均表明乳酸菌属（Lactobacillus spp.）具有减少肠道甲烷排放的潜力。然而，它们对饲喂高牧草日粮的泌乳早期奶牛的减排效果尚未得到研究。本研究评估了添加冻干或液态乳酸菌产品对饲喂高牧草日粮的泌乳早期奶牛肠道甲烷排放的影响。40头春季产犊的荷斯坦弗里斯安奶牛（Holstein Friesian）在多年生黑麦草（PRG，Lolium perenne L.）牧场上放牧，每天挤奶两次，被随机分配到三种处理组中，每个组持续35天：
1）对照组（CON）：基础日粮（n = 14）；
2）FLA组：基础日粮加冻干乳酸菌（剂量为5.0 × 10^10 cfu/次挤奶）；
3）LLA组：基础日粮加液态乳酸菌（剂量为5.75 × 10^10 cfu/次挤奶）。

**研究方法**
基础日粮包括每天6.9公斤干物质（DM）的谷物混合物，以及每天每头牛约25公斤的PRG牧草。在实验开始前的5天内进行了协变量观察。实验最后5天内，使用n-烷烃技术测定每头牛的日采食量，并采用改良的六氟化硫（SF6）示踪技术测量甲烷排放量。数据采用完全随机设计的方差分析（ANCOVA）进行分析。结果发现，无论采用哪种形式的乳酸菌，甲烷产量（g/天）、产量（g/kg DMI）或强度（g/kg能量校正牛奶）均无显著变化；不过FLA组甲烷产量比对照组降低了6%。对照组奶牛的甲烷排放量比使用估算值低约38%，这可能是由于PRG牧草纤维含量低、干物质含量低导致瘤胃通过速度加快，从而减少了甲烷在瘤胃中的滞留时间和发酵程度。高通过速度可能限制了补充乳酸菌的定植效果。此外，奶牛较大的瘤胃容积和较低的添加剂量也可能影响减排效果。值得注意的是，乳酸菌补充剂在小型反刍动物中的效果更为显著，说明不同物种之间存在差异。这些发现强调了需要针对特定环境的益生菌策略，特别是在基于牧草的奶牛系统中。

**解释性总结**
本研究评估了在春季牧场上放牧的泌乳早期奶牛中添加冻干或液态乳酸菌是否可以减少肠道甲烷排放并提高生产力。虽然甲烷指标表现出小幅正向变化，但对牛奶产量或饲料效率没有显著影响。结果表明，低纤维、高消化率的春季牧草可能限制了微生物的定植，因此需要制定个性化的策略。理解这些机制对于开发经济高效、环境可持续的方法来减少基于牧草的奶牛系统的肠道甲烷排放至关重要，同时不牺牲生产力。

**引言**
在澳大利亚典型的放牧型奶牛场，牛奶生产的平均温室气体排放强度约为每公斤脂肪和蛋白质校正牛奶（FPCM）1.07（±0.02）公斤二氧化碳当量（CO2e），其中肠道甲烷约占总排放量的57%（Christie, 2019）。与澳大利亚的圈养系统相比，放牧系统的总体排放强度相似（1.02 kg CO2e/kg FPCM），表明两者在环境效率上没有显著差异（Dida et al., 2025）。然而，不同系统的排放构成不同：放牧系统的肠道甲烷占比更高，而圈养系统的粪便相关温室气体排放量更大（Dida et al., 2025）。此外，系统的饲养行为、养分供应和瘤胃发酵动态也存在差异（Hartwiger et al., 2018）。放牧系统的日甲烷排放量受牧草营养特性、饲料摄入量、饲料添加剂施用方式及放牧强度等因素影响，使得减排效果难以维持（Soder and Brito, 2023）。因此，开发适用于放牧条件的肠道甲烷减排策略非常重要。

**饲料投递和饲养系统的影响**
Cameron等人（2018）指出，切割并携带（cut-and-carry）系统和放牧系统的绝对甲烷产量（MeP）低于全混合日粮（TMR）系统（分别低17%和39%），且这两组的甲烷强度（MeI，g methane/kg milk）也较低。这可能是由于奶牛的饲养行为改变影响了瘤胃发酵动态（Cameron et al., 2018）或TMR成分的变化（Nielsen et al., 2013），从而影响了甲烷产量。O'Neill等人（2011）的研究也证明了这一点：喂食TMR的牛比放牧多年生黑麦草的牛甲烷产量（MeY，g/kg DM）高出36%，甲烷强度（MeI）高出11%至13%。澳大利亚的奶牛通常在牧场上放牧，并在挤奶时补充谷物浓缩饲料。这种喂养频率和配方的限制使得在放牧系统中一致且有效地施用抗甲烷生成饲料添加剂具有挑战性。

**抗甲烷生成饲料添加剂的作用**
尽管多种抗甲烷生成饲料添加剂显示出减少放牧系统甲烷排放的潜力，但其效果取决于作用机制、配方、稳定性以及在商业化系统中的精确施用（Beauchemin et al., 2022）。关于甲烷减排策略的综述指出，直接饲喂的微生物（DFM）可能通过调节瘤胃微生物群落来减少反刍动物的甲烷排放（Hristov et al., 2013, Iglewicz and Hoaglin, 1993, Ncho et al., 2024）。乳酸菌等DFM主要用于改善反刍动物的饲料利用率和生长、促进纤维消化及减少瘤胃酸中毒风险（Doyle et al., 2019）。研究表明，DFM对幼牛的饲料转化效率（FCE）和初产奶牛的牛奶产量有积极作用（Moreira et al., 2017; Xu et al., 2017）。乳酸菌还被发现有助于大型（Philippeau et al., 2017）和小型反刍动物的甲烷减排（Jeyanathan et al., 2016）。尽管乳酸菌等DFM具有潜在益处，但将其引入放牧系统存在困难。确保 DFM在饲料加工、储存和投喂过程中的稳定性和活性至关重要，因为并非所有微生物菌株都能经受住这些过程（例如制粒时的热处理）或消化道的严酷条件（Seo et al., 2010, Ban and Guan, 2021）。宿主生理、环境因素和微生物适应性也会影响DFM的效果。持续供应活菌并保证动物间剂量均匀是实际应用DFM的关键（Ban and Guan, 2021）。目前尚不清楚哪种DFM配方最能有效长期抑制甲烷排放。市售的DFM产品有液态和冻干两种形式，但其在微生物活性、稳定性和瘤胃定植能力方面可能存在差异。了解哪种配方更有效对于在商业农场中的实际应用至关重要。

**研究目的**
本研究旨在确定每天两次挤奶时向泌乳早期奶牛提供液态或冻干乳酸菌是否能够改变瘤胃发酵，从而降低甲烷产量，同时保持或提高牛奶产量和成分。假设与对照组相比，每天两次挤奶时补充乳酸菌的奶牛会表现出更高的甲烷产量（ECM）和饲料转化效率（FCE），并且两种乳酸菌配方之间的甲烷产量、甲烷产量和甲烷强度均无差异。

**材料与方法**
实验在澳大利亚维多利亚州埃林班克的维多利亚农业研究SmartFarm进行（南纬38°14′，东经145°56′）。所有操作均符合《澳大利亚科学用途动物护理和使用规范》（NHMRC, 2013）。实验获得了DEECA农业研究和推广动物伦理委员会的批准（批准编号2023–08，2023年6月20日）。

**实验设计**
实验使用了40头春季产犊的荷斯坦弗里斯安奶牛，每日产奶量约为36.2 ± 5.03公斤，平均产奶天数2.5 ± 1.93天，平均哺乳天数29.5 ± 3.79天，体重568 ± 51.2公斤。牛被分配到三种处理组：
1）对照组（CON）：基础日粮（n = 14）；
2）FLA组：基础日粮加冻干乳酸菌（剂量为5 × 10^10 cfu/次挤奶）；
3）LLA组：基础日粮加液态乳酸菌（剂量为5.75 × 10^10 cfu/次挤奶）。实验期间奶牛每天挤奶两次。使用完全随机设计（CRD）进行分配，并根据奶产量、体重、平均哺乳天数和产犊天数等协变量进行平衡（Harville, 1974），通过Genstat 22软件（VSN International Ltd., Hemel Hempstead, UK）实现。样本量为10头/组，以确保在5%显著性水平下检测到5.8 g/kg DMI的组间差异。分配工作由顾问生物统计师和主要作者完成。所有参与实验的科学和技术人员均了解牛的处理组别，确保动物始终接受正确的处理并准确记录数据。

**基础日粮**
基础日粮包括以PRG为主的牧草，每头牛每天约25公斤干物质；同时提供每天6.9公斤的谷物混合物：
- 裂壳玉米粒（600 g/kg DM）；
- 滚压小麦粒（124.5 g/kg DM）；
- 溶剂萃取菜籽粕（200 g/kg DM）；
- 石灰石（20.0 g/kg DM）；
- 氧化镁（3 g/kg DM）；
- 菜籽油（5 g/kg DM）；
- 红糖蜜（57%，5.0 g/kg DM）；
- 小苏打（15.0 g/kg DM）；
- 矿物质（22.5 g/kg DM）；
- 盐（5 g/kg DM）。
谷物混合物不含可能影响瘤胃发酵的离子载体。主要饲料成分的营养成分见表1。谷物混合物每天分两次喂食（约07:00和15:50）。DFM添加剂由Terragen Biotech Pty Ltd.提供（澳大利亚昆士兰Coolum Beach），按照其专利配方制备：冻干形式用预计量的一次性真空密封袋包装，液态乳酸菌用单独的注射器包装。

**实验流程**
实验前，所有牛都提供了相同配方的PRG牧草（每天每头牛约25公斤干物质）和相同的谷物混合物。实验分为三个阶段：协变量观察期、适应期和测量期。
- 协变量观察期（第1-5天）：所有牛使用基础日粮。
- 适应期（第6-34天）：在挤奶时每天两次提供预计量添加剂。液态添加剂直接加入饲料箱中的谷物中。冻干配方装在袋子里，是一种压缩的薄片，需要手动压碎后加入饲料箱中的谷物中。奶牛有20分钟的时间来吃它们的谷物混合物，或者直到所有奶牛都吃完为止，以先发生者为准。任何未被吃掉的谷物混合物会被收集起来并称重。假设这些未被吃掉的谷物混合物的营养成分与提供的谷物混合物相同。

在测量期间（第35天到第39天），使用校准过的升降板测量仪（Ellinbank Plate Meter；Earle和McGowan，1979）每天测量放牧前后的牧草高度。压缩牧草高度的测量结果与根据校准切割得到的实际牧草质量数据绘制在图表上。放牧前的牧草高度通过与实验期间每个新牧场入口处收集的校准切割样本进行对比来进行校准（每个牧场在放牧前和放牧后大约收集12次校准切割）。根据放牧前的牧草质量估计，每头奶牛每天可分配约25公斤干物质的牧草。

随后使用回归方程（Equation 1；Earle和McGowan，1979）来计算牧草质量：
[1] 前牧草质量（干物质/kg/公顷）= a + b × 高度，
其中高度是从升降板测量仪上记录的压缩高度（高度 = [(测量后的读数 - 测量前的读数) ÷ 测量次数 ÷ 2]），a是截距，b是斜率系数。

在测量期间，从牧草和提供的谷物混合物中抽取代表性样本，以测定干物质、正烷烃浓度和营养特性。通过将饲料样本在105°C的强制通风烘箱中烘干至恒重（AOAC，2000；方法930.15）来确定干物质浓度。用于正烷烃分析的饲料样本在-55°C下冷冻至少72小时，然后研磨通过1毫米筛网（Wright等人，2020）。用于成分分析的饲料样本在整个测量期间保持在-18°C冷冻状态，按饲料类型分装，随后在60°C下烘干72小时，并研磨通过0.5毫米筛网。饲料中的成分包括粗蛋白（CP；AOAC，2000；方法990.03）、中性洗涤纤维（ADF；AOAC，2000；方法7.074）、粗纤维（NDF；AOAC，2000；方法2002.04）、木质素（AOAC，2000；方法949.04）、非淀粉多糖（NFC；AOAC，2000；方法992.09）、淀粉（AOAC，2000；方法996.11）、灰分（AOAC，2000；方法942.05）和粗脂肪（AOAC，2000；方法2003.05）。利用方程（Equation 2；NRC，2001）计算代谢能（ME）：
[2] ME（MJ/kg DM）= {[1.01 × (0.04409 × 总可消化营养成分%) – 0.45} × 4.84，
其中总可消化营养成分百分比由Weiss等人（1992）的模型预测。

实验中每头奶牛的牧草DMI（干物质摄入量）通过正烷烃技术（Wright等人，2020）进行估算。使用推注器每天给每头奶牛喂服760毫克的合成正烷烃（C32）。推注器用于将胶囊送入舌根并进入食道。在实验的最后10天（第29天到第39天），每天两次给奶牛喂服这种化合物。第35天到第39天，每天两次从每头奶牛身上收集粪便样本，方法包括从已知动物的干净肛门样本中取样、直肠刺激或直接采集粪便。收集后立即将样本储存在-18°C。测量期结束后，样本解冻并在40°C下烘干至恒重，然后研磨通过1毫米筛网。从每个样本中取出2克子样本，并按奶牛数量进行分装。每天每头奶牛的干物质摄入量使用方程（Equation 4；Douglas等人，2025）进行估算：
[4] 每头奶牛每天的干物质摄入量（kg DM/ha）= FiFj × Dj + Ic × Cj - Ic × Ci - Hi × Fi × Hj，
其中Fi是粪便中C33烷烃的浓度（mg/kg），Fj是粪便中C32烷烃的浓度（mg/kg），Dj是C32烷烃的日剂量，Ic是奶牛每天摄入的谷物量（mg/kg），Ci是提供的谷物中C33烷烃的浓度（mg/kg），Cj是提供的牧草中C32烷烃的浓度（mg/kg），Hi是提供的牧草中C33烷烃的浓度（mg/kg）。

每头奶牛的产奶量和成分通过牛奶计量系统（MM27BC；DeLaval International，瑞典图姆巴）在每次挤奶时（大约上午7:00和下午3:50）记录。在协变量期和测量期间，每次挤奶时使用在线牛奶计量仪（MM7；DeLaval International，瑞典图姆巴）收集代表性牛奶样本。这些样本分别用中红外牛奶分析仪（Bentley FTS；Bentley Instruments，美国明尼苏达州查斯卡）分析脂肪、蛋白质和乳糖浓度。能量校正后的牛奶（ECM），标准化为4.0%脂肪和3.3%蛋白质，使用方程（Equation 5；Tyrrell和Reid，1965）计算。

为了估算个体奶牛的甲烷排放量，采用了Deighton等人（2014）描述的改进SF6示踪技术。在该实验中，渗透管中装有约2.5克的999.99 g/kg纯SF6（Advanced Specialty Gases，美国内华达州里诺）。通过将渗透管置于39°C的烤箱中并每周称量两次，确定SF6的释放速率，持续4周。SF6的释放速率为每天5.0 ± 0.25毫克（平均值 ± 标准偏差），范围在4.5到5.7毫克之间。所有奶牛在实验的第29天通过口服方式摄入SF6渗透管。每个渗透管被封装在透明明胶胶囊（Size #10，Torpac Inc.，美国新泽西州费尔菲尔德）中，并通过注射器给药。从第35天到第40天，每天两次从每头奶牛的鼻孔上方采集嗳气气体样本。收集后立即将样本储存在-18°C。测量期结束后，样本解冻并在40°C下烘干至恒重，然后研磨通过1毫米筛网。从每个样本中取出2克子样本并按奶牛数量进行分装。每天每头奶牛的干物质摄入量使用方程（Equation 4；Douglas等人，2025）计算：
[4] 每头奶牛每天的干物质摄入量（kg DM/ha）= FiFj × Dj + Ic × Cj - Ic × Ci - Hi × Fi × Hj，
其中Fi是粪便中C33烷烃的浓度（mg/kg），Fj是粪便中C32烷烃的浓度（mg/kg），Dj是C32烷烃的日剂量，Ic是奶牛每天摄入的谷物量（mg/kg），Ci是提供的谷物中C33烷烃的浓度（mg/kg），Cj是提供的牧草中C32烷烃的浓度（mg/kg），Hi是提供的牧草中C33烷烃的浓度（mg/kg）。

每头奶牛的个体产奶量在每次挤奶时（大约早上7:00和下午3:50）使用牛奶计量系统（MM27BC；DeLaval International，瑞典图姆巴）记录。在协变量期和测量期间，每次挤奶时使用在线牛奶计量仪（MM7；DeLaval International，瑞典图姆巴）收集代表性牛奶样本。这些样本分别用中红外牛奶分析仪（Bentley FTS；Bentley Instruments，美国明尼苏达州查斯卡）分析脂肪、蛋白质和乳糖浓度。能量校正后的牛奶（ECM），调整为4.0%脂肪和3.3%蛋白质，使用方程（Equation 5；Tyrrell和Reid，1965）计算。

为了估算甲烷排放量，采用了Deighton等人（2014）描述的改进SF6示踪技术。在该实验中，渗透管中装有约2.5克的999.99 g/kg纯SF6（Advanced Specialty Gases，美国内华达州里诺）。通过将渗透管置于39°C的烤箱中并每周称量两次，确定SF6的释放速率，持续4周。SF6的释放速率为每天5.0 ± 0.25毫克（平均值 ± 标准偏差），范围在4.5到5.7毫克之间。所有奶牛在实验的第29天通过口服方式摄入装有SF6的渗透管。每个渗透管被封装在透明明胶胶囊（Size #10，Torpac Inc.，美国新泽西州费尔菲尔德）中，并通过注射器给药。从第35天到第40天，使用容积为800毫升的采样罐连续采集奶牛鼻孔上方的嗳气气体，初始采样速率为大约0.2毫升/分钟。根据Williams等人（2011）的方法，从每头奶牛的右侧腹部采集背景气体样本并收集到采样罐中。每天早上7:45左右更换采样罐，共采集5天。收集到的气体样本在当天使用气相色谱法进行分析（Williams等人，2024）。

在实验开始后4小时，通过口腔从每头奶牛体内采集一份约400毫升的瘤胃液样本（第5天和第40天）。选择这个时间点是因为类似喂养系统中通常观察到的瘤胃pH值最低点出现在这个时间（Greenwood等人，2013）。使用类似于Geishauser（1993）描述的上-瘤胃采样探针和真空泵收集样本（Moate等人，2014）。收集到的瘤胃液样本的pH值立即使用Mettler-Toledo FG2 pH测量仪（Schwerzenbach，瑞士）测量。随后，瘤胃液通过两层纱布过滤，以分离液体部分和残留固体。将过滤后的瘤胃液转移到12毫升塑料试管中，并加入4.5毫升含有10%甲醛、0.9%生理盐水和0.06%亚甲蓝的溶液中，然后使用Mod-Fuchs-Rosenthal计数室和Leica显微镜（Leitz Laborlux S；Leica Microsystems Pty Ltd., 新南威尔士州北赖德）进行原生动物计数（Punia等人，1987）。过滤后的瘤胃液中挥发性脂肪酸（VFA）的浓度通过 capillary gas chromatography 方法根据Supelco Bulletin 749D和Olympus AU400自动分析仪在经过过氯酸脱蛋白后分析。VFA的峰值通过与已知VFA的标准混合物比较其保留时间来鉴定，并使用Agilent Chemstations软件和Microsoft Excel进行定量，以4-甲基戊酸为内标。所有结果以ppm表示，并转换为mg/L以供后续分析。

过滤后的瘤胃液中的氨氮（NH3-N）浓度在4.8毫升样本中测定，首先加入0.2毫升HCl将其pH值调整至2.0，然后冷冻至-18°C。样品使用基于硝酸盐-水杨酸盐显色法的流动注射分析方法进行分析（Nelson，1983）。酸化的瘤胃液用0.5 M HCl稀释后进行流动注射分析（QuickChem 8500 Series 2 Flow Injection Analyzer；Lachat Instruments，美国威斯康星州密尔沃基）。

在实验的第5天和第40天，通过口腔从每头奶牛体内采集一份瘤胃液样本（约400毫升）。选择这个时间点是因为在这个时间点瘤胃pH值通常达到最低点（Greenwood等人，2013）。使用Oro-ruminal采样探针和真空泵收集样本（Moate等人，2014）。收集到的瘤胃液样本的pH值立即使用Mettler-Toledo FG2 pH测量仪（Schwerzenbach，瑞士）测量。随后，瘤胃液通过两层纱布过滤，分离液体部分和固体残渣。在转移到12毫升塑料试管中的0.5毫升代表性的过滤瘤胃液子样本中计数原生动物，并用含有10%甲醛、0.9%生理盐水和0.06%亚甲蓝的溶液稀释。计数使用Mod-Fuchs-Rosenthal计数室和Leica显微镜（Leitz Laborlux S；Leica Microsystems Pty Ltd., 新南威尔士州北赖德）进行（Punia等人，1987）。过滤后的瘤胃液中的VFA浓度通过毛细管气相色谱法测定，样品在过滤后立即冷冻至-18°C。VFA的浓度根据Erwin等人（1961）的方法进行过蛋白处理后，使用Olympus AU400自动分析仪和Supelco Bulletin 749D进行分析。样品VFA峰值的鉴定通过与其标准混合物的保留时间比较，并使用Agilent Chemstations软件和Microsoft Excel进行定量。

在实验的第5天和第39天，从每头奶牛体内采集血液样本。奶牛在早晨挤奶后立即被固定，在尾静脉采集血液样本。收集大约10毫升的血液样本，放入无抗凝剂的真空采血管（BD Diagnostics，美国新泽西州富兰克林湖）。采血管在收集后在24°C下孵育1.5小时，然后在24°C下以1174 g的离心力离心15分钟。血清分为两份1.5毫升的Eppendorf试管并冷冻至-18°C。血清样本通过干冰运输到Victoria Agriculture, AgriBio（澳大利亚维多利亚州邦多拉）进行总蛋白、钙、非酯化脂肪酸（NEFA）、葡萄糖、尿素、白蛋白和球蛋白的分析。样品使用ChemWell? 2910自动EIA和Chemistry Analyzer（Awareness Technology, Inc., 美国佛罗里达州帕姆城）和Catachem Inc.（美国康涅狄格州牛津）的试剂和校准品进行分析。通过从总蛋白浓度中减去白蛋白浓度来计算球蛋白浓度，并确定白蛋白和球蛋白（A:G）的比例。

在进行统计分析之前，将测量期间的每日数据平均得到每头奶牛每天每公斤干物质的甲烷排放量。未发现明显的原因，因此保留了所有数据。这一阈值未被任何观测值超过，诊断检查也未发现与样本量、SF6回收率或背景气体比例相关的问题。因此，没有奶牛或甲烷测量数据被排除在分析之外。甲烷产量（g/kg DMI）和甲烷强度（g/kg ECM）使用实验第35天到第39天收集的数据计算，平均值取5天的平均值。牛奶记录与饲料摄入量匹配，以便同一天的早晨和下午的饲料摄入量与同一天的下午牛奶和次日的早晨牛奶相对应。这样做是为了考虑饲料摄入和代谢利用之间的延迟时间。

原生动物计数不是正态分布的，因此在分析前将其转换为对数（以10为底）。在对数转换之前，每个数据加上1000的偏移量，以包括“零”计数。基于所有数据的CRD基于ANCOVA的诊断图未显示任何异常值。协变量期和测量期的数据在数据分析前表示为每头奶牛的平均值。结果平均值使用CRD基于ANCOVA进行分析，其中DIM、5天平均体重、5天平均产奶量和胎次作为协变量。CRD基于ANCOVA的诊断图未显示任何异常值。使用的统计模型为：
[6] yi = μ + Tj + β1mi + β2ai + β3wi + β4di + εi，
其中yi是第i头奶牛的响应变量，μ是总体平均值；Tj是处理的固定效应；mi是协变量产奶量，系数为β1；ai是协变量胎次，系数为β2；wi是协变量活体重，系数为β3；di是协变量泌乳天数，系数为β4；εi是残差误差。P值<0.05被认为具有统计学意义。P值 ≥0.05 和 <0.10 被认为是具有趋势的。表示处理均值之间显著差异（P < 0.05）的字母基于Fisher的非保护最小显著差异检验。对比P值是通过将CON与LLA和FLA的组合效应（CON vs LA）进行比较，以及通过将FLA和LLA与液态制剂进行比较（FLA vs LLA）来计算的。

结果：在饲料中添加乳酸菌对总DMI（表2，P = 0.755）没有影响，无论采用哪种制剂（P = 0.993）。无论是浓缩饲料还是粗饲料的DMI，添加乳酸菌（P ≥ 0.570）或其制剂（P ≥ 0.348）都没有影响。

表2. 实验第35至39天测量的饲料摄入量（kg DM/d）、产奶量（kg/d）、牛奶成分（g/kg）和饲料转化效率。

在实验期间记录的牛奶产量数据如图1所示。牛奶产量不受处理的影响（P = 0.461，表2），ECM（P = 0.162）、牛奶脂肪（P = 0.195）、蛋白质（P = 0.455）或乳糖（P = 0.724）在各处理组之间也没有差异。然而，接受FLA处理的奶牛的乳糖产量有增加的趋势（P = 0.059）。与接受LLA处理的奶牛相比，接受FLA处理的奶牛的牛奶脂肪（P = 0.846）和蛋白质（P = 0.890）浓度也没有差异。此外，当基于牛奶产量（kg MY/kg DMI）表达时，饲料转化效率不受处理的影响（P = 0.423），但当基于能量校正牛奶（kg ECM/kg DMI）表达时，接受CON处理的奶牛的饲料转化效率倾向于更高（P = 0.090）。

甲烷产生量不受添加任何形式乳酸菌的影响（P = 0.490，表3），MeY（P = 0.472）或MeI（P = 0.768）也是如此。

表3. 实验第35至39天测量的饮食对甲烷产生量（g/d）、甲烷产量（g/kg DMI）和甲烷强度（g/kg ECM）的影响。

收集的瘤胃液样本在喂食开始后4小时的pH值不受添加乳酸菌的影响（P = 0.602），也不受其制剂的影响（P = 0.113）。CON组的瘤胃NH3-N含量高于添加乳酸菌补充剂的组（P = 0.028），并且乳酸菌补充剂的种类对结果没有影响（P = 0.773）。总VFA浓度（mM）（P = 0.889）和个别VFA的比例（P ≥ 0.126）也不受处理的影响。乙酸与丙酸的比例（P = 0.287）和原生动物计数（P = 0.181）同样不受处理影响。

大多数血液代谢物不受在任一制剂中添加乳酸菌的影响（P ≥ 0.195，表5）。例外的是尿素，其中接受CON处理的奶牛的尿素浓度较低（P = 0.086）。处理形式对血液中的钙含量有影响，接受FLA处理的奶牛的钙含量高于接受LLA处理的奶牛（P = 0.011）。

讨论：在每日两次用两种乳酸菌制剂补充的多年生黑麦草牧场上放牧的早期泌乳奶牛中，与对照组相比，乳酸菌并未导致更高的ECM产量和饲料转化效率。因此，我们拒绝了我们的第一个假设。总体而言，我们的实验结果与类似的研究结果不一致，那些研究报道在早期（Xu等人，2017年）、中期（Monteiro等人，2021年，So等人，2021年）和晚期泌乳期（Santos等人，2017年）补充乳酸菌的奶牛中，牛奶产量有所增加。我们研究与报有积极效果的研究之间的一个关键区别在于提供的饲料类型，其他研究使用的是加入乳酸菌的发酵或保存饲料。例如，Xu等人（2017年）观察到，在早期泌乳期的中国荷斯坦奶牛中，每天补充50克L. casei和L. plantarum混合物（1.3 × 10^9 cfu/g）与基于青贮料的TMR混合30天后，牛奶产量增加了27%。他们研究中的剂量与我们研究中使用的剂量相当。在中期泌乳期的荷斯坦奶牛中，补充了0.05克/kg新鲜物质的L. casei TH14的甘蔗渣后，牛奶产量略有增加，尽管DMI没有差异（So等人，2021年）。此外，在晚期泌乳期的奶牛中，Santos等人（2017年）观察到添加了L. hilgardii（5 log cfu/g新鲜饲料）的青贮料的奶牛的牛奶产量和牛奶成分有所增加。除了发酵饲料外，持续供应乳酸菌也可能增强了先前研究中观察到的生产响应。例如，一组早期到中期泌乳期的奶牛可以持续接触到接种了L. plantarum的苜蓿青贮料，其牛奶产量比对照组更高（Monteiro等人，2021年）。这些发现表明，持续在日粮中提供DFM可能会提高牛奶产量。虽然这些研究表明有正面关联，但需要注意的是，观察到的效果可能不仅仅归因于乳酸菌作为微生物添加剂。青贮过程中的发酵过程也可能改善了营养物质的可用性和瘤胃微生物的获取，从而促进了生产响应（Mejía-Avellaneda等人，2022年）。

我们的结果与Williams等人（2023年）的研究一致，他们发现早期泌乳期的荷斯坦-弗里斯兰奶牛在以干草为基础的日粮中补充了10毫升/天（4.17 × 10^8 cfu/mL）相同液态乳酸菌产品后，DMI或牛奶产量没有显著变化。同样，Boga和Gorgulu（2007年）观察到，在早期泌乳期的奶牛中补充450毫克/千克饲料的乳酸菌益生菌（含有2 × 10^8 cfu，单独使用或与酵母组合使用）时，DMI、牛奶产量或成分没有差异。值得注意的是，那些没有观察到响应的研究是在新鲜牧场上进行的（Boga和Gorgulu，2007年，Williams等人，2023年），而那些使用发酵青贮料、甘蔗渣或青贮料加青贮料组合的研究往往显示出积极效果。体外研究表明，与青贮料相比，干草中的营养成分降解性较低，青贮过程中细胞壁结构的变化可能有利于DFM或其他瘤胃微生物更早地获取纤维（Arroquy等人，2014年）。这些观察结果可能不仅受到饲料类型的影响，还受到所采用的喂养策略的影响。具体来说，TMR系统提供一致的养分输送，因此微生物暴露更为一致，而基于青贮料的脉冲给药方法如我们研究和Williams等人（2023年）的研究中使用的，则效果可能较差，因为DFM的输送是间歇性的。使用的乳酸菌株或组合可能是导致结果差异的另一个因素。例如，在使用发酵饲料的研究中，L. plantarum、L. hilgardii或它们的组合常常产生积极效果。相比之下，Boga和Gorgulu（2007年）使用的DFM组合对DMI、牛奶产量或牛奶成分没有产生益处。Boga和Gorgulu（2007年）使用的干草基日粮可能掩盖了微生物组合的潜在益处，因为干草的可发酵性较低，限制了DFM可以作用的快速可降解底物的数量。

饲料效率已报告称，在年轻公牛（Aydin等人，2009年）和生长中的阉牛（Ponce等人，2011年）中，直接补充乳酸菌可以改善饲料效率，或者在生长和育肥阉牛中通过补充乳酸菌发酵产品可以改善饲料效率（Ran等人，2019年）。提出的机制是乳酸菌调节瘤胃发酵并增强能量利用，从而减少了胃肠道中的组织更新所需的能量（Elam等人，2003年）。然而，与这些预期相反，Lawrence等人（2021年）观察到，在早期泌乳期的奶牛中，每天添加1 × 10^9 cfu的L. acidophilus和2 × 10^9 cfu的P. freudenreichii并没有改善饲料转化效率。同样，Williams等人（2023年）在使用与我们研究中相同的细菌混合物的泌乳动物中也未观察到饲料效率的改善。不同研究中报告的结果差异可能反映了宿主动物特征的不同，如年龄、生理状态和瘤胃pH值（Boyd等人，2011年）。这可以解释为什么在不同的研究中观察到不同的效果，因为在年轻和生长中的动物中乳酸菌显示出积极效果，而在成熟的泌乳动物中没有效果。成熟动物似乎不太受乳酸菌性能增强效果的影响，特别是在饲料效率方面，对于FCE的影响不一致。实际上，没有证据表明在成熟反刍动物中乳酸菌有改善效果。Ban和Guan（2021年）的综述得出结论，乳酸菌对DMI没有影响，对成年动物的生产只有有限的影响，这可能是因为它们已经建立了成熟的瘤胃微生物群，减少了DFM的定植和功能影响。成熟的瘤胃拥有一个密集和竞争性的微生物生态系统，限制了补充DFM的建立和活性（Greening等人，2019年，Beauchemin等人，2022年），这可能解释了为什么在补充乳酸菌的犊牛和羔羊中观察到了更一致的性能益处。例如，在一项针对母羊复合体的试验中，补充与我们研究中使用的相同冻干乳酸菌的组别显示出更高的日均增重（S.S. Nair，维多利亚州农业部研究，Ellinbank，维多利亚，未发表的数据）。在断奶前的小牛中，补充各种乳酸菌株后也观察到了类似的改善，包括粪便有机物（FCE）和体重增加（Frizzo等人，2010年；Casper等人，2021年；Stefańska等人，2021年）。这些反应可能归因于年轻动物不成熟的瘤胃环境，该环境可能更容易被外源微生物定植（Yá?ez-Ruiz等人，2010年；Stefańska等人，2021年）。此外，产乳酸的细菌在低pH条件下可以迅速繁殖（Hernandez等人，2008年）。鉴于小牛的瘤胃pH值通常比泌乳母牛（6.0至6.6）低（5.2至5.5），乳酸菌的活性可能在年轻动物中得到增强，这可能是其在生长动物中效果更显著的原因。需要进一步的研究来了解瘤胃微生物组成的年龄相关差异对DFM定植成功和功能效果的影响。比较研究使用相同微生物菌株补充的生长中的反刍动物与成年反刍动物的瘤胃微生物群将具有价值。此外，从幼年到成年追踪DFM接种小牛的纵向研究可以阐明新生儿期微生物补充是否能够建立持久的定植，并在不同生理阶段提供持续的功能效益。

在早期泌乳阶段，每天两次用乳酸菌制剂补充的奶牛与喂食对照日粮的奶牛相比，并未减少甲烷产量（MeP）、乙烷产量（MeY）或异丁烷产量（MeI）。此外，无论喂食哪种乳酸菌制剂，MeP、MeY或MeI之间没有差异，因此我们放弃了第二个假设。我们的发现与Williams等人（2023年）的研究结果一致，他们报告称，在早期泌乳阶段用相同的液态乳酸菌产品补充奶牛时并未减少肠道甲烷排放，尽管使用的剂量约为本研究的十分之一。同样，Jeyanathan等人（2019年）也发现，当早期泌乳奶牛被补充L. pentosus D31（3.6 × 10^11 cfu/牛/天）或L. bulgaricus D1（4.6 × 10^10 cfu/牛/天），并结合不同浓度的日粮淀粉时，甲烷产量并未减少。他们的研究中甲烷产量相当，而乙烷产量和异丁烷产量高于我们的研究。Ellis等人（2016年）也报告称，在中泌乳期的奶牛中，每天每头牛喂食5 × 10^9 cfu的Lactobacillus plantarum、Lactococcus lactis和Lactobacillus buchneri混合物时，甲烷产量、乙烷产量或异丁烷产量没有变化。实验中DFM组和对照组之间的挥发性脂肪酸（VFA）浓度没有差异，这表明无论是液态还是冷冻干燥的乳酸菌补充剂都没有改变瘤胃发酵途径。此外，喂食乳酸菌补充剂的奶牛的瘤胃NH3-N浓度显著降低，而血液尿素浓度有上升趋势。这些趋势可能表明氮分配发生了微妙的变化，而非瘤胃发酵的实质性改变。乳酸菌可能通过促进氨的吸收来增强微生物蛋白合成，从而减少瘤胃中的游离NH3-N（Satter和Slyter，1974年；Duan等人，2025年）。然而，吸收后氨基酸分解代谢的增加可能解释了血液尿素浓度升高的原因（Getabalew和Negash，2020年）。这些观察结果与我们研究中甲烷排放量几乎没有变化的总体情况一致，表明任何微生物变化都不足以改变氢动态或甲烷生成。尽管我们的研究中甲烷减少不明显（体外研究Callaway等人，1997年；Nollet等人，1998年；Zhao等人，2019年；体内研究Philippeau等人，2017年；仅MeI），但其他研究报道了乳酸菌补充后肠道甲烷排放指标的减少。这种研究结果的一致性可能反映了基础日粮和饲料质量的差异、相对于瘤胃体积的剂量或瘤胃液量的差异，以及所使用DFM的稳定性（Stein等人，2006年）。

基础日粮的营养组成已被证明会影响DFM补充的效果，特别是通过其对瘤胃发酵和消化物通过率的影响（Vyas等人，2014年；Philippeau等人，2017年）。在我们的研究中，甲烷产量比预期值（约502克/天）低约38%，后者基于每天23.5公斤干物质（DMI）的日粮；乙烷产量比预期范围（约17至25克甲烷/公斤DMI）低23%（Charmley等人，2015年）。此外，所有3组（包括对照组）的平均甲烷产量比澳大利亚基于春季牧草放牧系统的典型值（421.4克/天）低26%（Munidasa等人，2024年）。Cameron等人（2018年）的计算表明，切割并运送系统的奶牛日甲烷产量为431克/天，部分放牧系统的奶牛为365克/天，进一步支持我们报告的数值（约308克/天）低于类似日粮和饲养系统的典型甲烷产量。我们的实验在澳大利亚早春进行，此时基于PRG的牧草纤维浓度通常低于成熟草（Fulkerson等人，1998年）。研究表明，低纤维饲料（NDF = 367克/公斤DM）可以显著增加瘤胃固体的通过率（Tafaj等人，2005年）。与此一致的是，我们研究中的乙烷产量比Williams等人（2023年）报告的结果低约58%，后者喂食高NDF（438克/公斤DM）的干草日粮。在我们的研究中，饲料的NDF为391克/公斤DM。使用0.84的选择因子（Jacobs等人，1999年），这些奶牛摄入的饲料NDF浓度为313克/公斤。因此，总日粮的NDF浓度分别为260克/公斤DM（CON）和262克/公斤DM（LLA和FLA）。此外，我们研究中使用的PRG低DM浓度（8%至10% DM）也促进了快速的通过率和随后的瘤胃内容物快速周转和清除。因此，这种快速通过率加上基础日粮的低DM和NDF浓度可能减少了所给DFM在瘤胃中的滞留时间（Kuoppala等人，2009年），可能削弱了其在瘤胃中的定植能力，从而影响了甲烷产量和瘤胃发酵。在这种条件下，应仔细评估任何减少肠道甲烷策略的有效性，因为低NDF和快速发酵的特点本身就限制了瘤胃滞留时间和微生物适应能力，从而降低了实现显著减少肠道甲烷排放的可能性。

DFM的剂量相对于瘤胃体积可能是影响引入细菌在瘤胃生态系统中定植和建立的关键因素。据估计，泌乳奶牛的瘤胃容量约为100升（Fregulia等人，2021年），因此我们研究中每单位瘤胃体积的DFM剂量被稀释，进一步降低了DFM补充的效果。这可能部分解释了为什么在瘤胃体积小10到15倍的成熟绵羊中，每天每只动物补充6 × 10^10 cfu的Lactobacillus pentosus D31在4周内使乙烷产量降低了13%（Jeyanathan等人，2016年），而在我们的奶牛研究中相同剂量没有效果。同样，用Lactococcus lactis产生的细菌素nisin补充时，绵羊的乙烷产量降低了10%（Santoso等人，2004年），这是由于抑制了产甲烷微生物的生长。此外，用L. plantarum Chikuso-1接种的TMR牧草喂食的绵羊比未接种的对照组TMR组甲烷排放量降低了25%（Cao等人，2010年）。不同的给药策略和适应DFM的时间长度也可能导致研究结果的一致性差异。在生长中的羔羊中，每天连续8次使用相同的冷冻干燥乳酸菌补充剂表现出较低的异丁烷产量（S.S. Nair，维多利亚州农业部研究，Ellinbank，维多利亚州，未发表数据）。这些研究表明，绵羊较小的瘤胃体积和较低的饲料摄入量可能使它们的瘤胃环境对固定剂量的微生物添加剂更敏感。相比之下，瘤胃体积较大的牛可能需要更大的剂量、连续补充而不是脉冲式给药，或者更长的适应期才能达到类似的效果。未来需要进行剂量响应试验，探讨不同DFM浓度和延长适应时间，以确定适用于大型和小型反刍动物的最佳应用策略。在我们的研究中，由于个体DMI超过预期值（达到体重的3.5%至4%，而预期为2.5%至3%（NRC，2001年；MLA，2019年），可能是由于绵羊可以相对不受限制地访问春季牧草，因此每公斤饲料的预期剂量可能低于实际剂量。这与我们观察到的较低甲烷排放量一致，可能与实验中春季牧草的NDF浓度低和通过速度快有关。

在反刍动物中补充多种参与丙酸生产的细菌种类似乎比单一DFM属更有效地降低甲烷产量。Ncho等人（2024年）的元分析表明，细菌种类的组合可以通过与丙酸生成菌的协同作用显著降低甲烷排放。唯一一项报告可测量甲烷减少的体内研究表明，当奶牛同时喂食Propionibacterium P63和Lactobacillus rhamnosus时，异丁烷产量降低了26%，突显了多菌株方法的潜力（Philippeau等人，2017年）。众所周知，瘤胃中的不同细菌种类可以协同作用，分解复杂的饲料成分并产生对宿主有益的产品（Diao等人，2019年；Ncho等人，2024年）。

尽管甲烷测量期可能较短，但它遵循了澳大利亚（Alvarez-Hess等人，2019年；Alvarez-Hess等人，2023年；Williams等人，2023年）和其他国家（Chung等人，2011年；Li等人，2021年；Boulton等人，2025年）广泛用于基于牧草的甲烷研究的改良SF6示踪技术的标准5天连续采样协议。这种方法在放牧条件下提供了可靠的24小时甲烷排放估计，并与多日开放回路呼吸室测量结果高度一致（Deighton等人，2014年），后者被认为是量化肠道甲烷排放的金标准技术（Garnsworthy等人，2019年；Zhao等人，2020年）。我们承认，这里观察到的反应代表的是短期排放而非持续长期效果，因此应在该背景下解读。然而，在进行更长期的研究之前，了解添加剂在泌乳和牧草生长关键阶段（例如，营养生长期与繁殖期）的影响非常重要。此外，39天的整体试验持续时间确保了奶牛在整个研究期间都在放牧处于相同物候阶段的牧草上（大约2.5至3叶期）。延长试验时间可能会导致牧草成熟度的变化，从而影响通过率和营养供应，进而影响甲烷排放。这个持续时间也是在允许奶牛瘤胃环境有足够时间生理适应DFM与可用牧草的季节窗口之间的实际折中。虽然更长的适应期可能更理想，但延长试验时间会引入与牧草成熟度和营养浓度变化相关的混杂效应。

我们通过增加5天甲烷测量期间收集的样品的体积来评估饲料的营养组成。因此，我们建议未来的研究从实验开始到结束都分析牧草样本，理想情况下至少每两周分析一次，以检测实验窗口期间牧草营养成分的细微变化。综上所述，我们认为本研究采用的方法提供了关于DFM对放牧在低DM和NDF浓度繁荣春季牧草上的奶牛的减排潜力的关键信息。为了更好地理解动物在长期和季节性方面的动态变化，未来的研究可以考虑引入连续或延长监测时间的甲烷检测工具，例如Greenfeed系统或新兴的基于实时传感器的技术，这些工具能够捕捉到奶牛放牧系统中的长期变异情况。

**结论**：
在本实验中，向奶牛的日粮中添加两种不同配方的乳酸菌混合物并未对牛奶产量（FCE，kg牛奶/kg DMI）、MeP、MeY 或 MeI 产生显著影响。尽管数值上的差异很小，但所有甲烷指标都呈现上升趋势。早产奶牛所吃的低NDF（低消化纤维）春季牧草可能削弱了DFM（乳酸菌制剂）在瘤胃中的作用，从而限制了其在瘤胃中的定植能力及其对牛奶产量和甲烷排放的预期改善效果。这表明使用乳酸菌混合物来提高产量和减少甲烷排放是可行的。基于我们的研究结果以及其他文献，我们建议进行一项剂量效应研究，使用低NDF牧草来评估此类以牧草为基础的系统中在春季减少甲烷排放的潜力。此外，我们还建议进一步研究多种细菌组合的DFM效果。