高硝酸盐含量的合成水与泉水在双循环UASB反应器中的长期氢营养反硝化过程

《Journal of Environmental Chemical Engineering》：Long-term hydrogenotrophic denitrification of high-nitrate synthetic and spring water in dual-recirculation UASB reactors

【字体：大中小】 时间：2026年05月07日 来源：Journal of Environmental Chemical Engineering 7.2

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　　埃马努埃莱·马里诺|阿曼多·奥利瓦|斯特凡诺·帕皮里奥|乔瓦尼·埃斯波西托|弗朗切斯科·皮罗齐那不勒斯费德里科二世大学土木、建筑与环境工程系，克劳迪奥街21号，80125，那不勒斯，意大利 **摘要** 利用氢气（H2）作为电子供体和厌氧颗粒污泥的氢营养反硝化（H

　　埃马努埃莱·马里诺|阿曼多·奥利瓦|斯特凡诺·帕皮里奥|乔瓦尼·埃斯波西托|弗朗切斯科·皮罗齐
那不勒斯费德里科二世大学土木、建筑与环境工程系，克劳迪奥街21号，80125，那不勒斯，意大利

**摘要**
利用氢气（H2）作为电子供体和厌氧颗粒污泥的氢营养反硝化（H2Den）是一种有效的去除有机碳缺乏水中硝酸盐（NO3-）的策略。本研究调查了一种新型设计的向上流式厌氧污泥床（UASB）反应器，该反应器采用双循环系统（适用于液体和气体相）来增强H2Den过程。两个反应器在不同的条件下进行了420天的生物重复实验，包括不同的水力停留时间（HRT）和H2供应量。最佳条件下（即H2过量200%和水力停留时间1天），硝酸盐（NO2-）的积累量最小（< 0.5 mg NO2-/L），硝酸盐去除效率可维持在99%以上，反硝化速率为166.6 ± 61.8 mg NO3-/L/d，即使在添加了硝酸盐的低碳水环境中也是如此。就温室气体排放而言，在最佳条件下，一氧化二氮（N2O）的排放速率为5.3·10-3 μg N2O/min。微生物群落分析显示，Comamonadaceae科（占比从1.7%增加到19.3%）得到富集，该科已知积极参与氢营养反硝化过程；Spirochaetaceae科（占比从3.3%增加到19.3%）也得到富集，这种菌类常在缺氧环境中被发现，但其去除硝酸盐的潜力尚未被充分探索。

**1. 引言**
提供安全的饮用水是联合国制定的2030年议程（可持续发展目标6）的关键目标[1]。如今，由于人口增长、工业和农业活动以及气候变化[2][3]，地球上几乎所有水资源都受到了影响。特别是硝酸盐（NO3-）由于人类活动而成为最广泛的水体污染物[4]，其来源包括非点源（如农业土壤中施用富含氮的肥料和粪便）和点源（如未经处理或处理不当的废水及垃圾填埋场渗滤液）[5][6][7]。硝酸盐可通过食物和饮用水进入人体，并约有25%转化为亚硝酸盐（NO2-）。亚硝酸盐可能导致N-亚硝胺的形成，这些物质在胃和肠道中具有潜在的致癌性。此外，硝酸盐和亚硝酸盐还会引起短期健康问题，如高铁血红蛋白血症和甲状腺疾病[8][9]。根据欧盟2020/2184号饮用水指令，硝酸盐浓度超过50 mg NO3-/L被视为不安全的饮用水。

硝酸盐去除可以通过物理化学、电化学和生物方法实现[10]。其中，生物反硝化因其成本效益、可持续性和最终产生无害气体氮气（N2）而受到关注[11][12][13]。自养反硝化（AuDen）过程是一种有吸引力的替代传统方法，适用于去除供人类饮用的水中的硝酸盐，这类水的特征是自然有机碳氮比较低[14][15]。AuDen在缺氧条件下进行，使用无机电子供体作为能量来源和无机碳作为碳源。因此，与异养反硝化不同，AuDen不需要外部有机碳[16][17]。此外，AuDen还具有降低运营成本和减少污泥产量的优势[18]。

氢气（H2）是一种非常有前景的分子，因为它比其他无机电子供体具有多种优势[19]。H2提供了一种清洁的电子供体，不会产生有机副产物，从而避免了氯化后的消毒副产物；同时，H2还能提高反硝化效率并减少生物质产生，降低了后续处理的需求和污泥管理的成本[20]。然而，H2的应用也带来了一些挑战，例如其在水中的溶解度较低，可能限制反硝化过程中的气液传质效率；以及其高易燃性，需要谨慎处理以避免泄漏、爆炸等安全问题，尤其是在大规模系统中[22]。尽管存在这些限制，但氢气生产的可再生能源技术的发展提高了氢营养反硝化（H2Den）过程的整体可持续性。为克服这些与H2使用相关的内在限制，已经开发并研究了不同的反应器配置，如固定床（FBRs）、膜生物反应器（MBRs）、生物电极（BERs）反应器以及混合系统[23]。在固定床反应器中，固体载体上形成的生物膜增强了生物量的停留，从而通过改善气液接触提高了氢气的利用效率[24]。膜的使用（如中空纤维膜）可以有效提高氢气的传质效率[23]。BERs通过在水阴极处生成氢气来有效解决与氢气相关的安全和传质问题，氢气直接被反硝化微生物利用，从而减少了气体损失并提高了过程效率[10][25]。然而，尽管这些系统在硝酸盐去除方面表现优异，但它们也存在一些关键缺点：固定床反应器中的生物膜堆积和堵塞问题、FBRs中的颗粒损失和高能耗问题、MBRs中的膜污染及可扩展性问题，以及BERs中有限的氢气生产能力[26][27][28]。

因此，本研究旨在探究双循环向上流式厌氧污泥床（UASB）系统中的H2Den过程，该系统允许液体和气体相的循环。与其他生物反应器配置相比，双循环UASB能够克服前述替代系统的局限性。作为一种技术简单且成本效益高的配置，双循环UASB提供了有效的氢气传质和反硝化性能。气体循环的存在有助于促进氢气的溶解，从而简化了反应器操作，优化了氢气供应策略，避免了连续排气的需求，并防止氢气释放到大气中[22][29]。由于不需要排气，这种配置还能够监测反硝化过程中的中间产物（如NO和N2O）及其他温室气体（如甲烷CH4）[30]。此外，液体循环的存在增强了厌氧颗粒污泥（AnGS，用作接种剂）、含硝酸盐的水和电子供体（H2）之间的接触。使用AnGS还能提高过程的稳定性，因为它对环境压力（如非最佳温度和抑制剂的存在）的抵抗力更强，这得益于颗粒基质提供的保护[18]。颗粒生物质不会从反应器中冲出，便于将微生物从供人类饮用的水中分离出来，同时通过延长生物质停留时间促进了微生物的适应。据我们所知，这是首次研究在双循环UASB反应器中使用AnGS进行H2Den的研究。此外，本研究还提供了关于H2Den过程长期稳定性的证据。双循环UASB反应器的性能在420天内进行了测试，以优化过程参数和反应器配置，并观察了不同水力停留时间（HRT）、H2供应量和反应器设置变化的影响。同时监测了NGH气体排放（如CH4和N2O）。该过程还通过添加了硝酸盐的泉水进行了验证，证明了系统在更具有工业相关条件下的鲁棒性和适用性。

**2. 材料与方法**
2.1. 含硝酸盐的水、接种剂和电子供体
实验用水是根据Marino等人的方法制备的[31]，确保初始硝酸盐浓度为200 mg NO3-/L，并含有磷酸盐缓冲剂和微量元素（表S1）。多项研究表明，用于人类饮用的水中硝酸盐浓度在数百mg/L范围内，特别是在亚洲（例如220 mg NO3-/L）和印度（例如110 mg NO3-/L）[4][32]。自来水被用作制备含硝酸盐水的背景物质，并提供无机碳（表S1）。作为电子供体的H2使用PF500 H2发生器（Fulltech Instruments，罗马，意大利）产生。所使用的接种剂来自爱尔兰基尔康奈尔（Killconnell，戈尔韦）Arrabawn奶牛场处理的UASB反应器。AnGS的特性之前已由Lawrence等人报道[33]。该过程使用来自意大利拉齐奥大区卡西诺（Cassino）Gari河的泉水进行了验证（特性见表S1），并在其中添加了硝酸盐以达到最终浓度200 mg NO3-/L。

2.2. 生物反应器配置
实验活动使用两个1升玻璃柱（直径：5.5厘米；高度：44厘米）作为生物反应器。反应器1（R1）和反应器2（R2）在环境温度下运行，温度根据季节变化在15.8至32.7°C之间，它们被填充了含硝酸盐的水和AnGS，工作体积为0.5升。进水pH值为7.5 ± 0.1。添加的AnGS占工作体积的15%（体积比），相当于75克AnGS，即2.2克VSS/L，颗粒床高度为9厘米。在反应器启动前，用氩气（Ar）冲洗气相空间并将其排放至大气压力以创建缺氧条件。最初，H2的供应量是基于Marino等人的观察结果（[29]）按化学计量比过量100%提供的，他们发现10%（体积比）的接种剂和100%过量的H2供应是在AnGS驱动的H2Den过程中最有利条件。氢营养反硝化反应的化学计量式如方程（1）所示[21]：
(1) H2 + 0.355 NO3- + 0.049 CO2 + 0.355 H+ → 0.010 C5H7O2N + 0.172 N2 + 1.143 H2O

反应器运行持续了420天，并分为十七种实验条件（表1）。在此期间，反应器配置逐渐调整至最终版本，如图1所示。连续的向上流液体相循环通过EV045蠕动泵（Verder Liquids BV，乌得勒支，荷兰）实现，整个运行过程中的流速设定为1.3 L/h。气相空间的气体循环通过ISM4408泵（Ismatec，格拉特布鲁格，瑞士）实现。具体来说，从气相空间取出的气体通过空气石扩散器再次通过液体相，循环流速为1.5 L/h。

**表1 – 双循环UASB反应器中测试的实验条件，用于进行氢营养反硝化（H2Den）过程**
| 周期 | 持续时间（天） | NO3-供应模式 | HRT（天） | H2过量（%） | H2供应模式 | 反应器配置或供应策略的变化 |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| I | 18 | 半连续 | 4 | 100 | 半连续 | (+) |
| II | 18 | 半连续 | 4 | 100 | 半连续 | (+) |
| III | 39 | 半连续 | 4 | 100 | 半连续 | (+) |
| IV | 55 | 半连续 | 4 | 100 | 半连续 | (-) |
| V | 70 | 半连续 | 3 | 100 | 半连续 | (+) |
| VI | 73 | 半连续 | 2 | 100 | 半连续 | (+) |
| VII | 83 | 半连续 | 3 | 100 | 半连续 | (-) |
| VIII | 91 | 半连续 | 3 | 100 | 半连续 | (+) |
| IX | 94 | 半连续 | 3 | 100 | 半连续 | (+) |
| X | 115 | 半连续 | 3 | 100 | 半连续 | (-) |
| XI | 129 | 半连续 | 2 | 150 | 半连续 | (+) |
| XII | 157 | 半连续 | 2 | 200 | 半连续 | (-) |
| XIII | 181 | 半连续 | 2 | 200 | 半连续 | (+) |
| XIV | 202 | 半连续 | 2 | 221 | 半连续 | (-) |
| XV | 221 | 半连续 | 2 | 248 | 半连续 | (+) |
| XVI | 248 | 半连续 | 2 | 258 | 半连续 | (-) |
| XVII | 258 | 半连续 | 2 | 279 | 半连续 | (+) |
| XVIII | 279 | 半连续 | 4 | 1.5 | 半连续 | (-) |
| XIX | 279 | 半连续 | 3 | 4 | 1.5 | (+) |
| XX | 368 | 半连续 | 4 | 1.5 | (-) |
| XXI | 368 | 半连续 | 3 | 3 | (+) |
| XXII | 377 | 半连续 | 3 | 3 | (-) |
| XXIII | 377 | 半连续 | 4 | 1.5 | (-) |
| XXIV | 389 | 半连续 | 2 | 4 | (-) |
| XXV | 389 | 半连续 | 4 | 1 | (+) |
| XXVI | 412 | 半连续 | 0.75 | 200 | (-) |
| XXVII | 412 | 半连续 | 2 | 4 | (+) |
| XXVIII | 420 | 半连续 | 0.75 | (-) |从第二阶段（第18-39天）开始，含有NO3-的水以半连续模式输入（表1），通过每6小时更换反应器工作体积的一部分来控制HRT（反应时间）。在第二阶段，使用了与第一阶段相同的HRT和H2过量量。从第三阶段开始，对反应器的配置和操作参数进行了几项调整：i) 在第三阶段（第39-55天），停止了气体循环以验证其对过程的影响，而其他参数保持不变，然后在第四阶段（第55-70天）恢复了气体循环；ii) HRT从第四阶段到第十七阶段逐渐从4天减少到0.75天；iii) 从第X阶段（第157-181天）开始，从半连续模式转换为连续输入NO3-；iv) 在第六阶段（第83-91天）以及从第十一阶段（第181-196天）开始，使用蠕动泵和H2供应通道（图1）以半连续模式自动供应H2。在这些阶段，H2每天分四次等量供应，每次占每日H2供应量的25%。此外，H2的过量量从100%增加到150%和200%（表1）。在第十六阶段（第377-389天）和第十七阶段（第389-412天），使用含有NO3-的泉水作为进水来验证过程。

2.3 分析方法
每天采集出水样品，并通过0.45 μm的混合纤维素酯注射器过滤器（Test Scientific，意大利佩鲁贾）过滤后进行分析。NO3-和NO2-的浓度使用761紧凑型离子色谱仪（Metrohm，瑞士赫里绍）进行测量，该色谱仪配备了IonPac AS12A阴离子柱（NO3-和NO2-的检测限为0.05 mg/L）（Dionex，美国沃尔瑟姆），具体方法如Di Capua等人[24]所述。在每次采样时，使用HI98100 Checker Plus pH计（Hanna Instrument，意大利帕多瓦）记录出水pH值。过滤后的出水使用TOC-LCSN分析仪（岛津，日本京都）检测非挥发性有机碳（NPOC）、无机碳和总碳。NPOC方法包括将样品酸化至pH 2，从而将碳酸盐和碳酸氢盐以二氧化碳的形式去除。剩余的有机碳化合物通过非分散红外传感器（NDIR）氧化成CO2并测量。常规使用Leo 1压力计（Keller，瑞士温特图尔）监测顶空压力。使用HPR-20 R&D质谱仪（Hiden Analytical，英国沃灵顿）每天对顶空进行采样，以评估气体组成，具体方法如Marino等人[31]所述。

2.4 微生物群落分析
在双循环UASB反应器的启动阶段（第0天）、维护期之前（第196天）和反应器运行期末（第420天）收集微生物生物质样本，以评估微生物群落的演变。DNA提取、测序和生物信息学分析由Biomarker Technologies（BMKGENE，德国明斯特）完成。DNA提取使用TGuide S96 Magnetic Soil/Stool DNA Kit（Tiangen Biotech Co.，北京，中国）进行。使用引物对F: ACTCCTACGGGAGGCAGCA和R: GGACTACHVGGGTWTCTAAT扩增细菌16S rRNA基因的V3和V4区域。PCR产物被纯化后，配对末端（2 × 300 bp）在Illumina Novaseq 6000平台（Illumina MiSeq，美国）上进行测序。OTU（操作分类单元）和amplon序列变体（ASV）的分类使用QIIME2中的Naive Bayes分类器进行，参考SILVA数据库（版本138.1）。

2.5 计算
从反应器启动到X阶段，H2以半连续模式手动供应。在这些实验条件下（第0-188天），在确定每日剩余NO3-和NO2-浓度后，根据H2Den反应的化学计量关系[21]计算需要添加的H2量作为电子供体。根据所用的HRT，通过以下公式计算添加含有NO3-的水后的反应器内NO3-浓度[NO3?]R：(2)[NO3?]R=[NO3?]INF?1HRT+[NO3?]d?(1?1HRT)其中[NO3?]INF是进水中的NO3-浓度，[NO3?]d是反应器中测得的每日剩余NO3-浓度。HRT值以天数表示，取决于所考虑的实验阶段（表1）。已知[NO3?]R和工作体积（Vwork），可以使用以下公式计算通过反硝化作用去除的NO3-的质量mNO3?和摩尔数nNO3?：(3)mNOa?=[NO3?]RVwork/(1000)(4)nNO3?=mNO3?/PMNO3?因此，需要添加的H2体积通过理想气体定律计算，并减去该分析日反应器顶空中已有的H2体积分数。

从第XI阶段开始（第189-420天），UASB反应器在含有NO3-的水的输入方面改为连续模式。因此，H2的供应量基于进水中的NO3-浓度（即200 mg/L）进行计算。某一天的NO3-去除效率（NRE）使用以下公式计算：(5)NRE=[NO3?]INF?[NO3?]EFF/([NO3?]INF?100)其中[NO3?]INF和[NO3?]EFF分别是进水和出水中的NO3-浓度。表S2中的NRE值是调查期间每日平均值。

反硝化速率（mg NO3-/L/d）、N2O排放率和N-N2O产生/消耗百分比的计算方法在文本S1中提供。此外，引入了一个称为操作氢输入的性能指标，用于量化每单位处理氮质量的氢质量。详细的计算方法在文本S1中提供。

2.6 统计数据分析
使用Statistics for Data Analysis（SPS，意大利博洛尼亚）进行方差分析（ANOVA）和Tukey检验，以评估不同实验条件下NRE的统计差异。当p值低于0.05时，差异被认为具有统计学意义。

3. 结果与讨论
3.1 操作参数对硝酸盐去除的影响
图2显示了整个R1和R2运行期间出水NO3-浓度的趋势。当使用4天的HRT（第0-55天）时，未观察到超过欧盟指令2020/2184为饮用水设定的50 mg NO3-/L的NO3-限制（图2）。此外，在从手动NO3-供应（第一阶段）到自动半连续模式（第二阶段）的过渡期间，两种反应器的NRE保持稳定（p > 0.05），且高于94%（表S2）。

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图2. – 双循环UASB反应器整个运行期间每天测量的出水硝酸盐（NO3-）浓度（mg/L）的时间趋势：反应器1（），反应器2（），50 mg NO3-/L的NO3-限制（），半连续（）和连续（）液体供应操作下的进水硝酸盐（NO3-）浓度（mg/L）。图中的误差条代表标准偏差。

即使在第三阶段停止气体循环，或在第四阶段（第55-70天）HRT减少到3天时，NRE也没有显著受到影响（p > 0.05，表S2）。在第四阶段，较低的HRT下NO3-负荷率的增加导致反硝化速率上升，即R1和R2分别为45.0 ± 17.6 mg NO3-/L/d和39.8 ± 19.7 mg NO3-/L/d增加到61.0 ± 22.6 mg NO3-/L/d和62.4 ± 27.8 mg NO3-/L/d（表S2）。

在第五阶段（图2），当HRT降低到2天时，广泛超过了NO3-限制。然后在第六阶段，尝试切换到自动半连续气体供应，但在此期间检测到用于储存气体的气囊发生泄漏，导致系统恢复到第四阶段的条件，以稳定反应器的运行并为微生物提供足够的电子供体。第五和第六阶段的NRE值是整个反应器运行期间最低的（p < 0.05）。在第五阶段，R1的NRE为61.0% ± 0.0%，R2的NRE为57.9% ± 0.0%；而在第六阶段，R1的NRE为58.0% ± 12.6%，R2的NRE为72.0% ± 22.5%（表S2）。在第七阶段，将过量氢的比例增加到150%后，未再超过50 mg/L的限制（图2），两种反应器的NRE显著提高（p > 0.05），分别为90.5% ± 6.5%和97.4% ± 4.8%（表S2）。

在第八阶段，由于HRT减少到2.5天，NO3-限制频繁被超过（图2），这突显了在后续阶段增加氢供应的必要性，以确保反硝化微生物有足够的电子供体。通过这种方式，部分H2压力增加，从而提高了H2的溶解度，并增加了微生物可利用的电子供体。

Zhou等人[20]观察到，H2分压从0.5巴增加到9巴时，溶解的氢增加，特定反硝化速率从1.0·103 mg NO3-/g VSS/d提高到5.4·103 mg NO3-/g VSS/d。同样，Dolejs等人[34]观察到，将用作无机电子供体的硫化物过量量增加到理论量的60%是完成反硝化所必需的，反硝化速率为1.6·103 mg NO3-/L/d。因此，在本研究中，从第九阶段开始将过量氢的比例增加到200%。

在第九阶段增加过量氢后，第十阶段实施了连续NO3-供应，以更好地模拟全尺寸反应器的操作条件，并确保微生物生物质与含NO3-液相之间更真实的相互作用。然而，只有在第十一阶段转换为自动半连续气体供应时才实现了决定性的改进，这使得氢的供应时间从每周五天延长到七天。总体而言，稳定的H2供应导致出水NO3-浓度更加稳定（图2），R1的NRE为93.9% ± 9.9%，R2的NRE为96.4% ± 6.6%（表S2）。

在第十二阶段，尝试将过量H2比例降低到100%同时将HRT减少到2天时，NRE略有下降（p > 0.05），即R1为90.6% ± 13.9%，R2为87.4% ± 21.4%（表S2），表明即使在半连续H2供应下，200%的H2过量仍然有利于在较低的HRT下保持高NRE。实际上，在第十三阶段，未超过限制（图2），NRE分别增加到98.3% ± 2.6%和98.1% ± 2.8%（表S2）。在第十四阶段，HRT进一步减少到1.5天时，NRE分别为98.8% ± 0.8%和93.9% ± 14.6%（表S2）。

在第十五阶段，尽管HRT为1天，NRE仍然很高（p > 0.05），即R1为95.5% ± 8.0%，R2为93.6% ± 8.8%，尽管某些日子的出水NO3-浓度超过了限制（图2），因为出现了多种反应器故障。例如，在第263天，液体循环泵发生了故障，这可能限制了液相与微生物的接触。这证实了在低HRT（即1天）运行UASB反应器时液体循环的重要性。类似地，Epsztein等人[35]在加压高速附着生长反应器中研究了H2Den，发现在没有液体循环的情况下反硝化速率为6.2·103 mg NO3-/L/d，而当启用液体循环时，反硝化速率达到21.7·103 mg NO3-/L/d。在我们的研究中，第十五阶段之后进行了第十五阶段的重复实验，条件相同。

在第十六阶段，使用含有NO3-的泉水验证过程时，观察到显著的NRE，即高达98.5%（表S2，p > 0.05），以达到200 mg/L的NO3-浓度（表S2）。平均反硝化速率达到166.6 ± 61.8 mg NO3-/L/d（表S2），这是Marino等人（2025）在批次试验中报告的最大值的五倍以上。同样，Wang等人[28]观察到随着反硝化反应时间的缩短（低于24小时），在流化床反应器中使用AnGS作为接种剂进行合成地下水处理，并以连续模式供应氢气时，NO3-的去除率逐渐提高，最高可达1.9×10^3 mg NO3^-/L/d，起始浓度为68.2 mg NO3^-/L。在第十七期实验中，UASB双循环生物反应器在0.75天（18小时）的HRT下运行，结果R1的NRE为88.2%±16.3%，R2的NRE为81.7%±20.2%（见表S2）。在这些条件下，本研究获得了最高的平均反硝化速率，分别为R1的246.2±92.8 mg NO3^-/L/d和R2的244.6±105.7 mg NO3^-/L/d。然而，在第十七期实验中，H2Den过程相当不稳定，多个NO3^-出水浓度超过了50 mg/L的监管限制。因此，在第十八期实验中，HRT恢复为1天，几乎完全去除了NO3^-，这证实了系统能够快速适应操作变化。

3.2 不同操作参数变化下的亚硝酸盐积累
亚硝酸盐（NO2-*）的监测对于H2Den的控制和优化至关重要，因为亚硝酸盐的积累可能表明NO3-*的还原不完全，并可能反映操作限制[23]。图3显示了R1和R2在整个420天期间出水亚硝酸盐浓度的变化趋势。
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图3. – 双循环UASB反应器整个运行期间每日测量的出水亚硝酸盐（NO2-*）浓度的时间趋势：反应器1（），反应器2（），亚硝酸盐的监管限制为0.5 mg/L（）。图中的误差条代表标准偏差。

在第一期和第二期中，R1的亚硝酸盐浓度始终低于0.5 mg/L的监管限制，除了在第38天，当时由于系统未供应氢气，亚硝酸盐浓度短暂上升到2.0 mg/L。同样，在R2中，亚硝酸盐的监管限制仅在第一期和第二期被超过两次（见图3）。在第三期，虽然NO3-*的去除没有受到影响（见图2），但由于缺乏气体再循环，R1的出水亚硝酸盐浓度增加到11.8 mg NO3^-/L，R2的出水亚硝酸盐浓度增加到5.1 mg NO3^-/L。溶解氢气的减少与观察到的亚硝酸盐积累一致，这表明在这些条件下，亚硝酸盐还原酶比硝酸盐还原酶对电子供体的限制更为敏感[36]。作为一种关键参数，可以通过使用能够减小气泡尺寸并增加氢气溶解度的喷射器来改进气体再循环。

Eamrat等人[37]研究了微氢气泡悬浮生长反应器在H2Den中的性能，发现使用微气泡扩散器代替喷射器可以提高氢气溶解度，从而将氮去除效率提高到99%，并且不会产生亚硝酸盐积累。在第四期，当气体再循环恢复且HRT减少到3天时，R1在第67天和第70天的亚硝酸盐浓度出现波动，最大达到21.7 mg NO3^-/L（见图3）。在第五期和第六期，由于系统故障，超过NO3-*的监管限制（见图2）也导致了亚硝酸盐的显著积累（见图3）。

在第五期，由于每周仅手动供应5天的氢气，两个反应器都无法在2天的较低HRT下正常运行。这导致R1的出水亚硝酸盐平均浓度为19.0 mg/L，R2的出水亚硝酸盐平均浓度为7.1 mg/L。同样，在第六期，虽然尝试通过蠕动泵每周供应7天的氢气，但氢气未能正常供应到系统中，反硝化过程几乎完全停止。这个问题导致NO3-*转化为NO2-*的转化率降低，从而使得亚硝酸盐积累减少。因此，增加氢气供应被认为是限制亚硝酸盐积累的关键因素。Kamei等人[38]观察到，在实验室规模的移动床生物膜反应器中，由于氢气流量从40 mL H2/min降低到15 mL H2/min，部分H2Den导致亚硝酸盐积累达到56 mg NO2^-/L。

在第七期，将氢气供应量增加到150%，HRT为3天，显著减少了亚硝酸盐的积累（见图3）。仅在R2中观察到一次超过监管限制的情况（即第109天的4.5 mg NO2^-/L），而R1中的液体再循环故障导致第104天的亚硝酸盐积累达到21.4 mg NO2^-/L，进一步证实了本研究中提出的双循环系统的重要性。从第八期开始，当HRT减少到2.5天时，观察到亚硝酸盐积累增加。R1的亚硝酸盐浓度达到20.0 mg NO3^-/L，R2的亚硝酸盐浓度达到21.9 mg NO3^-/L（见图3）。在随后的第九期，将氢气供应量增加到200%，结合从第十期开始实施的连续液体进料，有助于随着时间的推移减轻亚硝酸盐的积累。尽管尚未完全实现NO2-*的转化。

在第十一期，每周自动半连续供应氢气使亚硝酸盐浓度始终保持在0.5 mg NO3^-/L的监管限制以下。实际上，在第十一期，R1的平均亚硝酸盐浓度为0.5 mg NO3^-/L，R2的平均亚硝酸盐浓度为0.1 mg NO3^-/L。氢气分压的增加，以及液体相中溶解氢气的增加，减少了NO3-*还原酶和亚硝酸盐还原酶对电子供体的竞争，从而降低了系统中的亚硝酸盐积累[36]。这一行为得到了第十二期实验结果的支持，该实验旨在评估在自动半连续气体供应下，2天HRT操作时是否需要100%的氢气过量。然而，这些操作条件再次导致了亚硝酸盐积累，R1的亚硝酸盐积累达到18.9 mg NO3^-/L，R2的亚硝酸盐积累达到17.4 mg NO3^-/L，这表明需要200%的氢气过量才能降低HRT。

在第十三期和第十四期，分别在200%的氢气过量和2.0天及1.5天的HRT下运行时，从第231天起亚硝酸盐积累最小（见图3）。在第十五期，由于操作期间发生了多次系统故障，过程受到影响。因此，在第十五期中，反应器在与第一十五期相同的条件下运行。在第十五期中，即使HRT为1天，也没有观察到亚硝酸盐积累；同样，在第十六期使用添加了NO3-*的泉水进行验证时，R1的平均亚硝酸盐浓度为0.3 mg NO3^-/L，R2的平均亚硝酸盐浓度为0.2 mg NO3^-/L（见图3）。

在本研究的最后一个时期（第十七期），当HRT为0.75天时，系统观察到亚硝酸盐积累增加，这表明在测试的实验条件下，稳定的H2Den过程的HRT阈值为1天。在第十七期，两个反应器均达到了整个运行期间最高的亚硝酸盐浓度，分别为R1的121.5 mg NO3^-/L和R2的94.6 mg NO3^-/L。在氢气受限的条件下，NO3-*还原酶和亚硝酸盐还原酶对电子的竞争加剧。由于NO3-*还原酶具有更高的电子亲和力，允许更快的NO3-*还原[36]，因此亚硝酸盐在液体相中积累，表明亚硝酸盐还原酶对氢气供应不足更为敏感，需要更高的电子供体供应来维持完全的反硝化作用。

3.3 气体排放、氢气和碳的利用
监测H2Den过程中形成的气体中间体至关重要，因为像NO和N2O这样的化合物会加剧大气污染和气候变化[39]。因此，观察它们的时间趋势对于H2Den的优化至关重要。图4报告了两个反应器每天平均顶空气体组成的变化（R1和R2的平均值）。
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图4. – 平均（R1和R2之间）气体组成的变化趋势（%）：氢气（），一氧化氮（），甲烷（），水（），氮气（），一氧化二氮（）和二氧化碳（）。100%的补充值由实验开始时用于冲洗反应器的氩气表示。

从第一期到第十期，即在整个手动供应氢气的期间，当系统中不添加氢气时，顶空中的氢气百分比迅速下降，证实H2Den是本研究中主要的NO3-*去除过程。在第三期，由于缺乏气体再循环，顶空中的氢气百分比增加（从第二期的4.3%增加到第三期的9.1%），表明氢气的溶解度及其对H2Den的可用性降低（见图4）。实际上，在第三期，两个反应器的操作氢气输入量（见表S3）比前两个时期减少，R1为0.3 ± 0.4 kg H2/kg N-NO3-，R2为0.4 ± 0.4 kg H2/kg N-NO3-（见表S3）。

从第十一期开始，实现了自动氢气供应，这导致顶空中的氢气百分比增加（见图4），表明微生物可获得更多且更稳定的氢气量，从而提高了H2Den的效率（见图2和图3）。在这些供应条件下，操作氢气输入量始终超过1.0 kg H2/kg N-NO3-。在R2的1天HRT下，操作氢气输入量在第十?期和验证阶段（第十六期）达到了2.0 ± 1.0 kg H2/kg N-NO3-。特别是根据观察到的数据，大约需要13.9:1的氢气与氮气的摩尔比（mol H2: mol N）来将N（即N-NO3-和N-NO2-）降低到NO3-和NO2-*的监管限制以下。这个值远高于Di Capua等人[21]报告的理论化学计量比2.5:1（相当于0.36 kg H2/kg N），后者假设液体相中的氢气完全可用。实际上，在本研究中，氢气是以气相形式供应的，操作氢气输入量是根据系统中供应的氢气总量计算的。然而，这里观察到的操作氢气输入量（见表S3）与之前关于H2Den的研究结果一致，这些研究表明增加氢气供应是实现连续反应器中完全去除NO3-*和NO2-*的关键操作因素[38]。尽管如此，这种供应策略的成本可能低于一些连续H2Den系统的成本，例如Wang等人（2022）[28]报道的反应器配置，其中氢气以恒定流量连续供应。假设氢气的成本在2.4-4.7 €/kg H2范围内[21]，并考虑到两项研究的最佳操作条件，本研究的特定总成本为0.0008-0.0040 €/g NO3-去除。相比之下，Wang等人（2022）[28]提出的连续系统中，氢气以61.6 L/d的恒定流量供应，根据相同的成本假设，特定总成本约为0.011–0.054 €/g NO3-去除。因此，气体再循环的存在可能提高氢气的溶解度和可用性，从而减少实现完全反硝化所需的外部氢气供应量，从而降低特定总成本。

特别是，尽管氢气供应量增加且顶空配置封闭，但由于实施了气体再循环策略，反应器在稳定的压力条件下运行（数据未显示），防止了氢气从反应器中释放。氮气（N2）作为反硝化过程的最终产物，在两个反应器中的测量百分比高达96%，表明反硝化反应已完成。CH4的百分比在R1中达到最大值1.3%，在R2中达到最大值1.9%（见图4）。尽管含量相对较低，但CH4的存在可以归因于本研究中使用的活性污泥（AnGS），这些活性污泥是从用于处理乳废水的UASB反应器中收集的，该反应器旨在产生CH4[33]。CO2的百分比最高可达0.7%，这与之前关于自养反硝化过程的研究结果一致[40]。关于NO，整个运行期间在顶部空间观察到的平均百分比分别为R1为0.8%，R2为1.3%（图4）。通常情况下，酸性的pH值会通过限制反硝化速率来促进有害中间体（如NO）的积累[41]。然而，在这种情况下，pH值始终高于7（补充文本S2和图4.1），这表明在这些条件下NO的形成可能性较低[42]。至于N2O，只有在第一阶段期间，其排放率（如S1中报告的）才达到较高水平，即R1为8.7·10-2 μg N2O/min，R2为1.4·10-1 μg N2O/min（表S3），这一数值明显高于Marino等人[31]在批处理试验中观察到的最大N2O排放率2.6·10-3 μg N2O/min（此时氢气过量100%，接种物比例为10%）。然而，在初始阶段之后，整个研究期间的N2O排放量一直保持较低水平，特别是在工艺性能最佳的运行期间。此外，N2O排放率经常为负值，表明N2O在反硝化过程中被还原为N2。实际上，N-N2O的产生/消耗百分比（表S3）是通过测量到的N-N2O摩尔数与去除的N-NO3-摩尔数之比计算得出的（S1），在HRT为1天且氢气过量200%的条件下，这一比例仅为0.1%。这一结果与其他关于自养反硝化的研究结果相当[28]、[43]。例如，S. Wang等人[28]报告的N-N2O与N-NO3-的摩尔比值为0.7%。最后，溶解的NPOC浓度在整个反应器运行期间保持稳定。平均而言，R1和R2的出水NPOC浓度分别为0.67 mg/L和0.49 mg/L（图S2）。这些数值与Wang等人[28]在H2Den研究中使用相同活性污泥在不同反应器配置下的结果相当，其有机碳浓度为0.52 mg/L。虽然观察到短暂的增加，但在第369天R1的NPOC浓度达到最大值3.0 mg/L，R2为2.5 mg/L（第129天）。这些情况也与较低的工艺性能相关，尤其是在NO3-去除和NO2-积累方面。特别是第129天（第VIII阶段）的升高与反硝化不完全有关，这一点也从NO2-的积累（分别达到15.7 mg NO2-/L）中得到证实。这些条件可能对生物量的性能产生了不利影响，有可能导致有机碳释放到液体相中。因此，微生物聚集体中的颗粒结构确保了较低的有机碳释放到出水中，从而保证了出水的高质量，使这一工艺适用于生产供人类饮用的水的治疗厂。补充文本S2还报告了pH值的变化趋势。

3.4. 颗粒污泥中的微生物群落组成
在反应器开始运行时（第0天）、维护期之前（第196天）以及运行期结束时（第420天）进行了微生物分析，以评估微生物的适应性和种类变化。在第0天，两个反应器中微生物群落的分类显示Chloroflexi（即13.3%）、Fermentibacterota（即12.8%）、Bacteroidota（即10.5%）、Firmicutes（即10.1%）和Proteobacteria（即8.7%）门占主导地位（图5A）。这些门是参与乳废水处理最常见的门类，尤其是在厌氧过程中[44]、[45]。在科级别，Bacteroidetes_vadinHA17（属于Bacteroidota门）和Fermentibacteraceae（也属于Bacteroidota门）占优势（图5C）。这两个科都与乳废水中发现的有机底物的降解有关[46]。
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图5. – 双循环UASB反应器运行期间微生物群落在门（A）、纲（B）和科（C）层面的组成。所有相对丰度低于1%的类别被归为“其他”。

在第196天，即第XI阶段结束时，观察到Proteobacteria（R1高达16.2%，R2高达20.8%）、Bacteroidota（R1高达20.6%，R2高达18.6%）和Spirochaetota（R1高达9.2%，R2高达11.0%）门的分量增加（图5A）。Proteobacteria被广泛认为是H2Den过程中的关键菌群[47]，尤其是γ-Proteobacteria纲的分量显著增加（R1高达15.0%，R2高达20.1%，起始值为8.1%）（图5B）。尽管Bacteroidota和Spirochaetota通常不与H2Den相关联，但它们在厌氧或缺氧环境中常见[48]。值得注意的是，Bacteroidota门也在其他研究H2Den的过程中被检测到[49]、[50]。在科级别，Bacteroidetes_vadinHA17（R1高达18.0%，R2高达15.0%）和Rhodocyclaceae（R1高达6.8%，R2高达8.0%）的分量显著增加（图5C）。后者经常参与H2Den过程[21]。另一方面，Fermentibacterota（R1为4.5%，R2为4.3%）、Firmicutes（R1为5.9%，R2为2.3%）和Chloroflexi（R1为8.9%，R2为10.1%）门在第196天的比例下降（图5A）。因此，与Fermentibacterota门相关的Fermentibacteraceae科的比例也有所下降（R1降至4.5%，R2降至4.3%）（图5C）。实际上，在乳废水处理厂中，它们的生长受到了促进，这是最初的接种物应用。然而，在当前系统中转变为反硝化条件后，它们的相对丰度下降（图5A）。

在第420天，即反应器运行期结束时，Proteobacteria门继续主导微生物群落（R1高达32.6%，R2高达18.4%），这与它们在H2Den过程中的作用一致（图5A）。此外，Spirochaetota门进一步富集（R1高达13.2%，R2高达22.2%）（图5A）。相应地，与Spirochaetota门相关的Spirochaetaceae科在R1中增加到11.4%，R2中增加到19.3%（图5C）。同时，与Proteobacteria门相关的Comamonadaceae科在R1中富集到19.3%，R2中富集到9.0%（图5C）。该科与反硝化过程相关[51]。相比之下，Bacteroidota门的相对丰度下降（R1降至16.7%，R2降至9.5%）（图5A），相关的Bacteroidetes_vadinHA17科也是如此（R1降至2.4%，R2降至6.3%）（图5C）。与Proteobacteria门相关的Rhodocyclaceae科的相对丰度在R2中降至1.7%，而在R1中相对稳定在6.0%左右（图5C）。

4. 结论
本研究证明了双循环UASB反应器在维持稳定的H2Den方面的有效性，实现了高达99%的NO3-去除率。连续液体进料和半连续H2供应的组合成功应对了HRT的降低以及恒定的进料NO3-浓度（200 mg/L）。在H2供应量为200%且HRT为1天的条件下，NO2-的积累量最低，仅为0.3 mg/L。气体循环的缺失增加了出水中NO2-的浓度，表明NO2-的还原对H2可用性的减少更为敏感。低溶解有机碳含量表明，利用AnGS的H2Den方法是处理饮用水的一种有前景的解决方案。GHG（如N2O和CH4）的排放量极少，强调了该过程的低碳足迹。使用泉水作为进水进行的验证证实了所提出的处理方法在更实际条件下的可行性。在运行期结束时，Proteobacteria和Spirochaetota门在微生物群落中占主导地位，其相对丰度分别达到32.6%和22.2%。

**CRediT作者贡献声明**
Francesco Pirozzi：撰写 - 审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调、资金获取。
Giovanni Esposito：撰写 - 审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调、概念构思。
Stefano Papirio：撰写 - 审稿与编辑、监督、资源管理、项目协调、概念构思。
Armando Oliva：撰写 - 审稿与编辑、验证、监督、概念构思。
Emanuele Marino：撰写 - 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、调查、数据分析、数据管理、概念构思。

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