从废物到价值：筛选啤酒厂废水和微藻菌株以实现资源回收

《Journal of Environmental Management》：From waste to value: Screening brewery effluent and microalgae strains for resource recovery

　　贝伦·比利亚雷アル-托里比奥（Belén Villarreal-Toribio）|路易莎·巴尔博纳利亚（Luisa Barbonaglia）|文森佐·安德烈亚·里吉奥（Vincenzo Andrea Riggio）|埃蒂埃尔·格雷克·德·莫赖斯（Etiele Greque de Morais）|恩里卡·乌杰蒂（Enrica Uggetti）

加泰罗尼亚理工大学（UPC）巴塞罗那分校土木与环境工程系（DECA），环境工程与微生物学小组（GEMMA），巴塞罗那土木工程学院（ETSECCPB），西班牙巴塞罗那08034，C. Jordi Girona 1-3，D1号楼

**摘要**

大型啤酒厂产生的废水富含营养物质，在排放到城市污水处理厂之前需要经过有效处理。本研究旨在确定啤酒厂废水与微藻株的最佳组合，以增强营养物质去除率和生物质产量。实验使用了啤酒厂污水处理厂五个处理阶段的废水作为微藻培养基：原始废水（E?1）、预酸化废水（E?2）、厌氧处理废水（E?3）、好氧处理废水（E?4）和溶解空气浮选废水（E?5）。这些废水的分析显示总有机碳含量较高，其中E?1和E?2中的乙酸浓度分别达到67.6 mg/L和471.8 mg/L。批次实验表明，在预酸化废水（E?2）中培养的Scenedesmus sp.具有良好的生物质产生能力（0.93 g/L）和较高的营养物质去除率（磷酸盐100%、总有机碳81%、总氮68%）。E?1和E?2中的营养物质负荷有利于其中的微藻和本土细菌的共生，其中Scenedesmus sp.占主导地位。乙酸是促进这种共生体系及生物质产生的关键营养物质。这种共生体系有望替代啤酒厂污水处理中的好氧和厌氧处理步骤，从而将化学需氧量（COD）降低到排放标准以下。结果表明，微藻-细菌共生体系是传统啤酒厂废水处理的可持续高效替代方案，既能改善环境，又能产生可作为动物饲料或农业生物刺激剂的生物质。

**1. 引言**

全球范围内，啤酒是最广泛的酒精饮料，其生产过程需要大量水资源。2021年全球啤酒产量约为18.9 billion hl（Belardi等人，2025年）。考虑到生产1 L啤酒需要3至7 L的水，啤酒酿造行业属于高水和能源消耗型产业（Olajire，2020年）。这些水资源不仅用于酿造过程，还用于麦芽制备、设备清洗、瓶子冲洗和冷却等环节。中型和大型啤酒厂（年产量超过17,600 hl）产生的废水含有高浓度的有机污染物，远超欧盟2010/75号指令规定的排放限值（Directive 2010/75/EU）。因此，这些啤酒厂必须将废水排入市政污水系统，由城市污水处理厂进行处理。为了避免污水处理厂超负荷运行，啤酒厂需进行现场预处理，将有机物、营养物质和其他污染物降至可接受水平。这一过程成本较高，约为每立方米1.80欧元（Verhuelsdonk等人，2021年）。

典型的啤酒厂污水处理厂采用物理、化学和生物方法。物理方法包括沉淀和膜过滤；化学方法包括pH值调节、溶解空气浮选和混凝；生物方法包括厌氧和好氧处理，两者可结合使用（如膜生物反应器处理或空气阴极微生物燃料电池处理，Amenorfenyo等人，2019年）。厌氧细菌常用于去除化学需氧量（COD），去除率可达80-90%（Yirgu等人，2020年）。处理后的废水可产生沼气，可作为啤酒厂的能源，但也会产生难以处理的污泥（Amenorfenyo等人，2019年）。然而，厌氧处理存在氮和磷去除率较低以及初始投资和运营成本较高的问题（Maria等人，2023年）。此外，处理后的废水还需满足额外的排放要求（如氧气浓度、微生物负荷和挥发性脂肪酸含量），因此还需进一步处理（Amenorfenyo等人，2019年）。

不同啤酒厂及不同生产阶段的废水成分有所差异，这取决于所生产的啤酒类型和生产工艺。例如，Yirgu等人（2020年）报告的总氮（TN）浓度为44.3 mg/L，而Lois-Milevicich等人（2020年）测得的浓度为1238 mg/L；总磷（TP）浓度范围为1.15 mg/L至95.2 mg/L（Lois-Milevicich等人，2020年；Wang等人，2023年）。啤酒厂废水通常具有较高的COD负荷，但浓度范围很广（995至32,000 mg O2/L）。因此，每个啤酒厂的污水处理厂设计都是定制的。微藻可作为厌氧和好氧处理的替代方案，因为微藻与细菌的共生关系不仅能去除有机物，还能去除氮和磷，减少污泥形成和温室气体排放（Amenorfenyo等人，2019年）。传统生物处理会产生需进一步处理的细菌污泥，其处理成本约为每立方米废水0.10美元（Oke等人，2023年）。相比之下，微藻生物质具有较高价值：其高蛋白含量使其适合作为动物饲料成分，其生物活性化合物（包括多糖和植物激素）使其可作为农业生物刺激剂（Alvarez-González等人，2022年；Jesus等人，2025年）。从污泥处理转向生物质增值不仅降低成本，还促进了循环生物经济模式的发展（Verhuelsdonk等人，2021年）。此外，微藻能在多种环境中生长，并能快速适应不同的培养基条件，可能提升污水处理厂的稳定性，替代部分现有处理步骤。既往研究多关注厌氧或好氧消化后的废水（Ferreira等人，2017年；Yirgu等人，2020年、2021年）或合成/灭菌后的废水（Brooke等人，2025年；Mata等人，2012年；Song等人，2020年）。这些废水的有机物和营养物质负荷通常较低，因此可能低估了微藻处理原始或轻度处理废水的潜力与效果。因此，研究能够替代传统生物处理方法的最佳微藻-细菌共生体系至关重要。

本研究旨在分析啤酒厂污水处理厂各处理阶段的废水特征，并在实验室规模上探索基于微藻的处理方法。研究将初步评估微藻-细菌体系作为传统啤酒厂废水处理步骤的可行性替代方案，尽量接近原始废水状态，从而简化流程并降低成本。具体包括在多种非无菌啤酒厂废水中培养不同微藻株，评估其去除营养物质和产生生物质的潜力。

**2. 材料与方法**

2.1. 废水特征与稳定性

废水样本采集自西班牙巴塞罗那El Prat de Llobregat地区一家啤酒厂的五个处理阶段。这些阶段包括初次沉淀（E?1），用于分离水中污泥；随后进行pH值调节（E?2），确保废水进入下一阶段（厌氧处理E?3）前的中性状态，该阶段用于减少有机物并产生沼气；之后进行好氧处理（E?4），以去除异味和COD；最后进行溶解空气浮选处理（E?5），利用气泡和混凝剂将脂肪和油类物质带到水面并收集。新鲜样品在8小时内用于分析物理和化学参数（依据William C. Lipps，2023年）。微量营养物质和重金属通过德国Triton GmbH公司的ICP-OES仪器进行外部检测。

2.2. 微藻株与筛选方案

Scenedesmus sp.和Chlorella sp.从加泰罗尼亚理工大学的人工培养池中分离获得；Spirulina sp. LEB 52由巴西里奥格兰德联邦大学（Universidade Federal do Rio Grande）提供。Scenedesmus sp.和Chlorella sp.菌株在BG-11培养基（Andersen，2005年）中培养，Spirulina sp. LEB 52则在改良后的Zarrouk培养基（Cogne等人，2003年）中培养。实验中将这三种微藻应用于五种废水（E?1、E?2、E?3、E?4、E?5）中进行测试。实验培养条件为25 ± 1°C，持续搅拌速度100 rpm，光照强度为78 μmol/m2/s（16:8光暗循环，BoreaLED）。实验起始时微藻干重为0.2 g/L（通过7000 rpm离心10分钟获得），培养体积为50 mL（Erlenmeyer烧瓶）。

2.3. 分析方法

2.3.1. 生物量增长

通过测量680 nm处的光密度来监测微藻细胞生长情况，该值可作为叶绿素含量的替代指标。样品稀释至OD680值在0.10至0.80之间，使用Spectronic GENESYSTM 8紫外-可见光分光光度计进行测量。挥发性悬浮固体（VSS）在实验第0天和第7天根据William C. Lipps（2023年）的标准方法进行测定。生物质产量以实验结束时VSS的增加量表示。定期使用Motic公司（BA310）显微镜检查培养物，确认微藻优势。细胞计数包括单个细胞和少于五个细胞的聚集体。

2.3.2. 营养物质去除

在第0天和第7天，从过滤后的上清液中分析阴离子、铵（NH4+）、总有机碳（TOC）和总氮（TN），以评估污水处理效果。样品储存在-18°C。TOC和TN使用Analytikjena公司的multi-N/C 2100 S分析仪测定。离子色谱仪（Metrohm Eco IC，配备Metrosep A Supp 19-250 4.0柱）用于分离阴离子，洗脱液含8 mmol/L碳酸钠和0.25 mM碳酸氢钠。样品在60°C下加热30分钟以去除蛋白质，随后在8500 rpm下离心20分钟。上清液通过0.45-μm PTFE过滤器过滤。MagIC Net软件用于数据操作和监控。阴离子分析采用40分钟的高强度脉冲分析。NH4+使用VWR? Salicylate Method试剂盒测定。营养物质去除效率（RE，%）根据以下公式计算：

**公式1：**
RE = (Cin ? Cout) / Cin × 100
其中Cin为废水初始营养物质浓度，Cout为上清液中的营养物质浓度。

2.4. 数据分析

本研究中OD680的数值为三次实验的平均值（n = 3）。VSS数据每组至少使用四个过滤器（n ≥ 4，第0天）；第七天每个重复实验使用四个过滤器（n ≥ 12）。生物质生长数据使用SPSS（IBM SPSS Statistics 28）进行分析。采用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验（p < 0.05）。在筛选实验中，由于实验结束时剩余体积较少，将生物重复实验的上清液合并。TOC和TN的数据进行两次技术重复实验（n = 2），并进行了t检验。由于设备限制，阴离子未进行重复实验，因此去除效率仅为反映实验条件的参考值，而非统计验证的结果。

**3. 结果与讨论**

3.1. 废水特征与稳定性

对啤酒厂污水处理厂不同处理阶段的废水进行了物理化学参数分析，以评估其适合微藻生长的潜力（表1）。第五阶段废水中的BOD5浓度用于评估有机物的可生物降解性，这可能影响微藻对营养物质的吸收。E?1和E?2的BOD5浓度分别为3426 mg O2/L和1024 mg O2/L，高于Bakare等人（2017年报告的原始啤酒废水2180-3018 mg O2/L）。高CODt和BOD5值表明废水中含有大量来自清洁剂、废谷物中的可溶性碳水化合物以及发酵过程中产生的酒精（Shumbe等人，2024年）。其他废水的BOD5浓度较低（分别为128 mg O2/L、65 mg O2/L和45 mg O2/L），这符合厌氧和好氧反应器处理后的预期结果（E?3和E?4）。

**表1. 五种啤酒厂废水的物理化学参数（n = 3）**
（数据依据巴塞罗那大区当地法规规定的工业废水处理限值（àrea Metropolitana de Barcelona，2019年）基于有机碳含量计算出的摩尔C/N/P比例。
空单元
E?1
E?2
E?3
E?4
E?5
局部限值
pH值
7.5
7.0
7.3
7.4
7.8
6
-10
浊度（NTU）
193
27
23
23
58
36
8.4
电导率（mS/cm）
431
397
418
390
418
6
总悬浮固体（TSS）（g/L）
0.39 ± 0.02ab
0.43 ± 0.02a
0.37 ± 0.02ab
0.35 ± 0.05b
0.11 ± 0.04c
0.75
挥发性悬浮固体（VSS）（g/L）
0.29 ± 0.07ab
0.31 ± 0.01a
0.29 ± 0.03ab
0.26 ± 0.04b
0.09 ± 0.03c
化学需氧量（COD t）（mg O2/L）
587
77 ± 245a
324
7 ± 152b
495 ± 100c
419 ± 13c
201 ± 16c
500
生化需氧量（BOD5）（mg O2/L）
343
6
102
4
128
6
54
57
50
总有机碳（TOC）（mg/L）
1910 ± 22a
968 ± 19b
172 ± 29c
143 ± 22c
107 ± 25c
总氮（TN）（mg/L）
50.3 ± 2.0a
41.1 ± 2.7ab
32.5 ± 2.3bc
27.4 ± 2.3c
26.9 ± 2.0c
总磷（TP）（mg/L）
10.6
7.5
8.5
10.3
8.7
50
摩尔C/N/P比例
465:1
11:1
333:1
2:9:1
36:6:1
32:7:1
乙酸盐（mg/L）
67.6
47
18
BDL
BDL
BDL
NH4+（mg/L）
109
18
13
13
60
SO42?（mg/L）
59.2
5.2
8.6
18.1
18.9
1000
NO3?（mg/L）
25.7
BDL
BDL
8.7
11.7
100
PO43?（mg/L）
27.4
17.7
24.5
28.8
26.4
小写字母表示根据事后检验（p < 0.05）在废水之间有统计学上的显著差异。BDL = 低于检测限。

总氮（TN）含量从E?1到E?5逐渐减少，其中E?1的浓度最高（50.3 mg/L），E?5的浓度最低（26.9 mg/L）。相比之下，总磷（TP）水平在废水中的变化不大，范围从E?2的7.5 mg/L到E?1的10.6 mg/L。微藻可以代谢小分子有机碳（Cheng等人，2021年）。在这些分子中，乙酸盐在E?1和E?2中的含量分别为67.6 mg/L和471.8 mg/L，而在其他废水中未检测到。因此，微藻可能以异养或混合营养的方式生长。

考虑到每种废水的C/N/P比例，可以预测哪些营养物质可能会限制微藻的生长（表1）。微藻的Redfield比值为106:16:1；因此，E?1和E?2（分别为465:11:1和333:12:1）具有在没有CO2补充的情况下提供足够碳的潜力。然而，氮可能是生长限制因素，因为所有五种废水的N/P比例（12:1到6:1）都低于Redfield比值（Cai等人，2022年；Qian等人，2024年）。

就微量元素而言（见补充数据），B2+和Mo2+对光合作用都很重要（Wan等人，2025年），但在本研究中未检测到，这些元素在连续生产过程中可能成为限制因素（De Paepe等人，2023年）。需要注意的是，这项研究是基于批次实验进行的，在此期间BG-11培养基中的大多数这些元素都过量存在，从而为微藻提供了足够的营养物质。重金属浓度低于排放限值（巴塞罗那大都会区，2019年）。然而，先前的研究已发现啤酒厂废水中存在As2+、Cd2+、Co2+、Cr2+、Ni2+和Pb2+，这些物质来源于原材料、设备污染和灌装过程。这种受污染的水的排放对公共健康和水生生态系统构成潜在风险（Ochommadu等人，2025年）。

总体而言，废水E?1和E?2的化学性质与之前基于原始啤酒厂废水的研究结果相当（Anagnostopoulou等人，2024年；Su等人，2022年；Wang等人，2023年）。这两种废水分别是原始废水和经过沉淀池处理后的废水。E?3是厌氧处理的出水，因此可以与之前描述厌氧消化后啤酒厂废水的研究结果进行比较（Ferreira等人，2019年；Yirgu等人，2020年，2023年）。这里呈现的结果与其他啤酒厂废水相当，从而提高了不同啤酒厂的可扩展性。此外，这是首次对啤酒厂废水处理厂不同阶段的废水进行表征，以评估微藻优化水处理厂的潜力。

3.2 微藻生长
总体而言，E?1和E?2表现出最强的支持微藻生长和去除营养物质的潜力，可作为啤酒厂污水厂早期处理的战略性选择，并为后续生物处理提供了机会。在E?1和E?2中培养的Scenedesmus sp.的VSS增加了最多（分别为0.95 g/L和0.93 g/L），其次是E?2中的Chlorella sp.（0.75 g/L）（p < 0.05）。表2展示了最大生物量和VSS增量，以初始VSS为基准进行了标准化，以便不同废水类型之间进行比较。

表2. 实验结束时获得的最大挥发性悬浮固体（Max. VSS）（n > 4）和挥发性悬浮固体增量（ΔVSS）（n > 4）。
空单元
Scenedesmus sp.
Chlorella sp.
Spirulina sp. LEB 52
Max. VSS (g/L)
ΔVSS (g/L)
Max. VSS (g/L)
ΔVSS (g/L)
Max. VSS (g/L)
ΔVSS (g/L)
E-1
1.59 ± 0.08
0.95 ± 0.03a
0.92 ± 0.15
0.36 ± 0.04c
de
0.62 ± 0.08
0.12 ± 0.01
ef
E-2
1.14 ± 0.16
0.93 ± 0.10a
1.18 ± 0.22
0.75 ± 0.2ab
0.32 ± 0.05
0af
E-3
1.06 ± 0.10
0.61 ± 0.04bc
0.89 ± 0.05
0.54 ± 0.03
bcd
1.00 ± 0.08
0.71 ± 0.09ab
E-4
1.35 ± 0.10
0.54 ± 0.09
bcd
1.17 ± 0.08
0.54 ± 0.05
bcd
0.81 ± 0.08
0.31 ± 0.09
de
E-5
0.85 ± 0.07
0.67 ± 0.12b
0.77 ± 0.08
0.57 ± 0.04bc
0.81 ± 0.07
0.69 ± 0.03ab
数值以平均标准差表示。不同字母表示在95%置信水平（p < 0.05）下三种微藻菌株和五种废水之间的平均值存在显著差异。
a
对于E?2中的Spirulina sp. LEB 52，培养物被压碎了。

Yirgu等人（2021年）报告称，在使用类似本研究中E?3（厌氧处理后）的啤酒厂废水培养18天后，Scenedesmus sp.的浓度达到1.05 g/L。在我们的研究中，Scenedesmus sp.在E?3中7天后达到1.06 g/L的最终VSS。如Yirgu等人（2021年）所观察到的，长时间培养会导致生物量生产力下降，因为NH4+被耗尽，从而进入生产停滞阶段。在我们的实验中，E?1（1.59 g/L）和E?2（1.41 g/L）获得了更高的最终生物量；这些样本是在厌氧处理之前收集的，因此显示出更高的营养物质水平。尽管实验条件有所不同，例如光照时间更长、添加了大气CO2或工作体积更大，但我们更高的产量可能是由于营养物质浓度较高。值得注意的是，虽然他们的NH4+水平为40 mg/L，而我们的为18 mg/L，但他们没有报告有机碳含量。相比之下，我们监测了乙酸盐和TOC，认识到它们支持微藻异养或混合营养生长的潜力，这可能解释了在E?1、E?2和E?3中观察到的更高生物量生产。

同一作者分析了类似厌氧处理后啤酒厂废水的季节性变化，发现生物量最高（1.20 g/L）对应于最高的COD浓度，这与有机负荷直接相关。Chlorella vulgaris在黑暗条件下的生物量（0.88–0.92 g/L）高于光照条件下的生物量（0.80–0.82 g/L），进一步证明了微藻适应异养或混合营养生长的能力。Choi（2016年）在类似我们的条件下（无曝气、相同的光照周期、磁力搅拌混合和原始啤酒厂废水）获得了0.80 g/L的Chlorella vulgaris生物量；而我们的研究在E?1中获得了0.92 g/L。尽管光照强度（200 μmol photons m2 s?1 vs 76 μmol photons m2 s?1）和初始培养浓度（0.36 g/L vs 0.2 g/L）有所不同，但我们更高的产量是由于更高的营养负荷（COD 1250 mg/L vs 5877 mg/L、BOD 543 mg/L vs 3436 mg/L、TN 20.3 mg/L vs 50.3 mg/L和TP 6.4 mg/L）。这表明光照强度不是限制因素，而是营养负荷，微藻可能是以异养方式生长的。

啤酒厂废水中存在的本土细菌对不同微藻菌株有不同的影响。例如，在非无菌啤酒厂废水中培养的Scenedesmus sp.在E?2中的生物量产量更高（1.14 g/L），而在无菌合成培养基中培养的Scenedesmus菌株的生物量分别为1 g/L（Song等人，2020年）、0.9 g/L（Mata等人，2012年）和0.9 g/L（Han等人，2021年）。相比之下，Chlorella sp.在其他无菌废水中的生物量积累较低，分别为0.9 g/L（Han等人，2021年）、1.5 g/L（Song等人，2020年）和1.2 g/L（Song等人，2020年）。这种差异突显了微藻菌株的不同适应性：Scenedesmus sp.似乎能很好地适应高微生物负荷的啤酒厂废水，而Chlorella sp.则不然。

尽管许多研究报告了协同效应，但对必需营养物质的竞争或特定抑制性细菌（如产生藻类杀灭剂的细菌）的存在可能会主导菌群内的动态，特别是在原始或高浓度废水中。例如，Das等人（2017年）发现，Chlorella sp.需要在更稀释的非无菌啤酒厂废水（50%稀释）中才能达到最佳生长，而无菌废水只需25%稀释。此外，一些关于Chlorella sp.在啤酒厂废水中的研究指出，虽然本土细菌可能不会显著影响藻类生物量生长，但它们可以改善特定性能指标，如COD去除（Su等人，2022年）。

每日光密度测量对于真实评估生长趋势至关重要。然而，为了准确评估总体生物量产量，考虑VSS的增量更为有效。在实验结束时，E?1中培养的Scenedesmus sp.的光密度显著高于其他废水和物种（图1）。在E?1和E?2废水中，三种微藻表现出相同的趋势：光密度先增加，然后下降。这可能是由于有机碳分子降解导致培养基成分的变化（Pieczonka等人，2023年）。微藻和细菌可以改变培养基的浊度，影响光密度测量（He等人，2022年），特别是在E?1和E?2中，因为这些废水中的TOC含量更高。另一个原因可能是细胞成分的变化，如色素或脂质的积累，或者形成了聚集体，这可能会影响微藻的散射特性（Thiviyanathan等人，2024年）。Scenedesmus sp.和Chlorella sp.的大小相似（10 μm），但Chlorella sp.在五种废水中形成了聚集体（见补充数据）。聚集体的存在会由于细胞间的相互遮蔽而降低平均质量吸收（Hoeniges等人，2020年）。Spirulina sp. LEB 52的细胞形状与其他两种微藻不同：它是丝状的而非圆形的，长度为150 μm，厚度为10 μm，这减少了光散射。

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图1. 三种微藻菌株在五种废水中的680 nm光密度（A）Scenedesmus sp.，（B）Chlorella sp.，（C）Spirulina sp. LEB 52在七天实验期间的变化（n > 3）。

3.3 营养物质去除效率
3.3.1 总有机碳去除
Scenedesmus sp.在E?1和E?2中的总有机碳去除率最高，分别为74%和81%；Chlorella sp.在两种废水中的去除率均为85%，两者之间没有显著差异（p > 0.05）（图2）。其余废水中的三种菌株的TOC去除率显著较低（p < 0.05）。对于E?1和E?2，测得的TOC低于巴塞罗那省城市污水处理厂处理的450 mg/L总有机碳的限值（巴塞罗那大都会区，2019年），因此厌氧和好氧处理（E?3和E?4）可以可能被微藻-细菌处理替代（见补充数据）。E?1和E?2的TOC和BOD5较高（表1）；然而，TOC的减少可能不仅归因于微藻生长，还归因于细菌生长。He等人（2022年）观察到，在无细菌的培养基中（无菌废水），微藻在指数生长初期去除溶解有机碳（DOC）的效率更高。然而，随着时间的推移，由于微藻生长，其效率下降，这与细胞外有机物的释放相吻合。当微藻与细菌在啤酒厂废水中共同生长时，DOC的去除率类似于仅细菌培养的情况（He等人，2022年）。这种现象可以在E?1中培养的Spirulina sp. LEB 52中观察到，其中仍有少数细胞存活。Spirulina sp. LEB 52在E?1中的TOC去除率为83%，与E?2中的去除率82%相当，而E?2中只有细菌生长，实验结束时没有Spirulina sp. LEB 52细胞存活。对于其他三种废水（E?3、E?4和E?5），培养基中的TOC没有下降，在某些情况下甚至有所增加（例如E?3 Scenedesmus sp.、E?5 Chlorella sp.、E?4和E?3 Spirulina sp. LEB 52），这很可能是由于细胞外有机分子的释放和这些废水中的细菌丰度较低。

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图2. A) 在五种啤酒厂废水中培养七天后，Scenedesmus sp.、Chlorella sp.和Spirulina sp. LEB 52的总碳（TOC）、乙酸盐（ACETATE）和总氮（TN）去除效率（%）。B) 在五种啤酒厂废水中培养七天后，Scenedesmus sp.、Chlorella sp.和Spirulina sp. LEB 52的磷酸盐（PO43?）和硫酸盐（SO42?）去除效率（%）。
*1 E?3中乙酸是一种易于吸收的挥发性脂肪酸（VFA），它可以转化为乙酰辅酶A（Acetyl-CoA），随后进入三羧酸循环（TCA cycle），从而快速合成能量和生物质（Patel等人，2022年）。在光照充足的条件下，这种兼性生长模式结合了光自养和乙酸同化作用，通常能显著提高生物质产量，并比纯自养生长更快地去除废水中的化学需氧量（COD）（Zhang等人，2021年）。在Scenedesmus sp.的实验E-1和E-2中观察到这一现象，其中废水中的乙酸被完全去除。因此，乙酸作为一种高能量的碳源，对基于微藻的啤酒厂废水处理具有重要的经济和环境效益。相比之下，在Chlorella sp.中乙酸未被去除，但85%的总有机碳（TOC）被去除，这表明了藻类与细菌之间的强大共生关系。Chlorella sp.主要负责产生氧气并可能去除营养物质（氮/磷）。同时，本土细菌承担了大部分有机碳的降解工作（COD/TOC），由于动力学、pH值或底物偏好的限制，乙酸未被充分利用。

3.3.2. 氮的去除
在五种实验条件下，Spirulina sp. LEB 52的氮去除效率最高，达到78%（p > 0.05）。其次是Chlorella sp.和Scenedesmus sp.，分别在E-5和E-2中的氮去除率为69%和68%（图2）。所有菌株在E-5中表现出更好的氮去除效果，可能是由于废水中初始的TOC和BOD5浓度较低（表1）。较低的有机负荷减少了可供本土异养细菌利用的碳，从而显著减轻了它们对有限溶解性营养物质（氮和磷）的竞争，使微藻能够捕获更多的氮（Su等人，2022年）。
相比之下，E-1中的氮去除率低于E-2（Scenedesmus sp.为67%，而Chlorella sp.为42%），这可能是由于细菌之间的竞争（Su等人，2022年）。两种菌株在两种废水中的VSS（挥发性悬浮固体）增长相似；因此，氮去除率的显著差异很可能是因为E-1中的BOD5浓度（3426 mg O2/L）高于E-2（1024 mg O2/L）。较高的有机碳负荷可能有利于异养细菌的生长，加剧了它们与Scenedesmus sp.之间的竞争，从而导致氮的去除率降低。
对于Chlorella sp.，在E-2中的VSS增加量明显高于E-1（p < 0.05）。这种VSS的增加可能是由于细菌生物量的增加和/或微藻产生的胞外多糖（EPS）的积累（Perera等人，2022年）。这支持了E-2中氮去除率较高的观点，因为它与总生物量的增加直接相关。这与He等人（2022年）的研究结果一致，他们发现没有微藻的对照组废水中氮的去除率明显较低（34%），而添加微藻后氮的去除率提高了69%。尽管总体生物质产量相对较低，Spirulina sp. LEB 52仍实现了最高的氮去除效率。这一现象表明生物质积累速率和营养物质清除速率之间存在解耦，这受特定代谢和物理化学因素的影响。高氮去除率可能归因于微藻对氮的奢侈吸收，即Spirulina sp.迅速吸收并储存溶解态氮化合物（NH4+和NO3-）在细胞储备中，超出了其即时生长需求（Markou等人，2014年）。相反，在E-1和E-2中培养的Spirulina sp. LEB 52表现为氮的释放（分别释放了20%和24%）。由于几乎没有生长或几乎没有可见的生长，这种释放可能是由于细胞碎片和细菌过度生长，导致有机氮代谢物（如氨基酸、中间体和维生素）释放到培养基中（Perera等人，2022年）。

总体而言，与其他啤酒厂废水处理研究相比，本文报告的氮去除率与文献中报道的Scenedesmus sp.和Chlorella sp.约80%的去除率以及Spirulina sp.约70%的去除率一致（A. Ferreira等人，2017年；Han等人，2021年；Song等人，2020年）。
在Chlorella sp.的培养物中，硝酸盐（NO3-）的去除率最高，达到100%，显示出高效的硝酸盐同化能力。其次是Spirulina sp. LEB 52，在五种废水中的平均硝酸盐去除率为82%。Scenedesmus sp.的硝酸盐去除能力最低，仅在E-3、E-4和E-5中表现较好（分别为58%、46%和79%），而在E-1和E-2中仅为26%和1%。五种废水中的初始硝酸盐浓度在3至13 mg/L之间，这种较低的硝酸盐浓度有利于微藻的最佳生长（Peng等人，2025年）。Chlorella sp.100%的硝酸盐去除率显著高于He等人（2022年）报道的C. sorokiniana在啤酒厂废水中的21%去除率。硝酸盐的去除趋势与氮类似，但在Spirulina sp. LEB 52中则相反，尽管整体氮含量增加，硝酸盐去除率仍然很高（Su等人，2022年）。
在筛选实验中观察到的100%氨（NH4+）去除率不能完全归因于微藻的生长，因为实验过程中没有控制pH值。NH4+去除率的差异可能是由于微藻在生长初期的吸收作用，以及实验结束时pH值过高（三种微藻在五种废水中的pH值均超过9）导致的氨释放（Alavianghavanini等人，2024年）。然而，微藻和细菌的生物同化可能是主要的NH4+去除途径，而氨的释放可能是次要过程，因为实验设置缺乏曝气，因此只有被动的气体交换发生。在E-1和E-2中培养的Spirulina sp. LEB 52中，氨的净释放表明即使在pH值较高的情况下，细胞裂解和氮的释放也超过了氨的去除过程。

3.3.3. 磷酸盐和硫酸盐的去除
磷酸盐（PO43-）和硫酸盐（SO42-）的去除情况是根据废水的化学性质以及在高pH条件下由生物同化和物理化学沉淀作用来评估的。
所有废水中的初始Ca2+浓度保持不变，但不同的SO42-浓度影响了PO43-的去除机制。在高硫酸盐含量的废水中（E-1，0.64 mM SO42-），PO43-的去除主要是生物性的：Scenedesmus sp.通过高效同化实现了100%的去除，而Chlorella sp.则释放了18%的PO43-，这表明发生了细胞裂解（Kiani等人，2023年；Vo等人，2022年）。相反，在低硫酸盐含量的废水中（E-2，0.03 mM SO42-），化学沉淀可能是主要去除机制。在这里，较低的SO42-浓度和较高的pH值促进了Ca3(PO4)2的沉淀。因此，Scenedesmus sp.实现了100%的去除，这是由于沉淀和生物吸收的共同作用，因为其生物质产量与E-1中的相当。对于Spirulina sp. LEB 52，在E-3和E-5中的PO43-去除率（分别为77%和62%）与其最高的VSS产量（0.70 mg/L和0.69 mg/L）相关，证实了PO43-的吸收与生物质生产有关，并且氮的限制较少（氮/磷比分别为9:1和7:1，而E-4中为6:1）（Lim等人，2021年）。相反，在E-1和E-2中，Spirulina sp. LEB 52的PO43-释放表明了菌种的衰减和代谢产物的泄漏。
SO42-的去除主要是特定菌种的生物过程，因为SO42-对蛋白质合成至关重要（Liu等人，2022年）。Scenedesmus sp.和Spirulina sp. LEB 52都显示出与生长相关的SO42-去除率，其中E-3和E-5中的去除率最高（分别为62%和50%）。这种相关性证实了成功的微藻-细菌生物质积累促进了SO42-的吸收。相反，Chlorella sp.在所有废水中的SO42-去除率几乎可以忽略不计（图2），表明该菌种的代谢途径独特或吸收动力学受到严重限制。
这些结果表明，不同微藻物种对不同化学组成的废水有不同的响应。不同的微藻物种在吸收氮、磷酸盐、硫酸盐和碳方面具有不同的能力，从而导致生物质产量和废水处理的差异。Scenedesmus sp.是最耐受性的微藻物种之一，具有较高的生物质产量和从残渣中去除营养物质的能力（Han等人，2021年；Song等人，2020年；Yirgu等人，2023年）。在本研究中，当使用以Scenedesmus sp.为主的微藻-细菌共生体处理时，E-2表现出最佳的营养物质去除效果。这些结果很有前景，因为E-2是啤酒厂废水处理过程的第二步；因此，减少总碳所需的步骤可以减少到一个步骤。
为了评估替代传统生物处理的可行性，比较了Scenedesmus sp.在E-2中实现的废水质量与厌氧后（E-3）和好氧后（E-4）的处理效果，以及巴塞罗那大都会区的排放标准（àrea Metropolitana de Barcelona，2019年）。7天后的COD为309 ± 3 mg/L，比初始的E-2值（3087 mg/L）降低了90%，并且低于E-3（495 ± 100 mg/L）和E-4（419 ± 13 mg/L），都在1500 mg/L的排放标准之内。TOC达到178.5 ± 17.7 mg/L，低于450 mg/L的接受阈值。TN（14.2 ± 0.03 mg/L）、NH4+（0 mg/L）和PO43-（0 mg/L）都达到了或超过了传统处理顺序所实现的去除水平。这些结果证明了Scenedesmus sp.–E-2共生体能够在单一步骤中实现与连续厌氧和好氧生物处理阶段相当或更高的废水质量。

3.4. 微藻-细菌相互作用和实际考虑
Scenedesmus sp.携带一种保守的、特定于菌株的微生物组，这种微生物组与藻类接种物一起引入，并与本土废水细菌竞争溶解有机碳和无机营养物质（Astafyeva等人，2022年；Krohn等人，2022年）。在批次条件下，这种竞争性相互作用可能在7天的实验设置中为接种的共生体提供了选择优势，特别是在E-1和E-2中，较高的乙酸和BOD5浓度为接种的和本土的微生物群落提供了丰富的有机底物。不同藻株之间表现的差异表明，Scenedesmus sp.在E-1和E-2中建立了代谢高效的共生体，而Chlorella sp.和Spirulina sp. LEB 52的表现明显不同。这种模式强烈表明，在高有机负荷下，特定菌株的微生物组组成是决定群落形成的主要因素。由光合作用驱动的pH值在所有处理中都超过了9，这可能逐步抑制了原始啤酒厂废水中丰富的耐酸和中性异养菌类，而有利于更适应微藻生长的喜碱细菌（Qi等人，2021年）。在这种pH值驱动的群落变化中，存活下来的细菌更有可能参与微藻-细菌的互利共生关系，其中细菌利用微藻产生的O2氧化有机碳，并释放矿物质营养物质和CO2，这些物质被循环利用以支持光合作用（He等人，2022年）。批次操作本身限制了群落的表征：接种、竞争性取代、pH值驱动的选择和营养物质消耗同时发生，无法通过时间分辨的谱型分析分离。只有在连续或半连续操作下达到准稳态时，才能实现稳定的群落组成，这对于未来的研究至关重要，因为它允许使用16S rRNA扩增子和qPCR定量细菌与藻类的比例。
这里生成的批次筛选数据代表了接近最佳、非限制条件下的上限估计值，而不是连续操作下的稳态值，在连续操作中，进水组成的波动、水力停留时间和长期的微生物群落动态会影响性能。在实际操作的啤酒厂环境中，微生物群落必须持续数周到数月来处理废水，而不仅仅是7天的时间。尽管如此，批次筛选作为一种方法学工具，在投资于试点规模基础设施之前，能够快速识别最有前景的菌株-废水组合。基于此，逻辑上的下一步是在半连续光生物反应器中操作Scenedesmus sp.–E-2共生体，控制水力停留时间并定期更换废水。这样的配置将提供停留时间分布数据、长期去除一致性和生物质产量数据，这对于评估可扩展性和指导全规模过程设计至关重要。
在扩大规模之前，必须解决多个工程和操作挑战。由于微藻细胞体积小（约10 μm）和易于形成悬浮液，生物质收获是一个能源密集型过程；Scenedesmus sp.培养物中观察到的聚集体形成是一个有利于该菌株的特性，可以降低分离成本，尽管E-1和E-2中的高有机负荷增加了膜污染的风险。光线的穿透受到原始废水高浊度（E?1和E?2中浊度为193–272 NTU）的限制，而且大规模使用人工照明会带来资本和运营成本。重要的是，数据显示，限制生物量产生的因素是营养负荷而非光照强度，这表明在低于实验条件（78 μmol/m2/s）的光照强度下仍可实现有效处理，对能源需求具有积极影响。替代厌氧处理步骤会带来能源上的权衡：啤酒厂的现场沼气生产将无法进行。然而，对收获的微藻生物质进行后续厌氧消化可以在一定程度上抵消这一影响。运营稳定性仍然是最关键的问题：啤酒厂废水的成分在不同批次和季节间存在显著差异，为期7天的批次处理格式无法反映在持续有机负荷、温度波动或微生物群落变化情况下的长期表现。这些挑战在基于微藻的废水处理系统中已被充分记录，并不否定数据的概念验证价值；相反，它们定义了在试点规模下可以严格评估技术和经济可行性的条件，主要是连续反应器的运行。

**4. 结论**
本研究旨在确定在不同啤酒厂废水中具有最高营养去除效率的最佳菌株。Scenedesmus sp.在预酸化处理后及厌氧处理前表现出最高的生物量生成能力，生物量增加了0.93 g/L，并分别实现了PO43?、TOC和TN最高90%、81%和67%的去除率。Scenedesmus sp.被公认为能够耐受多种培养基成分，并且是一种生长迅速的菌种，能够适应不利条件。本研究表明，微藻-细菌联合物体在啤酒厂废水处理中具有替代传统生物处理的潜力。这种策略不仅降低了成本和环境影响，还将废物转化为有用的生物质，显著促进了循环生物经济的发展。

**作者贡献声明**
Belén Villarreal-Toribio：写作——审稿与编辑、写作——初稿编写、可视化、方法学、调查、数据分析、概念化。
Luisa Barbonaglia：调查、数据分析。
Vincenzo Andrea Riggio：写作——审稿与编辑、概念化。
Etiele Greque de Morais：写作——审稿与编辑、监督、方法学、资金筹集、概念化。
Enrica Uggetti：写作——审稿与编辑、监督、项目管理、方法学、资金筹集、概念化。

**伦理声明**
本研究包含原创性工作，不涉及任何人类或动物权益。