细胞外基质的粘弹性调节树突状细胞的迁移与免疫应答的启动

《Advanced Materials》：Matrix Viscoelasticity Regulates Dendritic Cell Migration and Immune Priming

　　**摘要**

肿瘤微环境通过其机械特性影响免疫监视，然而基质黏弹性在其中的作用仍不明确。在这里，我们使用了一种可调节的胶原蛋白系统来模拟人类组织的黏弹性，以探讨基质松弛如何指导树突状细胞（DC）的行为。缓慢松弛的弹性网络限制了肌动蛋白驱动的重塑过程，降低了DC的迁移能力，从而减少了DC与T细胞的接触和激活。在快速松弛的基质中阻断DC的迁移，再现了在弹性网络中观察到的T细胞活化障碍的关键特征，表明迁移是免疫激活的一个机械性关键点。在弹性基质中长时间的限制诱导了一种机械记忆状态，使DC处于活动能力降低和染色质可及性改变的状态。使用 patient-derived 小脑胶质瘤样本的研究证实了这些发现，确立了黏弹性松弛作为免疫激活的关键物理调节因子。这种可调节的黏弹性平台为分析和模拟免疫的机械控制提供了一个与人类情况相关的模型。

**1 引言**

尽管肿瘤中存在浸润的淋巴细胞，T细胞常常无法控制肿瘤的生长和转移[1-3]。这种失败不仅反映了肿瘤本身的抗性机制，还体现了肿瘤微环境（TME）提供的活化和支持不足[4, 5]。树突状细胞（DC）是抗肿瘤免疫的核心调节器，它们连接了先天识别和适应性T细胞反应[6, 7]。然而，在肿瘤和纤维化组织中，DC的功能往往受损，这限制了它们引发有效T细胞反应的能力[8-10]。有效的T细胞活化需要DC穿过致密的间质、重塑细胞外基质（ECM）并与T细胞建立联系[11-16]。当这些过程受损时，T细胞无法产生强烈的效应响应，进而导致许多实体瘤典型的免疫监视不足。TME是一个复杂的微环境，其中生化性和物理性线索共同塑造免疫反应[17-23]。ECM的物理特性，包括硬度、结构和黏弹性，已被证明是细胞行为的强大调节因素[24-32]。其中，黏弹性——对变形的时变响应——仍然研究不足，尽管其变化是纤维化和肿瘤相关基质的一个显著特征。在纤维化疾病和癌症中，黏弹性的改变会导致基质弹性增加和应力松弛时间延长[33-38]，这些特征与免疫浸润减少和免疫“冷”表型相关[39, 40]。机械线索还可以通过表观遗传重塑留下持久的影响，即“机械记忆”[41-43]。最近的研究表明，黏弹性可以通过增强成纤维细胞的可塑性[44]或稳定地印刻T细胞中的基因表达程序[45]来促进机械记忆。目前尚不清楚对于抗肿瘤免疫至关重要的DC的迁移和T细胞活化是否也受到类似的调控。在体内解析这些效应具有挑战性，因为机械、结构和炎症变量紧密相关，这突显了需要定义明确的人类基础培养系统来分离黏弹性的影响。在这里，我们开发了一种基于胶原蛋白的可调节平台，该平台可以模拟人类组织的黏弹性，并实现应力松弛和硬度的独立控制[45]。I型胶原蛋白是肿瘤和纤维化间质中的主要ECM成分[46, 47]，为探究免疫的机械调节提供了一个生理相关的支架。这一与人类情况相关的模型捕捉了组织力学的关键特征，同时允许在定义的机械条件下进行受控的共培养和活体成像，以研究DC与T细胞之间的相互作用。利用该系统，我们证明缓慢松弛、更具弹性的基质在机械上限制了DC的活动，减少了肌动蛋白驱动的重塑、迁移以及DC与T细胞的接触，从而降低了T细胞的活化及随后的肿瘤细胞杀伤。在快速松弛的凝胶中阻断DC的迁移再现了T细胞活化障碍的现象，表明迁移是关键的机械控制点。长时间的限制诱导了一种机械记忆状态，其特征是持续的迁移缺陷和染色质可及性的改变。结合使用patient-derived 小脑胶质瘤样本的研究结果，这些发现确立了黏弹性松弛作为免疫活化关键物理调节因子的地位，并建立了一个用于模拟实体瘤中免疫机械控制的可调节胶原蛋白平台。

**2 结果**

**2.1 基质黏弹性控制DC迁移和基因表达**

为了研究基质黏弹性如何调节DC的行为，我们设计了可以独立调节应力松弛的胶原蛋白网络。胶原蛋白经过norbornene功能化处理，通过与甲基四嗪-(PEG)5-甲基四嗪（双价MeTz）交联剂的逆电子需求Diels-Alder反应实现位点特异性交联（图1a）[45]。这种凝胶化后的交联策略允许在已建立的基质内调节应力松弛，而不改变初始的凝胶化过程或基质的微观结构。共聚焦成像显示平均孔径为3.1 μm，在非交联（Fast R）和交联（Slow R）凝胶之间没有差异（图1b）。相应的结构分析也显示Fast R和Slow R基质之间的胶原纤维直径或纤维一致性（衡量各向异性纤维组织）没有显著差异（图S1a,b）。此外，凝胶表面的DC扩散动力学在两种条件下相似（图S1c,d），表明最初的细胞-基质相互作用未受到交联策略的影响。流变测量显示，交联将2 mg/mL胶原凝胶的应力松弛时间从72秒延长到1252秒，同时存储模量保持不变（图1c,d）。交联凝胶的损耗角也减小，表明网络更具弹性（图1e）。在更高胶原浓度（4 mg/mL）的凝胶中也观察到了类似的时间延长现象，存储模量没有改变（图S2a-c）。因此，该系统允许独立调节黏弹性，同时保持硬度和微观结构。接下来我们探讨了黏弹性是否影响DC的迁移。从外周血单核细胞（PBMCs）中分离出的人类单核细胞衍生DC，在TNF-α的作用下水化后，将其封装在2 mg/mL Fast R或Slow R凝胶中（图1f,g）。延时成像显示，Slow R凝胶中的DC迁移轨迹受限，与Fast R凝胶中的细胞相比。均值平方位移（MSD）分析显示Slow R凝胶中的细胞位移显著减少（图1h）。同样，在更高浓度凝胶（4 mg/mL）中封装的DC在Slow R条件下的迁移也受到限制（图S2d,e）。

**2.2 基质黏弹性调节DC介导的T细胞活化**

为了研究基质黏弹性如何调节DC的行为，我们设计了可以独立调节应力松弛的胶原蛋白网络。胶原蛋白通过norbornene功能化处理，通过与甲基四嗪-(PEG)5-甲基四嗪（双价MeTz）交联剂的逆电子需求Diels-Alder反应实现特异性交联（图1a）[45]。这种凝胶化后的交联策略允许在已建立的基质内调节应力松弛，而不改变初始的凝胶化过程或基质的微观结构。共聚焦成像显示平均孔径为3.1 μm，在非交联（Fast R）和交联（Slow R）凝胶之间没有差异（图1b）。结构分析显示Fast R和Slow R基质之间的胶原纤维直径或纤维一致性（衡量各向异性纤维组织）没有显著差异（图S1a,b）。此外，DC在凝胶表面的扩散动力学在两种条件下相似（图S1c,d），表明初始的细胞-基质相互作用未受到交联策略的影响。流变测量显示，交联将2 mg/mL胶原凝胶的应力松弛时间从72秒延长到1252秒，同时存储模量保持不变（图1c,d）。交联凝胶的损耗角减小，表明网络更具弹性（图1e）。在更高胶原浓度（4 mg/mL）的凝胶中也观察到了类似的松弛时间延长现象，存储模量没有变化（图S2a-c）。因此，该系统允许独立调节黏弹性，同时保持硬度和微观结构。接下来我们探讨了黏弹性是否影响DC的迁移。从外周血单核细胞（PBMCs）中分离出的人类单核细胞衍生DC，在TNF-α的作用下水化后，将其封装在2 mg/mL Fast R或Slow R凝胶中（图1f,g）。延时成像显示，Slow R凝胶中的DC迁移轨迹受限，与Fast R凝胶中的细胞相比。均值平方位移（MSD）分析显示Slow R凝胶中的细胞位移显著减少（图1h）。同样，在更高浓度凝胶（4 mg/mL）中封装的DC在Slow R条件下的迁移也受到限制（图S2d,e）。

**2.3 基质黏弹性控制DC迁移和基因表达**

为了研究基质黏弹性如何调节DC的行为，我们设计了可以独立调节应力松弛的胶原蛋白网络。胶原蛋白经过norbornene功能化处理，通过与甲基四嗪-(PEG)5-甲基四嗪（双价MeTz）交联剂的逆电子需求Diels-Alder反应实现位点特异性交联（图1a）[45]。这种凝胶化后的交联策略允许在已建立的基质内调节应力松弛，而不改变初始的凝胶化过程或基质的微观结构。共聚焦成像显示平均孔径为3.1 μm，在非交联（Fast R）和交联（Slow R）凝胶之间没有差异（图1b）。此外，结构分析显示Fast R和Slow R基质之间的胶原纤维直径或纤维一致性（衡量各向异性纤维组织）没有显著差异（图S1a,b）。凝胶表面上的DC扩散动力学在两种条件下也相似（图S1c,d），表明初始的细胞-基质相互作用未受到交联策略的影响。流变测量显示，交联将2 mg/mL胶原凝胶的应力松弛时间从72秒延长到1252秒，同时存储模量保持不变（图1c,d）。交联凝胶的损耗角减小，表明网络更具弹性（图1e）。在更高胶原浓度（4 mg/mL）的凝胶中也观察到了类似的松弛时间延长现象（图S2a-c）。因此，该系统允许独立调节黏弹性，同时保持硬度和微观结构。接下来我们探讨了黏弹性是否影响DC的迁移。从外周血单核细胞（PBMCs）中分离出的人类单核细胞衍生DC，在TNF-α的作用下水化后，将其封装在2 mg/mL Fast R或Slow R凝胶中（图1f,g）。延时成像显示，Slow R凝胶中的DC迁移轨迹受限，与Fast R凝胶中的细胞相比。均值平方位移（MSD）分析显示Slow R凝胶中的细胞位移显著减少（图1h）。同样，在更高浓度凝胶（4 mg/mL）中封装的DC在Slow R条件下的迁移也受到限制（图S2d,e）。

**2.4 可调节的胶原蛋白黏弹性调节DC介导的T细胞活化**

接下来，我们使用黏弹性胶原蛋白模型来测试应力松弛是否影响人类DC激活T细胞的能力。DC先与SK-MEL-5黑色素瘤裂解物接触，然后通过TNF-α激活。自体人类pan-T细胞随后与DC共同封装在Fast R或Slow R凝胶中培养12天（图3a）。Fast R凝胶中的T细胞增殖更强，CD4+和CD8+亚群的增长都比Slow R凝胶中的更为显著（图3b,c）。在Fast R凝胶中，更多的CD4+ T细胞表达了活化标志物CD25和OX40（图3c–e）。同样，在Fast R凝胶中，更多的CD8+ T细胞表达了CD25和PD-1（图3f,g），表明在缓慢松弛的ECM中DC对CD4+和CD8+亚群的活化效果较差。为了验证这些差异是否直接由ECM黏弹性引起，我们将T细胞单独封装在Fast R或Slow R凝胶中（图S4a）。CD4+和CD8+ T细胞的增殖在两种条件下相当，CD25的表达也相似，并且低于有DC存在时的水平（图S4b,c）。这些发现表明，粘弹性对T细胞激活的影响主要是通过树突状细胞（DCs）介导的。图3 在图查看器中打开 PowerPoint。

ECM的粘弹性会损害DC介导的T细胞启动，降低T细胞激活，并限制癌细胞的杀伤。 (a) 树突状细胞和最初未活化的T细胞被封装在2 mg/mL的Fast R或Slow R水凝胶中的示意图和时间线。在第0天，树突状细胞用SK-MEL5黑色素瘤裂解物脉冲处理，并用TNF-α激活。第1天，树突状细胞与未活化的T细胞共同封装，持续12天。 (b) 通过测量共培养12天后远红染料的信号减少来量化增殖的CD4+和CD8+ T细胞。P值使用双尾Wilcoxon配对符号秩检验确定（n = 6）。 (c) 代表性流式细胞术图表显示Fast R中的CD25+ CD4+ T细胞更多且增殖更强（远红信号）。 (d, e) 量化CD25+或OX40+ CD4+ T细胞，作为激活的标志。P值使用双尾Wilcoxon配对符号秩检验确定（n = 6）。 (f) 代表性流式细胞术图表显示Fast R中的CD25+ CD8+ T细胞更多且增殖更强（远红信号）。 (g, h) 量化CD25+或PD-1+ CD8+ T细胞作为激活的标志。P值对于CD25使用双尾Wilcoxon配对符号秩检验，对于PD-1使用双尾配对t检验确定（n = 6）。 (i) 树突状细胞与最初未活化的T细胞在Fast R或Slow R矩阵中共封装12天的示意图和时间线；在第6天，将插入物转移到含有SK-MEL5黑色素瘤细胞的孔中。 (j) Fast R和Slow R水凝胶中12天后CD8+ T细胞亚群的代表性流式细胞术图表。 (k) 通过CD45RA和CCR7表达定义的凝胶内CD8+ T细胞亚群在培养12后的量化（Na?ve/SCM：CCR7+CD45RA+；TCM：CCR7+CD45RA?；TEM：CCR7?CD45RA?；TEMRA：CCR7?CD45RA+）。P值使用双因素重复测量ANOVA确定（n = 6个供体，每个条件都进行测量），然后使用?ídák的多重比较检验来评估Fast R和Slow R之间的差异。 (l) 与黑色素瘤细胞共培养7天后迁移到底部腔室的CD3+ T细胞的量化。 (m, n) 通过跨孔迁移后表达CD25的CD4+和CD8+ T细胞的量化。 (o) 与T细胞共培养7天后黑色素瘤细胞的存活率。线条连接Fast R和Slow R组中相同供体的配对数据点。l的P值使用双尾Wilcoxon配对符号秩检验确定，m–o的P值使用双尾配对t检验确定（l,o为n = 6；m,n为n = 5）。为了进一步研究肿瘤相关环境中的T细胞功能，我们在模型中加入了癌细胞部分。DC-T细胞共培养物再次被封装在可调粘弹性胶原蛋白凝胶中，然后放置到跨孔中（3 μm孔径）。5天后，将插入物转移到底部腔室含有SK-MEL5细胞的孔中，并再培养7天，允许激活的T细胞迁移并与肿瘤细胞结合（图3i）。流式细胞术分析显示，与Fast R凝胶中的T细胞相比，Slow R凝胶中的CD8+ T细胞保留了更多的幼稚表型（CD45RA+CCR7+）和较少的效应记忆表型（CD45RA?CCR7?）（图3j,k）。与Fast R凝胶中的T细胞相比，从Slow R凝胶中迁移到肿瘤细胞腔室的T细胞更少（图3l）。在Slow R条件下迁移的T细胞中，显著较少的CD4+和CD8+ T细胞被激活（图3m,n），这与这种情况下肿瘤细胞杀伤减少相关（图3o）。在更高密度的矩阵（4 mg/mL）中也观察到了类似的趋势，其中缓慢松弛的条件导致T细胞增殖和激活减少，幼稚T细胞的比例增加，以及T细胞介导的肿瘤细胞杀伤减少（图S5）。为了评估这些效应是否是T细胞本身的特性，我们将T细胞单独封装在跨孔系统中。在这种情况下，所有四个T细胞亚群在不同条件下的表现相当（图S6a,b），迁移的T细胞数量、激活状态和肿瘤细胞存活率也相似（图S6c-f）。总之，这些发现表明更弹性的ECM降低了DC激活T细胞的能力，从而限制了T细胞的迁移和细胞毒性。为了确定缓慢松弛矩阵中增加的炎症细胞因子是否导致T细胞启动受损，我们在DC-T细胞共培养期间添加了针对IL-1β和IL-6的中和抗体（图S7a）。尽管在缓慢松弛条件下这些细胞因子的分泌增加，但中和这些细胞因子并没有恢复T细胞的增殖或激活（图S7b,c）。这些发现表明，缓慢松弛矩阵中IL-1β和IL-6水平的增加不足以解释T细胞启动受损的现象。接下来，我们测试了启动受损是否反映了DC激活的变化。在封装3天后，共刺激分子和抗原呈递分子在不同条件下的表达保持相当（图S8），表明DC的激活状态并未受到矩阵粘弹性的显著影响。然后，我们检查了DC-T细胞相互作用减弱是否是T细胞启动减少的原因。SK-MEL-5脉冲处理的DC和自体T细胞被封装在Fast R或Slow R凝胶中，并通过时间延迟显微镜成像（图S9a）。DC-T细胞相互作用在Fast R凝胶中始终更为频繁（图S9b,c）。与早期的发现一致，DC在Slow R凝胶中的运动能力显著降低（图S9d-f），而T细胞的迁移在共培养（图S9g–i）和单独封装时（图S10）保持不变。总之，这些结果表明，缓慢松弛的ECM中DC运动能力的降低限制了DC-T细胞相遇的频率，从而损害了有效的T细胞启动。

2.3 粘弹性限制导致DC迁移和染色质可及性的持久变化

接下来，我们研究了在可调胶原蛋白模型中长时间暴露于不同粘弹性环境是否会导致DC迁移的持续变化。DC在Fast R或Slow R凝胶中条件化处理1天、2天或3天，然后重新封装在Fast R凝胶中（图4a）。条件化处理1天的DC在转移后迁移没有差异（图4b,c）。在2天时点，预先暴露于Slow R的DC迁移减少，在转移后立即不显著，但在第2天变得显著（图4d,e），表明出现了机械记忆表型。到第3天，这种效应进一步增强，预先暴露于Slow R的DC表现出持续的运动能力降低，并在转移后最多持续3天（图4f,g）。为了探究这些变化的原因，DC再次在Fast R或Slow R凝胶中条件化处理3天，然后进行ATAC-seq分析（图4h）。转录起始位点（TSSs）周围的总体可及性在不同条件间相当（图S11）。然而，分析显示，在Slow R凝胶中，与机械感应相关的基因（包括WWTR1（TAZ）和WASF1，后者是Arp2/3介导的肌动蛋白成核的正调节因子[50]）的可及性降低（图4j）。这些结果表明，长时间暴露于缓慢松弛的ECM会导致染色质可及性的稳定变化，从而损害DC的机械感应和迁移，即使从缓慢松弛的矩阵中移除后也是如此。为了评估这些机械敏感基因的功能贡献，我们进行了WASF1的siRNA介导的敲低，通过免疫染色确认了有效的减少（图S12a-c）。DC在Fast R或Slow R矩阵中条件化处理3天，然后重新封装在Fast R凝胶中并立即成像。WASF1的敲低减少了Fast R条件化细胞的迁移，并减少了Fast R条件和Slow R条件化细胞之间的差异（图S12d-f），表明WASF1参与了DC迁移的机械调节。图4 在图查看器中打开 PowerPoint。

ECM的弹性导致DC迁移和机械感应通路可及性的持久变化。（a）重新封装实验的实验时间线示意图。DC首先在Fast R或Slow R中条件化处理1天或3天，然后进行胶原蛋白消化并重新封装在Fast R中。对于1天的条件化处理，迁移评估在封装后2小时或1天进行成像。对于2天的条件化处理，迁移评估在封装后2小时或2天进行成像。对于3天的条件化处理，迁移评估在封装后2小时或3天进行成像。（b-e）时间随MSD的变化以及分别在Fast R或Slow R中条件化处理1天（b,c）、2天（d,e）或3天（f,g）并重新封装在Fast R后的60分钟MSD的量化，显示了60分钟时的MSD值。数据来自三个独立的供体；线条连接同一供体的配对值。P值使用双因素重复测量ANOVA和未校正的Fisher's LSD确定（n = 3个供体，每个条件都进行测量）。(h) ATAC-seq分析的实验时间线示意图。DC在2 mg/mL的Fast R或Slow R水凝胶中封装3天，然后进行胶原蛋白消化和测序库的准备。（i）Fast R和Slow R条件下差异可及区域的火山图。与机械感应通路相关的基因用红色突出显示。（j）WWTR1和WASF1的代表性基因可及性轨迹。红色箭头表示在Slow R中的可及性降低。基因可及性上方的框表示启动子、外显子和内含子区域；箭头表示转录方向。覆盖轨迹的y轴范围从0到500个读取。

2.4 粘弹性胶原蛋白中的DC迁移需要肌动蛋白-肌球蛋白的收缩性和胶原蛋白的重塑

鉴于ATAC-seq鉴定出的与肌动蛋白-肌球蛋白相关基因的染色质可及性降低，我们接下来研究了在可调胶原蛋白模型中肌动蛋白-肌球蛋白收缩性和基质重塑在DC迁移中的功能作用。首先用对氨基-blebbistatin（一种肌球蛋白II抑制剂）或Y-27632（一种ROCK抑制剂）处理DC。这两种处理在Fast R凝胶中显著减少了MSD，但在Slow R凝胶中影响不大（图5a-c）。同样，用defactinib抑制焦点粘附激酶或用latrunculin A抑制肌动蛋白聚合也显著降低了Fast R凝胶中的DC迁移（图5d-f），支持了肌动蛋白收缩性在允许粘弹性环境中的迁移中的重要性。然而，之前与单核细胞向DC分化中的机械感应相关的PI3K的抑制并未影响DC迁移（图S13），进一步支持了肌动蛋白收缩性的主导作用。图5 在图查看器中打开 PowerPoint。

DC迁移依赖于通过肌动蛋白-肌球蛋白收缩性的胶原蛋白重塑。（a）用DMSO（对照）、pa-blebbistatin或Y-27632处理并在2 mg/mL的Fast R或Slow R凝胶中封装60分钟的DC的代表性轨迹。（b, c）随时间变化的DC MSD量化，以及60分钟时对应供体样本的MSD值；线条连接同一供体的值。（d）用DMSO（对照）、defactinib或latrunculin A处理并在2 mg/mL的Fast R或Slow R凝胶中封装60分钟的DC的代表性轨迹。（e, f）随时间变化的DC MSD量化，以及60分钟时对应供体样本的MSD值；线条连接同一供体的值。c, f的P值使用双因素重复测量ANOVA和未校正的Fisher's LSD确定，以粘弹性和处理为因素，每个供体在所有条件下进行测量（c为n = 3；f为n = 5）。(g–j) 在2 mg/mL的Fast R或Slow R凝胶中封装并用DMSO（对照）或para-blebbistatin处理的DC的时间延迟图像。细胞核和肌动蛋白分别用SiR-DNA（洋红色）和LifeAct（绿色）标记，胶原蛋白纤维用Tetrazine-iFluor 488标记。显示了DC在0分钟和10分钟时的胶原蛋白重塑，红色箭头表示显著的重塑。比例尺为10 μm。（k）DC介导的胶原蛋白位移的代表性PIV图，DC位于中心。位移根据0 μm（蓝色）到10 μm（黄色）进行颜色编码。虚线红色箭头指示最显著位移的方向，用于l中的量化。（l）量化四种条件下最显著重塑方向的胶原蛋白位移（每个条件n = 9–10）。接下来，我们研究了DC与周围ECM的相互作用。为了确定DC介导的基质降解是否是粘弹性凝胶中迁移所必需的，用广谱MMP抑制剂（GM6001，marimastat）处理细胞。然而，这些因素对MSD没有影响（图S14），表明早期DC的迁移在很大程度上不依赖于MMP。然后通过时间延迟共聚焦成像技术追踪DCs变形周围胶原蛋白的能力。在Fast R凝胶中，DCs产生了显著的胶原蛋白位移，而在Slow R凝胶中这种现象基本上不存在（图5g,h；电影S1和S2）。用对氨基-blebbistatin抑制myosin II会消除Fast R凝胶中的胶原蛋白重塑现象，这与Slow R基质中的DCs行为相似（图5i,j；电影S3和S4）。定量粒子图像测速技术显示，在Fast R凝胶中，从细胞体延伸超过35 μm的区域有广泛的定向胶原蛋白重塑，而在Slow R凝胶或在对氨基-blebbistatin处理下，重塑现象很有限（图5k,l）。这些结果共同表明，在快速松弛的ECM中，DC的迁移是由肌动蛋白-肌球蛋白依赖的收缩力驱动的，并需要活跃的胶原蛋白重塑；而在缓慢松弛的凝胶中，基质的可变形性降低可能限制了胶原蛋白的重塑和DC的移动性。

2.5 在粘弹性胶原蛋白模型中限制DC迁移会减少T细胞的激活

为了测试Slow R凝胶中T细胞激活减少是否直接归因于DC迁移受到阻碍，我们使用生物正交点击连接策略改造了DCs以使其迁移停止。通过NHS化学方法将MethylTetrazine-PEG4（MeTz）功能化到DC表面，生成了能够与Fast R中的norbornene修饰胶原蛋白共价结合的MeTzDCs。结合的MeTz主要局限于细胞表面（图6a,b）。在2 mg/mL的胶原蛋白中（胶原蛋白未经过norbornene修饰），MeTzDCs的迁移与未修饰的DCs相当（图S15），表明MeTz的结合本身并不改变DC的移动性。相比之下，将MeTzDCs封装在Fast R中会导致其迁移轨迹受限且MSD减少（图6c,d），这与Slow R凝胶中的迁移停止一致。为了直接测试限制DC迁移是否会影响T细胞的激活，将MeTzDCs或对照DC与自体T细胞共同培养3天，这个时间选择是基于MeTz在DC表面的保留时间（图S16）。流式细胞术显示，由MeTzDCs激活的CD25+ CD4+ T细胞显著减少，表明限制DC迁移会损害T细胞的激活（图6e,f）。

图中显示，在弹性ECM中限制DC迁移会降低T细胞的激活能力。 (a) MeTz在DC表面结合的时间线。DCs首先用SK-MEL5裂解物脉冲处理并激活TNF-α，第二天通过NHS化学方法与MeTz结合，然后在Fast R凝胶中与T细胞共同封装以追踪迁移情况。 (b) 未结合MeTz的DCs或用TCO-iFluor 488标记的MeTzDCs的示意图、代表性图像和轨迹图。刻度尺为10 μm。 (c, d) 随时间变化的DC MSD量化，60分钟时的MSD值在来自同一供体的样品中显示；线条连接相同供体的数值。P值使用双尾配对t检验确定（n = 4）。 (e) DCs或MeTzDCs与T细胞在Fast R凝胶中共同封装的时间线。经过SK-MEL5裂解物脉冲和TNF-α激活后，DCs或MeTzDCs与自体T细胞共同培养3天，随后进行流式细胞术分析。 (f) 在Fast R凝胶中与DCs或MeTzDCs共同培养的CD4+ T细胞上CD25表达的量化；线条连接相同供体的数值。P值使用双尾Wilcoxon匹配对签名秩检验确定（n = 6）。 (g) 一个患者自体系统的示意图和时间线，包括ependymoma细胞、DCs和T细胞。在ependymoma切除后，分离PBMCs用于DC分化和T细胞分离。DCs用ependymoma裂解物脉冲处理，激活TNF-α，并在2 mg/mL的Fast R或Slow R凝胶中与T细胞共同封装12天。第12天，溶解凝胶并将T细胞与ependymoma细胞共同培养以评估它们诱导癌细胞caspase-3/7活性的能力。 (h, i) 在Fast R或Slow R凝胶中，由DCs激活的CD4+和CD8+ T细胞的激活量化。 (j) 与Fast R或Slow R凝胶中由DCs激活的T细胞共同培养的ependymoma细胞中的caspase-3/7活性。数据来自一名患者；线条连接相同供体的匹配数值。最后，为了评估观察到的粘弹性调节在患者细胞来源环境中的相关性，我们建立了一个包含ependymoma细胞、DCs和来自同一患者的匹配PBMCs的自体共培养系统（图6g）。12天后，CD4+和CD8+ T细胞在Fast R凝胶中的扩增比在Slow R凝胶中更明显（图6h,i），表明在更弹性的环境中激活受到损害。此外，当在Fast R或Slow R凝胶中激活的T细胞随后与ependymoma细胞共同培养时，暴露于Slow R激活的T细胞的癌细胞表现出较低的caspase-3/7活性，表明T细胞的细胞毒性作用减弱。

3 讨论

本研究揭示了基质粘弹性是调节DC功能和免疫激活的关键因素。利用一个可调节的粘弹性胶原蛋白平台，我们展示了DCs的迁移能力、重塑基质的能力以及激活T细胞的能力强烈依赖于细胞外基质的时长依赖性机械松弛。缓慢松弛（更具弹性）的基质限制了DC的迁移，减少了DC与T细胞的相遇以及随后的T细胞激活和肿瘤细胞杀死。这种移动性的降低源于肌动蛋白-肌球蛋白依赖的基质重塑能力减弱，突显了迁移作为免疫激活的关键机械检查点。长时间的限制进一步诱导了一种机械记忆状态，表现为持续的移动性缺陷和机械感应相关位点的染色质可及性改变。这些发现共同将粘弹性松弛定义为一个物理信号，它协调DC的迁移、信号传导和长期功能，提供了细胞外力学、免疫激活和耐受性之间的机械联系。我们的发现强调了可调节粘弹性胶原蛋白模型在解析力学如何塑造免疫激活方面的实用性。该系统表明，DC的迁移对于有效的T细胞激活至关重要，因为在缓慢松弛基质中移动性的降低是T细胞增殖和激活受损的主要驱动因素。尽管许多免疫细胞行为的方面被归因于一般的机械感应途径，但我们的发现确定了粘弹性作为DC功能的一个独特调节因子。通过独立调节应力松弛而不改变硬度，我们展示了仅粘弹性的改变就足以驱动DC迁移和下游T细胞激活的变化。在这个背景下，DC移动性的降低成为将粘弹性限制与免疫激活受损联系起来的关键功能瓶颈。这一结论与体内活体成像研究的结果一致，后者表明淋巴结内DC-T细胞接触的频率和稳定性决定了激活效率[15, 16, 52]。与这类动物研究不同，由于物理性质、结构和炎症的变化相互耦合等原因，直接分析人体组织中的这些机械调控相互作用是不可行的。我们的系统提供了一个明确的人体基础平台，在其中可以精确调节基质粘弹性并隔离其对免疫激活的贡献。使用来自患者的ependymoma样本作为概念验证，我们进一步证明了这些粘弹性效应在肿瘤环境中的适用性。尽管仅限于一个样本，但这些结果支持了粘弹性调节的转化相关性，并激励了在更多患者队列中进行未来的研究。虽然之前的体外3D共培养系统已经可视化了胶原蛋白基质内的DC-T细胞相互作用[53]，但我们的方法独特地实现了对基质粘弹性的控制。这种胶原蛋白框架可以 easily 与额外的基质或肿瘤成分（包括癌细胞）集成，以模拟特定疾病的环境，并研究实体瘤的基质力学变化如何限制免疫激活。与美国食品药品监督管理局和国家卫生研究院推动的先进人类细胞基模型作为动物研究的预测性和伦理替代方案的最新倡议一致[54, 55]，我们的可调节粘弹性胶原蛋白平台因此提供了一个多功能系统，用于探索机械控制对人类免疫的影响。研究发现DC的迁移高度依赖于肌动蛋白-肌球蛋白驱动的胶原蛋白重塑。在缓慢松弛的基质中，由于粘弹性降低，收缩力无法产生持续的基质重塑，导致迁移受损。这种表型在更高密度的基质（4 mg/mL）中也得以保持，在那里缓慢松弛的条件同样损害了DC的功能和下游T细胞反应，包括T细胞激活和肿瘤细胞杀死。这与之前的研究一致，这些研究表明肌动蛋白-肌球蛋白生成的收缩力与中央肌动蛋白池和WASP驱动的皮质斑块结合，从而为细胞核和细胞体创造前进的空间[14, 56]。值得注意的是，敲低WASF1（Arp2/3介导的肌动蛋白核化的调节因子）在快速松弛基质中减少了DC的迁移，并减弱了快速和缓慢松弛条件之间的差异，支持WASF1在允许性环境中促进力依赖性迁移中的作用。尽管这些发现支持WASF1在调节DC迁移中的功能性作用，但需要进一步的研究来全面阐明其在DC机械记忆中的机械贡献。重要的是，抑制基质金属蛋白酶并未损害快速松弛凝胶中的迁移，而阻断肌动蛋白信号则完全消除了移动性和重塑，强调了路径生成依赖于细胞产生的力而不是蛋白水解。在单核细胞和T细胞中也报告了类似的基于力的策略[57, 58]，表明突出的力生成是免疫细胞迁移的一种保守机制，在缓慢松弛的ECM中尤其受到损害。值得注意的是，封装在缓慢松弛基质中的DCs表现出更炎性的表型，这与报告一致，即限制引起的形状感应触发了未成熟DC中的NF-κB信号传导，导致ARP2/3依赖的CCR7上调和淋巴结迁移的许可[23]。然而，在我们的系统中，TNF-α激活的DCs并未进一步增强共刺激分子，而是放大了NF-κB/AP-1信号和炎症细胞因子的产生。在刚性基底上也有类似的发现，LPS刺激的DCs上调了TLR并分泌IL-6，与软基底相比[32]。其他免疫细胞中的类似发现也支持这一观点：在缓慢松弛的弹性凝胶中的单核细胞表现出促炎表型，并优先分化为DCs[51]，而T细胞通过JNK信号增强了AP-1的激活[45]。尽管在缓慢松弛基质中的DCs分泌了更高水平的IL-1β和IL-6（已知这些细胞因子支持T细胞存活[59, 60]），但中和这些细胞因子并未恢复T细胞的增殖或激活。相反，我们的数据支持一个模型，即生物物理限制对DC迁移的限制限制了T细胞的激活。因此，尽管炎症信号增加，但它不足以克服缓慢松弛基质带来的DC-T细胞相遇频率的降低。在缓慢松弛的粘弹性基质中长时间封装诱导了一种机械记忆，即使转移到快速松弛的环境中，DCs也保留了受限的迁移行为。值得注意的是，这种表型是随着时间逐渐出现的，表明机械记忆是以时间依赖的方式发展的，而不是立即反应的结果。这种表型与机械感应相关位点的染色质可及性降低相关，这与最近的研究一致，即粘弹性环境可以持久地重塑核结构和表观遗传状态[44, 45]。这种记忆可能会加剧限制的效果，因为DC不仅在缓慢松弛基质中迁移能力差，还可能继续携带受损的移动性，限制了它们随后与T细胞相互作用或到达淋巴结的能力。在淋巴结中，有效的激活依赖于重复的、动态的DC-T细胞相遇[52, 61]。因此，缓慢松弛区域的TME可能充当局部陷阱，减弱了DC支持免疫的能力。这些发现共同确立了ECM粘弹性作为调节DC功能的关键因素，并突显了基于人体的粘弹性胶原蛋白模型在解析机械限制如何影响免疫激活方面的强大作用。TME的特点是广泛的机械重塑，其中增加的基质硬度伴随着由于胶原蛋白沉积和交联而改变的粘弹性特性。虽然这项研究主要集中在DC上，但这些变化很可能影响多种免疫细胞群体。在纤维化肿瘤（如乳腺癌和胰腺癌）中，TME调节肿瘤相关巨噬细胞的表型并促进免疫抑制状态[62, 63]。同样，T细胞对机械线索非常敏感，基质硬度影响它们的激活、代谢和分化，包括调节性T细胞功能[64-67]。这些观察结果表明，改变的基质力学对免疫抑制具有广泛的生物物理限制。针对细胞骨架重塑和肌动蛋白-肌球蛋白收缩下游的机械转导途径，可能减轻粘弹性限制对免疫细胞功能的影响[65]。或者，修改肿瘤间质力学特性，例如减少病理性基质交联或恢复基质的变形能力，可能有助于促进免疫细胞迁移并改善细胞间相互作用[64, 68]。这些方法在纤维化且免疫排斥的肿瘤中可能特别相关，因为这些肿瘤中的力学特性改变会增强对免疫治疗的抵抗性。总体而言，这些发现强调了基质粘弹性作为抗肿瘤免疫的关键调节因子，并表明针对肿瘤基质力学特性的研究可能为克服间质屏障提供新的机会。随着临床研究越来越多地量化肿瘤的粘弹性特性[69]，将这些参数整合到肿瘤特征描述和治疗设计中，可能会实现更精确和有效的免疫治疗策略。

4 实验部分

4.1 胶原蛋白凝胶的功能化
胶原蛋白的Norbornene功能化按照先前的描述进行[45]。简而言之，使用5-norbornene-2-乙酸琥珀酰亚胺酯（nb-NHS）（Sigma–Aldrich，776173）以10 mg nb-NHS对100 mg胶原蛋白的比例对大鼠尾型I型胶原蛋白（Corning，354236）进行功能化。首先用NaOH将胶原蛋白中和至pH值约为7.5，然后用10× phosphate-buffered saline（ThermoFisher，70011044）缓冲至2 mg/mL的浓度，随后在4°C下搅拌。将nb-NHS溶解在DMSO（Thermo Fisher，D12345）中至初始浓度为10 mg/mL，然后加入到中和后的胶原蛋白溶液中。在4°C下严格搅拌下反应4小时，以延迟胶原蛋白的凝胶化过程。之后加入0.1 M醋酸以终止反应并重新酸化胶原蛋白溶液。所得到的norbornene修饰胶原蛋白在25 mM醋酸中透析3天，通过0.45 μm过滤器（Corning，430768）过滤，并冷冻干燥以备后续使用。

4.2 流变特性分析
使用带有20 mm锥 plate几何结构的联合马达和传感器流变仪（AR-G2，TA Instruments）对胶原蛋白凝胶进行流变特性分析。将中和后的胶原蛋白溶液（100 μL）加载到4°C的Peltier板上，并在37°C下凝胶化30分钟。凝胶化后，将其浸入含有DMSO的RPMI或284 μM MeTz-(PEG)5-MeTz交联剂的溶液中（Conju-Probe，CP-6042-25 mg），在25°C下孵育20分钟以促进扩散。然后移除溶液，将温度升高至37°C以启动click反应，继续反应30分钟。在37°C下进行振荡频率扫描（0.01 Hz至5 Hz，应变率为1%），以测量储能模量（G′）、损耗模量（G″）和损耗角。通过施加10%的剪切应变并在37°C下保持应变2小时来执行剪切应力松弛测试，同时记录剪切应力的变化。在整个实验过程中使用湿度室以防止脱水。

4.3 DC细胞分化及T细胞分离
从Brigham and Women's Hospital获得去标识的apheresis柱。随后使用Ficoll梯度（Cytiva，17144002）分离人外周血单核细胞（PBMCs）。在实验前6天，使用基于磁珠的CD14+分离试剂盒（Miltenyi，130-050-201）从PBMCs中分离出单核细胞。分离后，将单核细胞在DC分化培养基中培养成DC细胞，该培养基包括RPMI 1640培养基（Thermo Fisher，11875093），并添加了10%的热灭活胎牛血清（Thermo Fisher，10082147）、1%的青霉素-链霉素（Thermo Fisher，15140122）、50 ng/mL的IL-4（PeproTech，200–04）和50 ng/mL的GM-CSF（PeproTech，300–03）。培养5天后，向培养基中添加100 ng/mL的TNF-α（PeproTech，300–01A）并孵育24小时以激活DC细胞。流式细胞术确认了DC细胞的分化以及TNF-α诱导的活化标志物的上调（图S17）。根据制造商的方案，使用基于磁珠的Pan T细胞分离试剂盒（Miltenyi，130-096-535）从PBMCs中分离出Pan T细胞。

4.4 细胞封装及胶原蛋白交联
首先将冷冻干燥的nb-Col在4°C下用25 mM醋酸溶解，浓度为6 mg/mL，持续3天。为了制备快速松弛（非click交联）和慢速松弛（click交联）的凝胶，在冰上将6 mg/mL的nb-Col与10x PBS和Milli-Q水混合，并用1 M NaOH中和至最终pH值约为7.5，最终胶原蛋白浓度为2.2 mg/mL或4.4 mg/mL。在冰上将活化的DC细胞重新悬浮在PBS（Thermo Fisher，14190235）中，然后将100,000个细胞与胶原蛋白溶液以1:10的体积比混合，达到最终胶原蛋白浓度为2 mg/mL。将胶原蛋白-DC溶液加入到12孔MatTek板（P12G-1.5-10-F）或24孔MatTek板（P24G-1.5-10-F）的10毫米直径中心孔中，并在37°C下孵育30分钟以使胶原蛋白凝胶化。凝胶化后，将板转移到室温下10分钟。将甲基四嗪-(PEG)5-甲基四嗪溶解在1 mL RPMI培养基中至最终浓度为284 μM，并加入凝胶中进行交联。将相同体积的DMSO稀释在RPMI中作为对照。在室温下孵育10分钟以允许交联剂在胶原蛋白中扩散的同时最小化交联现象，然后移除溶液，并将板转移到37°C下进一步交联，并再孵育30分钟。交联后，胶原蛋白凝胶用RPMI培养基洗涤三次，每次10分钟，以去除多余的交联剂，并在添加了100 ng/mL TNF-α的DC分化培养基中培养。

4.5 从胶原蛋白凝胶中分离DC细胞和T细胞
为了从胶原蛋白凝胶中分离DC细胞，将凝胶转移到含有10% FBS和80 U/mL胶原蛋白酶IV（Thermo Fisher，17104019）的RPMI溶液中，并在37°C下孵育至少30分钟。在孵育过程中，每隔10分钟用1 mL的移液器吸头在胶原蛋白凝胶中机械破坏，直到胶原蛋白完全消化。之后，向溶液中加入等体积的EasySep缓冲液（Stemcell Technologies，20144）以停止反应。然后收集细胞溶液，用PBS洗涤两次，并重新悬浮以便进行后续分析。

4.6 癌细胞培养及裂解液制备
SK-MEL-5细胞在含有10%热灭活胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM（Gibco，11965092）中培养。ependymoma细胞系在含有1:100抗生素-抗真菌剂（Gibco，Cat#15240112）、1:100 HEPES（Life Technologies，Cat#15630080）、20 ng/mL hEGF（Shenandoah Biotechnology，Cat#100-26AF）、20 ng/mL hFGF（Shenandoah Biotechnology，Cat#100-146AF）和1:1000肝素（StemCell Technologies，07980）的human NeuroCult NS-A增殖培养基（StemCell Technologies，05751）中维持。两种细胞系都在37°C的培养箱中培养，并通入5%的CO2。为了制备肿瘤裂解液（SK-MEL-5和ependymoma），细胞先用PBS洗涤两次，然后用TrypLE Express（对于SK-MEL-5；Gibco，12604013）或Accutase（对于ependymoma；StemCell Technologies，07920）在37°C下孵育5分钟以分离贴壁细胞或破坏细胞团块。通过添加完全培养基来终止酶促反应，并通过350 × g离心5分钟使细胞沉淀。肿瘤裂解液通过干冰和37°C水浴之间的四次冻融循环制备。细胞碎片通过14,000 × g离心10分钟在4°C下去除，根据制造商的说明使用Pierce BCA Protein Assay Kit（Thermo Scientific，A65453）测定蛋白质浓度。裂解液分装并储存于-80°C备用。

4.7 DC细胞与T细胞的共培养
分化后，DC细胞用200 μg/mL的SK-MEL-5肿瘤提取物脉冲处理，该提取物通过四次冻融循环制备，然后在含有1%青霉素-链霉素的RPMI 1640中孵育3小时，随后用TNF-α激活16小时。接着，用CFSE（Invitrogen，C34554）或CellTrace Far Red（Invitrogen，C34572）标记的DC细胞和T细胞以1:10（DC:T）的比例封装在快速或慢速松弛的胶原蛋白凝胶中，如前所述。封装后的细胞在含有10 ng/mL IL-2（PeproTech，200–02）、10 ng/mL IL-7（PeproTech，200–07）和10 ng/mL IL-15（PeproTech，200–15）的X-VIVO 15培养基（Lonza，02–053Q）中培养。根据需要每4天或更早更换培养基。12天后，按照先前的方法消化胶原蛋白凝胶，并收集样本进行后续分析。为了中和细胞因子，在DC-T细胞共培养中第0天加入最终浓度为2 μg/mL的抗IL-1β单克隆抗体（eBioscience，14-7018-81）和抗IL-6单克隆抗体（eBioscience，14-7069-81），并每4天补充一次。

4.8 DC细胞-T细胞与癌细胞的共培养
在用SK-MEL-5肿瘤裂解液脉冲处理并激活DC细胞后，将DC细胞和T细胞共封装在Fast R或Slow R凝胶中，这些凝胶使用具有3 μm孔径的聚碳酸酯膜（Corning，3415）的Transwell inserts的上层孔中，允许T细胞迁移。第5天，将inserts转移到含有每孔25,000个SK-MEL-5肿瘤细胞的新鲜下层孔中。培养继续进行7天。第12天，按照先前的方法消化上层孔中的胶原蛋白凝胶。直接收获下层孔中的细胞以进行后续分析。

4.9 患者样本
从波士顿儿童医院接受手术切除的ependymoma患者处获得患者来源的细胞系和外周血样本，事先已获得Dana Farber Cancer Institute（DFCI 10–417）的机构审查委员会同意和批准。患者来源的细胞系用于制备肿瘤裂解液或进行共培养实验。使用密度梯度离心（Ficoll-Paque PLUS，Cytiva）从全血中分离PBMCs，用于自体DC细胞分化和T细胞分离。所有程序均遵循伦理指南和批准的方案。

4.10 时间延迟成像
封装后，将DC细胞在含有100 ng/mL TNF-α的DC分化培养基中在37°C下孵育1小时，然后进行成像。为了追踪DC细胞的迁移，在成像前1天加入SiR-DNA（Cytoskeleton，CY-SC007），最终浓度为200 nM以标记细胞核。为了抑制小分子，分别在时间延迟成像之前1小时将以下抑制剂加入到DC分化培养基中：25 μM para-amino-blebbistatin（Cayman，22699）、10 μM Y27362（Stem Cell Technologies，72302）、10 μM marimastat（Thermo Fisher，J67288.MCR）、10 μM GM6001（Sigma–Aldrich，364206）、1 μM IPI-549（Selleckchem，S8330）、10 μM defactinib（Abcam，ab254452）和500 nM latrunculin A（Abcam，ab144290）。以等体积的DMSO作为对照。使用Zeiss LSM 980和Leica Stellaris共聚焦显微镜进行时间延迟成像，每3分钟拍摄一次图像，持续2小时。图像使用FIJI软件[70]处理，轨迹追踪使用TrackMate [71]进行。使用自定义的Python脚本进行细胞迁移轨迹图和均方位移分析。为了追踪胶原蛋白的位移，将封装DC细胞的Nb-Col与tetrazine-iFluor 488（AAT Bioquest，1014）在37°C下孵育1小时以进行click反应，然后用DC培养基洗涤两次。在成像前1天加入SiR-DNA（Cytoskeleton，CY-SC007），最终浓度为200 nM以标记细胞核，然后在成像前1小时加入SPY555-FastAct（Cytoskeleton，CY-SC205；1:2000）以标记肌动蛋白。使用Zeiss LSM 980共聚焦显微镜进行胶原蛋白位移的时间延迟成像，每分钟拍摄一次图像，持续10分钟。使用基于MATLAB的PIVlab工具箱[72]进行粒子图像速度测量。用tetrazine-iFluor 488标记的胶原蛋白纤维通过时间延迟共聚焦显微镜成像，并计算连续帧之间的位移场。使用标准PIVlab过滤器验证和平滑位移场，将位移幅度在10分钟的成像期间求和，以量化总的胶原蛋白重塑。为了可视化，根据幅度对位移图进行颜色编码，并确定胶原蛋白位移的主要方向。

4.11 流式细胞术染色
在流式细胞术染色之前，如前所述从胶原蛋白凝胶中分离DC细胞和T细胞，然后用PBS洗涤孔并收集洗涤液。细胞用PBS洗涤两次，然后用死细胞染色试剂盒（Invitrogen，L34982或L23105）在4°C下染色10分钟。染色后，细胞用FACS缓冲液（Invitrogen，00-4222-26）洗涤两次。为了阻断，向细胞中加入human Fc block（BioLegend，422302）和Brilliant Stain Buffer（BD，563794），并在4°C下孵育10分钟。随后，将相应抗体以1:100的比例直接加入细胞溶液中。在4°C下孵育30分钟后，细胞用FACS缓冲液洗涤两次，重新悬浮在FACS缓冲液中，并使用Sony ID7000进行分析。使用荧光减去一的方法进行 gating。CD4+和CD8+ T细胞以及DCs的门控策略如图S18所示。用于流式细胞术的抗体完整列表见表S1。

4.12 细胞因子分泌
TNF-α激活的DCs被封装在快速或缓慢松弛的胶原凝胶中，置于12孔板中，并在含有100 ng/mL TNF-α的DC分化培养基中培养3天。为了抑制AP-1/NF-κB通路，第0天添加了SP-100030（MedChemExpress, HY-110177）（浓度为1 μM）。第3天，收集培养上清液，并以3000 x g的离心力离心10分钟以去除碎片，然后储存在-80°C条件下以备后续分析。对于ELISA实验，按照制造商说明（R&D Systems, DY201和DY206）准备 plate，并使用微孔板读数器（BioTek Synergy H1, Agilent）检测信号。对于多重分析，上清液经过细胞因子分析（Eve Technologies）。

4.13 胶原基质结构的成像和定量分析
快速松弛（Fast R）或缓慢松弛（Slow R）的胶原基质通过在与PBS混合的10 μM tetrazine-iFluor 488中孵育1小时（37°C）进行荧光标记，随后用PBS清洗三次。成像是在Zeiss LSM 980共聚焦显微镜上完成的。以0.24 μm的间隔获取Z轴堆栈，总厚度约为5.3 μm（22个切片），并生成最大强度投影图以获得胶原纤维网络的2D表示。使用Fiji从投影图像中量化孔径大小。图像经过阈值处理、二值化并反转以分割孔洞。使用“Analyze Particles”功能测量每个孔的面积，并计算出与之面积相等的圆的直径。通过线扫描强度 profil 从同一图像中量化纤维直径。画出垂直于单个纤维的线，并将直径估计为强度剖面的半高全宽。只有具有单一、明确峰值的剖面被包括在内。使用Fiji中的OrientationJ [73]插件量化纤维的连贯性。从投影图像中随机选择10 × 10 μm的兴趣区域，并使用OrientationJ Measure函数计算纤维的连贯性作为纤维对齐的指标。

4.14 细胞在胶原凝胶上的扩散动力学
快速松弛（Fast R）和缓慢松弛（Slow R）的胶原凝胶（2 mg/mL，每孔40 μL）按照先前描述的方法浇铸在48孔板（MatTek, P48G-1.5-6-F）中。TNF-α激活的、用CFSE染色的DCs（10,000个细胞）被接种到含有TNF-α的DC分化培养基的200 μL中。10分钟后，轻轻清洗孔板，并在0、30和60分钟时对细胞进行成像。

4.15 RNA干扰和免疫染色
在分化第5天收集DCs，并将其重新悬浮在无抗生素的DC培养基中。根据制造商说明，使用Lipofectamine RNAiMAX（Thermo Fisher Scientific, 13778030）将20 μM的siRNA转染到细胞中。使用了TriFECTa RNAi Kit（IDT, 439037668），在测试的三个siRNA序列中，基于其敲低效率选择了WASF1.13.2（Ref# 619926573）。转染两天后，细胞在室温下用4%的戊二醛（Electron Microscopy Sciences, 15710-S）固定10分钟，然后用PBS清洗三次。接着在室温下用0.1%的Triton X-100（Sigma–Aldrich, X100）渗透10分钟，再用PBS清洗三次。使用2%的牛血清白蛋白（BSA; Sigma–Aldrich, A1470）在PBS中封闭30分钟。细胞与anti-WASF1一抗（1:100, Invitrogen, PA5-78273）在4°C下过夜孵育。用PBS清洗三次后，样品在室温下与山羊抗兔IgG Alexa Fluor 594二抗（1:500, Thermo Fisher Scientific, A-11012）、Alexa Fluor 488–phalloidin（1:1,000, Thermo Fisher Scientific, A12379）和Hoechst 33342（1:10,000, Thermo Fisher Scientific, 62249）孵育1小时。最后用PBS清洗三次后，使用Zeiss LSM 980共聚焦显微镜进行成像。使用Fiji软件量化WASF1的荧光强度。

4.16 MeTz在DCs上的结合
脉冲激活后，DCs用PBS清洗两次，然后用25 μM的methyltetrazine-PEG4-NHS ester（Broadpharm, Cat#BP-22945）在4°C下孵育30分钟。通过加入最终浓度为20%的FBS来终止反应。清洗两次后，DCs被封装在快速松弛或未改性的胶原中，分别用于流式细胞术分析或迁移实验。为了监测MeTz在DCs上的保留情况，在含有TNF-α的DC分化培养基中维持MeTz标记的细胞，并在指定时间点收集。细胞用10 μM的TCO-iFluor 488（AAT Bioquest, 1005）在37°C下孵育30分钟，然后用PBS清洗两次。成像是在Leica Stellaris共聚焦显微镜上完成的。

4.17 Caspase-3/7细胞毒性检测
使用Caspase-Glo 3/7检测（Promega, G8091）在96孔白色不透明板中量化T细胞的细胞毒性。从快速松弛（Fast R）或缓慢松弛（Slow R）条件下收获的T细胞以3:1的效应因子与靶细胞比率加入到癌细胞中。通过向含有癌细胞的孔中加入50 μL的T细胞悬浮液来建立共培养。培养物在37°C下孵育4小时，然后平衡至室温，再用100 μL的caspase-3/7试剂处理。在室温下孵育30分钟后，使用微孔板读数器（Synergy H1, BioTek; Agilent）在发光模式下测量发光强度。

4.18 大规模RNA测序和ATAC测序的样本准备
从四位或三位供体中分离出的单核细胞分别分化为DC并使用TNF-α激活，用于大规模RNA测序和ATAC测序。然后将得到的DCs封装在快速松弛和缓慢松弛的2 mg/mL胶原凝胶中培养3天。之后，如前所述，通过胶原酶消化从胶原凝胶中分离DCs。每个样本中取50,000个细胞用于使用Zymo-Seq ATAC Library Kit（Zymo Research, D5458）制备ATAC-seq文库。剩余的细胞按照制造商说明使用PureLink RNA Micro Scale Kit（Thermo Fisher, 12183016）进行RNA分离。

4.19 大规模RNA测序和ATAC测序的分析
对于主成分分析，原始基因计数使用log1p进行对数转换以减少高表达转录本的影响，然后进行转置并在样本间标准化；使用scikit-learn（Python）进行PCA。差异表达分析使用DESeq2进行，采用方差稳定化转换进行归一化，调整后的p < 0.05和|log2倍数变化| >1的基因被认为是显著的。使用Enrichr（gseapy）进行基因本体富集，并可视化选定的术语。从z-score标准化的表达数据生成热图。使用DoRothEA推断转录因子活性，并生成火山图来显示log2倍数变化与–log10调整后的P值。对于ATAC-seq，使用Cutadapt（v5.0）修剪适配器，用BWA-MEM2（v2.2.1）对齐到hg19，用SAMtools（v1.21）排序，并用Picard（v3.3.0）去重。使用MACS2（v2.2.9.1）以参数–nomodel –shift -100 –extsize 200 –qvalue 0.01调用峰。使用DiffBind通过线性模型（～ Replicate + Condition）评估差异可及性。使用ChIPseeker（TxDb.Hsapiens.UCSC.hg19.knownGene）注释峰，以确定转录起始位点±3 kb范围内的基因组上下文和最近基因。使用deepTools（v3.5.6）量化并可视化转录起始位点周围的染色质可及性。

4.20 统计分析
统计分析使用GraphPad Prism（v.10）进行，详细方法在文本和图例中描述。首先评估数据的正态性以确定应用参数化还是非参数化检验。P < 0.05被认为具有统计学意义。每个实验的样本量n在相应的图例中指出。

作者贡献
W.-H.J.和D.J.M.构思和设计了这项研究。W.-H.J.、E.H.、J.M.P.、A.H.和S.I.进行了实验并分析了数据。W.-H.J.和J.M.P.分析了测序数据。Y.B.提供了研究设计指导并提供了患者样本。W.-H.J.和D.J.M.撰写了手稿。所有作者都审阅和编辑了手稿。

致谢
作者感谢Tetsuhiro Harimoto和Kwasi Adu-Berchie在科学上的贡献，以及Tomas Charles Ferrante在显微镜成像方面的帮助。W.-H.J.得到了国家癌症研究所（K00CA253759）的支持。Y.B.得到了国家癌症研究所（T32CA136432）的支持。大规模RNA-seq和ATAC-seq在哈佛大学的Bauer核心设施进行。额外的支持来自Wellcome Leap HOPE计划。

利益冲突
D.J.M.在Medicenna、Lyell、Attivare、Epoulosis、Limax Biosciences、Lightning Bio和Oddity Tech拥有研究资助、咨询权益或股票期权/股份；拥有Alkem和Amend Surgical的知识产权许可；并且是ATCC的董事会成员。其他作者声明没有竞争利益。

数据可用性声明
支持本研究发现的数据可以根据合理请求从相应作者处获得。