铜死亡与PI3K抑制剂联合增强肝细胞癌免疫治疗的谷胱甘肽响应型纳米粒子研究

《Advanced Science》：GSH-Responsive Nanoparticles Enhance Hepatocellular Carcinoma Immunotherapy Through Synergistic Effects of Cuproptosis and PI3K Inhibitor Combination

　　

铜死亡（cuproptosis）作为一种新兴的程序性细胞死亡形式，能够诱导线粒体功能障碍。此外，PI3K-AKT-mTOR信号通路通过重编程线粒体形态和功能促进肿瘤细胞进展。在本研究中，研究人员设计了铜配合物纳米粒子（NPCu）和PI3K-AKT-mTOR抑制剂Alpelisib纳米粒子（NPALP），以增强基于铜死亡的疗法疗效。NPCu触发线粒体功能障碍并促进脂酰化二氢硫辛酸乙酰转移酶（DLAT）的聚集，而NPALP抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路以诱导凋亡。这两种纳米粒子（NPCu+NPALP）的联合应用有效激活了肿瘤微环境（TME）中的抗肿瘤反应。当与抗程序性细胞死亡蛋白1抗体（α-PD-1）联合使用时，NPCu+NPALP显著抑制肿瘤进展并激活抗肿瘤免疫，为肝癌治疗提供了有前景的策略。

论文解读：GSH响应型纳米粒子通过铜死亡与PI3K抑制剂协同增强肝细胞癌免疫治疗

本研究由研究人员开展，旨在解决肝细胞癌（HCC）治疗中单一疗法效果不佳及肿瘤微环境（TME）免疫抑制的问题。相关成果发表在《Advanced Science》期刊。研究背景指出，癌细胞相较于正常组织更依赖铜离子，铜死亡是一种通过调节细胞内铜浓度选择性杀伤癌细胞的新途径，其特征是三羧酸循环中的脂酰化蛋白（如DLAT）与铜离子结合导致蛋白聚集及铁硫簇蛋白丢失。然而，现有基于铜死亡的疗法往往难以影响TME中的多个信号通路（如PI3K-AKT-mTOR通路），限制了疗效。该通路与多种肿瘤的发病机制及线粒体代谢相关，其激活会促进肿瘤进展并靶向调控线粒体蛋白。因此，开发能同时干预这些通路的铜死亡疗法至关重要。本研究创新性地构建了谷胱甘肽（GSH）响应的纳米粒子系统，实现了铜死亡诱导剂与PI3K抑制剂在肿瘤部位的协同释放与作用。

关键技术方法包括：利用GSH敏感的聚合物（PEG-SS）和商业两亲性聚合物DSPE-PEG₂₀₀₀，通过共组装技术分别制备负载铜配合物（Cu）的NP^Cu和负载Alpelisib（ALP）的NP^ALP；采用近红外二区（NIR-II）荧光成像评估纳米粒子在H22荷瘤小鼠模型中的体内生物分布；通过转录组测序（RNA-seq）分析HepG2细胞经不同处理后的基因表达变化；利用流式细胞术（FCM）和共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）等技术检测细胞摄取、线粒体膜电位、免疫原性细胞死亡（ICD）标志物及免疫细胞亚群比例；并建立H22皮下移植瘤小鼠模型评估体内抗肿瘤 efficacy 及免疫激活效应。

研究结果

1. 1.
   结果与讨论
   研究人员首先证实了NP^ALP和NP^Cu具有良好的理化特性，包括均匀的球形形貌、适宜的粒径（约110 nm）和zeta电位，并在水相和血清环境中表现出良好的稳定性。药物释放实验表明，在高浓度GSH条件下，两种纳米粒子均能有效释放负载的药物（Cu和ALP）。细胞实验显示，HepG2细胞对Rhodamine B标记的纳米粒子具有明显的摄取能力，且随时间延长摄取量增加。协同效应分析（SynergyFinder软件）确定在特定比例下，NP^Cu+NP^ALP对HCC细胞系（HepG2和7402）具有显著的协同杀伤作用，其半数抑制浓度（IC₅₀）显著低于单一制剂。克隆形成实验和凋亡分析进一步证实联合治疗能更有效地抑制肿瘤细胞增殖并诱导凋亡。机制研究表明，NP^Cu+NP^ALP可导致线粒体膜电位显著降低，并通过Western blot证实其能下调LIAS蛋白水平，诱导脂酰化DLAT的积累，从而引发铜死亡。此外，联合治疗还能有效诱导ICD，表现为CRT暴露、HMGB1释放及ATP分泌增加，并能促进骨髓来源树突状细胞（BMDCs）的成熟。转录组测序分析揭示，联合治疗显著富集了TNF通路、P53通路和JAK-STAT通路，并激活了DNA复制、TCA循环及凋亡过程相关基因，同时上调了IL-6、IL-11等免疫刺激因子。体内安全性评价显示，纳米粒子对主要器官无明显毒性，且具有良好血液相容性。
2. 2.
   体内生物分布与抗肿瘤疗效
   通过NIR-II荧光成像观察发现，ICG标记的纳米粒子（ICG-NP^ALP和ICG-NP^Cu）在注射后能高效富集于肿瘤部位，其中ICG-NP^Cu的肿瘤累积峰值出现在注射后7小时。在H22荷瘤小鼠模型中，与PBS、单一纳米粒子治疗组相比，NP^Cu+NP^ALP组表现出最显著的抗肿瘤效果，肿瘤体积和重量均被显著抑制，且小鼠体重保持稳定。组织学分析（H&E和Ki67染色）显示，联合治疗组肿瘤组织出现明显的核碎裂和核溶解，且细胞增殖活性最低。
3. 3.
   免疫激活效应
   免疫荧光和流式细胞术分析表明，NP^Cu+NP^ALP治疗能促进肿瘤组织中CD8⁺T细胞的浸润，同时减少M2巨噬细胞和调节性T细胞（Treg）的比例。此外，该联合治疗还能显著增加肿瘤引流淋巴结中成熟树突状细胞（DCs，CD80⁺CD86⁺CD11c⁺）的比例，并降低肿瘤组织中髓源性抑制细胞（MDSCs，CD11b⁺Gr-1⁺）的比例，表明其能有效激活系统性抗肿瘤免疫反应。
4. 4.
   与α-PD-1的联合治疗
   进一步的实验探讨了NP^Cu+NP^ALP与抗PD-1抗体（α-PD-1）的联合疗效。结果显示，四药联合（NP^Cu+NP^ALP+α-PD-1）在抑制肿瘤生长方面表现出最强的协同效应，其疗效显著优于单一α-PD-1治疗或单纯纳米粒子联合治疗。免疫分析表明，该联合策略能进一步促进淋巴结和肿瘤组织中DCs的成熟，并显著增加肿瘤浸润CD8⁺T细胞中IFN-γ⁺细胞的比例，从而更高效地激活抗肿瘤免疫应答。

结论与讨论

研究结论部分指出，研究人员成功开发了一种基于两种纳米粒子的联合治疗策略。NP^ALP通过自组装形成，可抑制PI3K-AKT-mTOR通路及HCC细胞增殖；NP^Cu同样通过自组装形成，可诱导蛋白寡聚化、蛋白毒性应激及铜死亡。两种纳米粒子经系统给药后均能有效地靶向并滞留于肿瘤部位。值得注意的是，NP^Cu+NP^ALP的联合治疗展现出卓越的抗肿瘤 efficacy，通过促进DCs成熟、增加CD8⁺T细胞浸润及减少MDSCs群体来激活抗肿瘤免疫。此外，NP^Cu+NP^ALP与α-PD-1免疫检查点阻断疗法具有协同作用，能有效抑制HCC肿瘤进展，为肝癌的临床治疗提供了新的策略和思路。本研究的创新之处在于巧妙地将铜死亡诱导与PI3K信号通路抑制相结合，并利用GSH响应型纳米载体实现肿瘤特异性药物释放，为克服肝癌免疫治疗耐药性和提高疗效提供了重要的实验依据。