N, S共掺杂碳量子点-核黄素复合光敏剂用于增强离子导入辅助角膜交联

《Advanced Science》：N, S Co-Doped Carbon Quantum Dots-Riboflavin Composite Photosensitizers for Enhanced Iontophoresis-Assisted Corneal Cross-Linking

　　

摘要：离子导入辅助角膜交联（I?CXL）是一种新兴的经上皮技术，用于治疗圆锥角膜（KC）。I?CXL利用微小电流增强核黄素5′?磷酸钠（RF）的角膜渗透，避免了传统CXL（C?CXL）相关的去上皮副作用。然而，由于RF表面电荷不足阻碍离子导入响应和吸收效率，以及角膜基质中活性氧（ROS）生成不足，I?CXL的效果不如C?CXL。本研究报道了一种创新复合光敏剂（NS?CQDs?RF）的开发，利用N、S共掺杂碳量子点（NS?CQDs）作为纳米载体，以克服I?CXL面临的瓶颈。实验结果表明，所合成的NS?CQDs?RF复合材料表现出显著的电场响应性、增强的RF角膜渗透性、高效的ROS生成效率和优异的生物相容性。值得注意的是，结合NS?CQDs?RF的I?CXL显著改善了角膜生物力学稳定性，在不影响疗效的前提下优于C?CXL，同时降低了总UVA辐照能量。密度泛函理论（DFT）计算表明，NS?CQDs与RF之间优化的电子结构和有利的能量学驱动了有效的电荷转移，放大了ROS的生成。这些发现突出了NS?CQDs?RF复合光敏剂在I?CXL中的优越性，为未来圆锥角膜的治疗提供了一种新策略。

论文解读：N,S共掺杂碳量子点-核黄素复合光敏剂用于增强离子导入辅助角膜交联

研究背景

圆锥角膜（KC）是一种常见的角膜扩张性疾病，角膜胶原交联（CXL）是治疗该疾病进展的主要手段。传统的去上皮角膜胶原交联（C?CXL）虽有效，但因去除上皮层常伴随感染、愈合延迟及瘢痕等并发症。为此，保留上皮的跨上皮角膜交联（TE?CXL）应运而生，其中离子导入辅助角膜交联（I?CXL）利用电场驱动带负电的核黄素5′?磷酸钠（RF）穿透上皮。然而，现有I?CXL面临两大瓶颈：一是RF表面电荷不足，导致其对离子导入电流的响应较弱，角膜基质内药物浓度低于C?CXL；二是UVA照射下产生的活性氧（ROS）不足，导致交联深度和生物力学增强效果不及传统方法。因此，开发兼具高电荷载流子密度和高ROS催化能力的纳米材料与RF复合成为迫切需求。本研究由温州医科大学眼视光医院团队完成，发表于《Advanced Science》。

关键技术方法

研究人员采用改良水热法合成N、S共掺杂碳量子点（NS?CQDs），并通过一步酯化反应制备NS?CQDs?RF复合材料。利用透射电子显微镜（TEM）、X射线光电子能谱（XPS）和zeta电位分析对材料进行表征。通过电子顺磁共振（EPR）、GSH消耗实验及化学探针法评估ROS生成效率。体外利用Transwell系统构建多层角膜上皮细胞模型评估渗透性，体内则通过新西兰大白兔模型，结合共聚焦显微镜、前段光学相干断层扫描（AS?OCT）、应力应变测试及酶消化实验评估交联疗效，并利用H&E、Masson、TUNEL染色及器官切片评估生物安全性。此外，采用密度泛函理论（DFT）计算揭示电荷转移机制。

研究结果

2.1 NS?CQDs及NS?CQDs?RF复合光敏剂的合成与表征

研究人员通过透射电镜观察到NS?CQDs呈单分散状态，平均粒径为2.7?±?0.7?nm，而负载RF后形成的NS?CQDs?RF粒径增大至8.0?±?1.0?nm。XPS及FT?IR分析证实RF通过酯键成功连接到NS?CQDs表面。荧光光谱显示NS?CQDs与RF之间存在弗斯特共振能量转移（FRET）效应。相较于单掺杂或无掺杂碳量子点，N、S共掺杂有效调控了电子结构，为电荷分离奠定了基础。

2.2 NS?CQDs?RF复合光敏剂的电子转移与ROS生成表征

Zeta电位测定显示NS?CQDs?RF的电位（?20.1?mV）比RF（?6.3?mV）更负。XPS结合能位移分析表明电子从NS?CQDs的S元素向RF的Na元素转移。EPR及探针实验证明，NS?CQDs?RF在UVA照射下产生单线态氧（¹O₂）、羟基自由基（·OH）和超氧阴离子（·O₂^?）的能力显著强于游离RF，且N、S共掺杂的协同效应优于单一掺杂。

2.3 NS?CQDs?RF的体外细胞相容性与渗透能力

细胞实验显示，NS?CQDs?RF在高达2?mg?mL^?1的浓度下对人角膜上皮细胞（HCECs）和兔角膜基质细胞（RCSCs）无明显毒性，细胞存活率超过90%。Transwell渗透实验表明，在电场作用下，NS?CQDs?RF组的累积RF渗透量显著高于单纯RF组，证实了其增强跨上皮输送的能力。

2.4 体内角膜RF吸收与ROS生成的评估

活体兔眼实验结果显示，经离子导入后，NS?CQDs?RF组角膜基质内的RF绿色荧光强度及含量与去上皮RF组相当，且显著高于单纯离子导入RF组。同时，该组角膜匀浆中的GSH消耗率最高，Rb和DPBF探针检测显示其产生的·OH、¹O₂和·O₂^?水平最高，验证了体内增强的ROS生成效能。

2.5 基于NS?CQDs?RF复合光敏剂的体内I?CXL疗效

应力应变测试表明，NS?CQDs?RF（离子导入）组的角膜在8%和10%应变下的应力及杨氏模量均高于RF（离子导入）组和空白组，甚至略优于RF（去上皮）组。胶原酶消化实验中，NS?CQDs?RF组角膜圆盘完全消化时间最长（约24?h），显示出最强的抗酶解能力。AS?OCT扫描显示，该组角膜基质分界线深度（219.1?±?19.1?μm）显著深于RF（离子导入）组（152.2?±?10.6?μm），并与RF（去上皮）组（201.1?±?23.5?μm）相当。电镜观察进一步证实其胶原纤维间隙缩小程度最大。

2.6 NS?CQDs?RF复合光敏剂的体内眼部及全身生物安全性

长达12周的观察显示，NS?CQDs?RF（离子导入）组兔角膜H&E、Masson染色结构清晰，未见炎性细胞浸润或凋亡（TUNEL阴性）。裂隙灯检查显示角膜上皮光滑，内皮细胞密度与形态维持正常，未出现角膜水肿或混浊。主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）的H&E染色结果与对照组无差异，证明了该材料优异的局部及全身生物安全性。

2.7 降低总UVA能量方案的I?CXL疗效

研究人员尝试将UVA照射时间从标准的30?min缩短。结果显示，在3?mW?cm^?2条件下照射15?min的NS?CQDs?RF组，其角膜抗酶解能力和应力应变曲线与照射30?min组相当，且均优于10?min组。这表明使用NS?CQDs?RF作为光敏剂可在保证疗效的同时显著降低UVA总能量。

2.8 电荷转移与¹O₂生成的密度泛函理论（DFT）分析

DFT计算构建了NS?CQDs?RF的分子模型。差分电荷密度图和Bader电荷分析显示RF通过S?Na键从NS?CQDs获得约0.38?eV的电子。NS?CQDs较高的HOMO能级（?2.2872?eV）与RF较低的LUMO能级（?4.0535?eV）形成了有利于电子转移的驱动力。自由能图谱显示NS?CQDs?RF对O₂的吸附能更低（0.47?eV），且单线态?三线态能隙（E_S1?T1）更小（0.48?eV），这共同促进了高效的自旋轨道耦合和¹O₂释放。

讨论与结论

讨论部分指出，尽管已有多种纳米载体用于增强RF渗透，但多数存在粒径大、跨膜动力学慢或缺乏系统的体内生物力学验证等问题。本研究开发的NS?CQDs?RF系统利用碳量子点的独特性质，首次在保留上皮的前提下实现了优于C?CXL的生物力学增强效果，并显著缩短了渗透时间和UVA照射剂量。考虑到人角膜较兔角膜更厚且存在致密的Bowman层，未来可能需要调整电场参数，但该系统的小尺寸和强驱动力仍具临床应用潜力。

结论部分总结道，该研究提出的NS?CQDs?RF复合光敏剂能够高效响应离子导入电场，增强核黄素的角膜吸收，并通过促进电荷转移和光子捕获显著提高ROS产量。该技术为圆锥角膜等角膜扩张性疾病提供了一种保留上皮、低紫外损伤的新型治疗策略。