镍的结合作用使幽门螺杆菌中的HypA蛋白趋向于更紧凑的构象

《Journal of Inorganic Biochemistry》：Nickel binding shifts Helicobacter pylori HypA toward compact conformations

　　斯蒂法诺·丘尔利（Stefano Ciurli）| 卢卡·马泽（Luca Mazzei）| 巴巴拉·赞贝利（Barbara Zambelli）| 索菲亚·拉涅里（Sofia Ranieri）| 诺埃米·卡罗塞拉（Noemi Carosella）| 马西莫·卢奇（Massimo Lucci）| 弗兰斯·A.A. 穆尔德（Frans A.A. Mulder）
博洛尼亚大学药学和生物技术系生物无机化学实验室，意大利博洛尼亚

**摘要**
幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，简称Hp）是一种革兰氏阴性人类病原体，其依赖于镍酶尿素酶和[Ni,Fe]-氢化酶在胃部定植。Ni(II)被递送到这些酶的活性位点是由金属伴侣蛋白HpHypA介导的，该蛋白包含一个高亲和力的结构型Zn(II)位点和一个低亲和力的Ni(II)位点，分别位于两个不同的结构域中。尽管已知apo形式的Zn-HpHypA的NMR溶液结构，但Ni(II)结合对结构的影响仍不清楚。本文通过NMR 15N松弛实验研究了Zn-HpHypA和Ni,Zn-HpHypA的骨架内部动态及旋转扩散特性。残基分辨率的无模型分析显示，apo状态和holo状态下的骨架运动幅度大致相似。然而，Ni(II)的结合增加了旋转扩散，表明其水动力半径减小，并趋向于更紧凑的构象。这些观察结果支持了一种模型，即Ni(II)的结合通过缩小伴侣蛋白识别过程中的构象分布范围来生成具有递送能力的蛋白质结构。先前的量热数据报道了HpHypA与尿素酶金属伴侣蛋白同源二聚体HpUreE2之间的相互作用，显示微量Ni(II)能够与HpHypA结合，但在HypA•UreE2复合物中形成了亚纳米级的强放热Ni位点。溶液NMR光谱学观察到的镍诱导的构象紧缩为Ni依赖性的构象转换提供了合理的物理基础，这种转换促进了高亲和力的蛋白质-蛋白质识别。

**1. 引言**
镍是幽门螺杆菌（H. pylori，简称Hp）中几种酶的重要辅因子[1][2][3][4][5]，尤其是尿素酶和[Ni,Fe]-氢化酶，这些酶对于细菌在胃黏膜内的定植和持续存在至关重要[6][7][8][9][10]。镍（Ni(II)）在这些途径中的核心作用带来了严格的稳态挑战：细胞内的自由镍既稀缺又具有潜在毒性[11]，因此Hp必须将镍的获取与高度控制的细胞内运输、缓冲以及靶向递送到酶成熟系统相结合[12][13][14][15][16][17][18][19][20][21][22][23][24][25]。在确保镍高效运输到目标蛋白的同时，尽量减少不受控制的镍（Ni(II)反应性的逻辑意味着，Hp中的镍代谢不仅受到蛋白质-金属离子亲和力的热力学控制，还受到动力学控制和巨分子相互作用动态的调节。

这个金属运输网络的关键组成部分是HpHypA（HpHypA），这是一种镍金属伴侣蛋白，对于尿素酶和[Ni,Fe]-氢化酶的组装都是必需的[10][12][13][14][26][27][28]。特别是，HpHypA与尿素酶的激活途径中的同源二聚体UreE2以及氢化酶异二聚体的大亚基HyhL相互作用[10]，因此它处于Hp代谢关键酶激活的交叉口。

HpHypA包含两个具有不同功能的金属位点（图1）：一个高亲和力的结构型Zn(II)位点，由四个保守的半胱氨酸残基组成，用于稳定蛋白质折叠；另一个低亲和力的Ni(II)位点，负责将镍递送到下游的成熟伴侣蛋白，最终传递给目标酶[29][30][31][32]。虽然野生型apo Zn-HpHypA的溶液结构已经确定[31]，但Ni(II)结合后形成holo形式（Ni,Zn-HpHypA）的结构和动态变化仍不清楚。因此，了解Ni(II)结合如何影响HpHypA的结构和动态对于阐明其递送机制至关重要。定点突变实验结合光谱证据表明，野生型HpHypA中Ni(II)位点由Met1的氨基N原子、His2和Glu3的酰胺N原子、His2的侧链咪唑N原子以及Glu3和Asp40（后者位于面向N末端的螺旋-2的起始处）的羧酸O原子组成[13][27][28][31]（图1）。

**2. 材料与方法**
2.1. 蛋白质生产和纯化
按照先前的方法[31]，表达了均匀标记有15N的Zn-HpHypA（[U15N] Zn-HpHypA）并进行纯化。NMR样品中含有约1 mM的[U15N] Zn-HpHypA，溶解在20 mM的HEPES（pH 7.2）、200 mM的NaCl、1 mM的TCEP和10%的D2O（“NMR缓冲液”中）。对于holo样品，在相同的缓冲液中加入1.1当量的Ni(II)作为浓缩的NiSO4溶液。样品在液氮中快速冷冻，储存于-80°C，并在测量前立即解冻。在本研究中，“Zn-HpHypA (apo)”指的是不含其他金属离子（仅含有一个Ni(II)当量）的纯化蛋白，这一点通过电感耦合等离子体光学发射光谱（ICP-OES）方法进行了验证[60]。“Ni,Zn-HpHypA (holo)”表示额外结合了一个Ni(II)当量的蛋白。

2.2. 15N松弛参数的测定
进行了骨架15N NMR松弛实验，以确定纵向（R1 = 1/T1）和横向（R2 = 1/T2）松弛率，以及稳态异核1H15N NOE（以下简称NOE）。数据是在16.44°C下获取的（对应于1H拉莫频率700.13 MHz）。所有实验均采用相位敏感的脉冲序列，并在采集过程中进行质子解耦[54][58]。具体来说，分别使用Bruker的脉冲程序hsqct1etf3gpsi（采用1H 180°脉冲代替连续波复合脉冲解耦）、hsqct2etf3gpsi_large（允许最短延迟为8.48 ms，并通过应用“无负载”CPMG–T?循环来提高温度稳定性和重复性）以及hsqcnoef3gpsi来收集R1、R2和NOE数据。R1速率通过从10到1600 ms的十个松弛延迟来获得，以减少系统误差。R2速率使用Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）自旋回波松弛延迟（十个点）进行测量，延迟范围为8.48至169.60 ms。R1和R2实验均使用了3.5 s的循环延迟。NOE值是通过记录有无1H预饱和（3 s）条件的HSQC光谱获得的。所有光谱均使用TopSpin 4.5.0（Bruker）软件进行处理，并采用了一致的参数设置（窗口函数、零填充、削波和相位校正）。Zn-HpHypA和Ni,Zn-HpHypA的公开分配信息[31]也被用于峰强度的提取。峰值强度使用Dynamics Center 2.8.8（Bruker）软件进行提取。R1和R2速率通过将信号强度衰减拟合到双参数单指数模型来获得，采用了Simplex和Levenberg-Marquard算法。不确定性通过蒙特卡洛模拟（95%置信水平）进行估算。NOE值是通过饱和与非饱和光谱峰强度的比值计算得出的；强度不确定性源自基线噪声的标准偏差。

2.3. NMR松弛数据的无模型分析
进行了骨架动态的定量分析，以确定Zn-HpHypA和Ni,Zn-HpHypA中的运动幅度和时间尺度。分析采用了扩展的Lipari-Szabo无模型形式[53][62][63]以及Abagam-Redfield的15N松弛处理[64]（公式（1）、（2）、（3））。在此框架下，实验可观测量R1、R2和1H15N NOE表示为五个光谱密度J(ωi)（s）的线性组合，这些光谱密度量化了在ω = 0、ωH、ωN和ωH±ωN时的运动诱导磁场波动强度；另外还有一个Rex（s?1）项，用于解释μs–ms范围内的构象交换宽度（公式（1）、（2）、（3）。

（1）R1s?1 = dJωH?ωN + 3JωN + 6JωH + ωN + cJωN
（2）R2s?1 = d24J0 + JωH?ωN + 3JωN + 6JωH + 6JωH + ωN + c64J0 + 3JωN + Rex
（3）II0 = η = NOE = 1 + γHγNσNH
R1；σNH = d6JωH + ωN?JωH?ωN

在这些公式中，d和c分别是偶极（1H - 15N）和15N化学位移各向异性（CSA）相互作用常数：
（4）ds?2 = 1/4μ04π2γH2γN2?2rNH
（5）cs?2 = γN2B02Δσ2

松弛计算中使用的常数包括：μ0 = 真空磁导率 = 4π × 10?7 T；? = 缩小普朗克常数 = 1.0545718 × 10?34 J s；γH = 1H旋磁比 = 2.675221·10? T?1；γN = 15N旋磁比 = ?2.71262·10? T?1；rNH = N-H键长 = 1.02·10?10 m；Δσ = 轴向对称的15N CSA = ?172 ppm。异核 cross 相关率σNH（s?1）仅依赖于d和J(ωH ± ωN)，因此可以对快速（ps–ns）的NH矢量运动敏感，通过稳态NOE增强σNH可以降低NOE增强效果。通常用于报告异核“NOE”的参数实际上是（1 – NOE）：如果NH键是刚性的，交叉相关率σNH更有效，导致较高的NOE值（I?I0，I/I0?1且“NOE”?1）；如果NH键在ps–ns时间尺度上具有流动性，交叉相关率σNH效率较低，导致较低的NOE值（II0，I/I0>1且“NOE”<0）。每个光谱密度J(ω)都是使用描述整体翻滚和内部运动的洛伦兹项进行建模的。这种处理可以得到整体旋转相关时间τm、ps-ns内部运动的有效相关时间τe，以及报告NH键矢量空间限制的广义序参量（S2）。S2的范围是从1（刚性矢量）到0（完全无序）；在圆锥模型中，S=123cos2θ?1。光谱密度函数与τm、τe和S2参数之间的关系取决于扩散张量的对称性（各向同性、轴对称或半各向同性或各向异性）。对于各向同性翻滚，光谱密度函数由以下公式给出：(6)Jωi=25S2τm?1+ωiτm2+1?S2τc1+ωiτc2，其中τc?1=τm?1+τe?1。这个表达式可以扩展[63]以包括快速和慢速内部运动，其序参量分别为Sf和Ss（S2=Sf2·Ss2，公式7）。对于各向同性旋转，τm与各向同性旋转扩散系数Dr（s?1）的关系为τm=1/(6Dr)。（7）Jω=25·S2τm1+ωτm2+Sf2?S2τ1+ωτ2=25·Sf2·Ss2τm1+ωτm2+1?Ss2τ1+ωτ2。大多数蛋白质并不是各向同性的，它们会沿着每个轴以不同的相关时间进行各向异性翻滚。这种行为可以通过一个扩散张量（一个对称的3×3矩阵）来描述，其对角线元素分别为Dxx、Dyy和Dzz（其中Dxx≤Dyy≤Dzz）。在全各向异性的情况下，光谱密度成为五个相关时间τj的加权和，权重分别为Aj：(8)Jωi=25·Sf2·∑j=1/5AjSs2τj1+ωiτj2+1?Ss2τj′1+ωiτj′2，其中τ'j?1=τj?1+τe?1，τj和Aj是Dxx、Dyy、Dzz的组合[65]。Dxx、Dyy和Dzz的值决定了椭球体的各向异性和菱形度，因此如果Dxx≈Dyy≤Dzz，则张量是轴对称的，在这种情况下，光谱密度函数简化为三个项的和：(9)Jωi=25·Sf2·∑j=1/3AjSs2τj1+ωiτj2+1?Ss2τj′1+ωiτj′2。扩散张量还由其主轴的方向（欧拉角）相对于分子参考框架来定义，这通常来自原子结构[66]。因此，从R1、R2和NOE数据中提取τm、τe和S2以及Rex需要确定旋转扩散模型及其张量参数。

在Dynamics Center 2.8.8（Bruker）中使用NOE/T1/T2无模型模块通过逐步程序进行了无模型分析。首先通过排除NOE<0.65的残基（快速局部运动）、显示出构象交换迹象的残基（其特征是T2T1?T1ˉ/T1诊断）[56]、[66]来识别刚性NH矢量。对于Zn-HpHypA和Ni,Zn-HpHypA，分别得到了56个和41个这样的残基。然后通过使用简化的松弛方程形式拟合这些残基的R2/R1比值来估计初始的各向同性τm值，忽略Rex并假设J(ωi)仅依赖于各向同性翻滚[58]。得到的各向同性τm值分别为Zn-HpHypA为9.71±0.77 ns，Ni,Zn-HpHypA为8.38±0.61 ns。这些值被用作拟合扩散张量的起始猜测，这需要知道NH键的方向；这些方向是从Zn-HpHypA的中间NMR结构[31]中得出的。通过最小化观察到的R?/R?比值与预测值之间的差异来优化张量参数（Dxx、Dyy、Dzz和欧拉角）。主要扩散分量和派生量在表1中报告，表明两种蛋白质形式都具有长椭球体扩散张量，这与溶液结构[31]一致。

表1. apo和holo HpHypA的扩散张量参数。
| 参数 | Zn-HpHypA | Ni,Zn-HpHypA |
|------------------|------------------|------------------|
| Dxx (MHz) | 14.8±0.1 | 16.6±0.2 |
| Dyy (MHz) | 15.8±0.1 | 18.3±0.2 |
| Dzz (MHz) | 20.5±0.1 | 23.7±0.2 |
| Anisotropy | 1.34 | 1.36 |
| Rhombicity | 0.29 | 0.41 |
| Dr (MHz) | 17.0 | 19.5 |
| τm (ns) | 9.80 | 8.55 |
| Volume (V, s3/2) | 6.05×10?1 | 14.94×10?1 |
| Radius (R, s1/2) | 2.43×10?? | 2.28×10?? |
| a | | |
| Anisotropy = 2Dzz/Dxx + Dyy | | |
| b | Rhombicity = 3(Dyy?Dxx)/Dzz?1 | |
| c | Dr = Dxx + Dyy + Dzz | |
| d | τm = 1/√(6Dr) | |
| e | V = 4π/√(1/Dxx) | |

然后使用Dynamics Center中实现的张量无模型（TM1-TM5）对R1、R2和NOE进行残基特定的拟合，这些模型在包含的内部运动项上有所不同：TM1仅拟合S2；TM2拟合S2和τe；TM3拟合S2和Rex；TM4使用S2、τe和Rex；TM5是一个扩展模型，其中内部运动由一个快速分量（S2f，τf近似为零）和一个由S2和τs描述的较慢分量表示。由于相关时间τj是扩散张量分量的线性组合，这些残基特定的拟合也会细化扩散张量。对于每个残基，Dynamics Center尝试了所有TM1–TM5的拟合，并拒绝了失败的优化或非物理解（例如，0≤S2≤1、非负的Rex，或者违反约束条件如S2f≥S2对于TM5）。因此，Dynamics Center为每个候选模型报告了一个残基特定的赤池信息量准则（AIC）值；然而，由于AIC可能受到实验不确定性（特别是NOE值的误差）的强烈影响，采用了一种保守的模型选择程序，该程序结合了AIC和Dynamics Center的星号拟合质量指标。具体来说，当一个或多个模型被星号标记（表示拟合的R1和R2值在2%的误差范围内再现实验值）时，选择的模型是在这些带星号的解决方案中最简单的（即，TM1优先于TM2/TM3，TM2/TM3优先于TM4/TM5）；如果没有带星号的模型，则选择AIC最小的模型，最终选择是在ΔAIC≤2范围内的最简单模型。从选定模型中提取每个残基的无模型参数；对于所有成功的拟合，都获得了S2，而Rex和τe仅在选定的模型中可用（TM3/TM4中可以获得Rex；TM2/TM4中可以获得τe）。然后将得到的残基特定参数组装起来，用于Zn-HpHypA和Ni,Zn-HpHypA，并作为残基编号的函数绘制出来，以可视化Ni(II)结合时主链动力学的变化（图4）。

3. 结果
由于获得了Zn-HpHypA（图2）及其全长形式Ni,Zn-HpHypA [31]的1H,15N HSQC光谱的分配，因此可以具体比较两种金属化状态下的主链动力学。图3显示了在16.4℃时Zn–HpHypA和Ni,Zn–HpHypA的15N R1、R2和NOE值。为apo蛋白中的114个残基和全长蛋白中的102个残基确定了松弛参数。全长蛋白中Ni(II)位点附近的共振峰被拓宽到无法检测的程度，这与之前报告的顺磁松弛增强一致[31]。

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图2. 在pH 7.2时，apo-HpHypA的1H,15N HSQC光谱（900 MHz）。光谱显示了蛋白质主链中各酰胺峰的相对位置，每个峰代表一个NH对。单个峰的分配以包含单字母氨基酸代码和相应残基编号的标签显示。峰的位置相对于ω1和ω2维度的1H和15N化学位移刻度（ppm刻度）。还显示了与谷氨酰胺/天冬酰胺残基的酰胺基团对应的信号对，用线条连接HD21/HE21（左侧峰）和HD22/HE22（右侧峰）的质子信号。

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图3. 在16.4℃下测量的Zn-HpHypA（红点）和Ni,Zn-HpHypA（蓝点）的主链15N松弛参数（NOE、R1、R2和R2/R1）。值沿着HpHypA序列进行绘制。误差条代表来自蒙特卡洛分析的95%置信区间。缺失的值对应于未分配或未检测到的共振峰，包括在全长状态下扩宽的Ni(II)邻近位点。（关于此图例中颜色的解释，请参阅本文的网页版本。）

通过对松弛剖面（图3）的定性检查，可以识别出全局趋势和局部动态特征（图5）。对于Zn-HpHypA，平均NOE值0.70±0.09表明在ps-ns时间尺度上主链基本上是刚性的。正如预期的那样，在C末端尾部观察到显著降低的NOE值，这与增强的灵活性一致。其他NOE降低的区域包括残基55–60（连接螺旋α2和β2链）和残基81–93（β4链和β5链之间的长环），这表明这些片段存在局部快速动力学。这些灵活区域也存在于Ni,Zn-HpHypA中，其平均NOE基本不变（0.70±0.10），表明Ni(II)结合并未显著影响快速主链运动。在大部分序列中，R1值在两种金属化状态下相对均匀，这与整体翻滚的贡献一致。在Zn-HpHypA中（平均R1=1.22±0.13 s?1），螺旋α2（残基41–54）的R1值略低于平均值，表明该区域的 主链受到局部限制；在Ni,Zn–HpHypA中由于Ni引起的线宽化，这一区域不可观察（平均R1=1.29±0.12 s?1）。R2值（apo和全长蛋白的平均R2分别为15.4±3.6和13.3±4.1 s?1）在整个蛋白质序列中也相对均匀。一致地，大多数残基沿序列的R2/R1比率相对均匀（apo和全长HpHypA的平均R2/R1分别为12.8±3.4和10.4±3.4），再次表明松弛主要由整体翻滚和局部快速运动主导。然而，连接螺旋α2和β2链的残基58–60区域（图5）在两种金属化状态下显示出显著高的R2和R2/R1值，表明在μs–ms时间尺度上存在显著的交换贡献。值得注意的是，连接镍结合域和锌结合域的残基68–71和102–106在松弛参数上没有显示出异常，表明在这些实验的灵敏度范围内没有大的域间运动。总体而言，定性的松弛剖面显示出在ps–ns时间尺度上相似的平均快速主链移动性；全长蛋白略高的平均R1以及较低的R2和R2/R1表明Ni,Zn-HpHypA的构象交换较少和/或整体旋转扩散比apo状态更快。

为了定义Ni(II)结合对HpHypA溶液主链动力学的影响，通过将15N松弛率表达在Abragam–Redfield处理[64]中，并使用Lipari–Szabo无模型形式主义[53]、[62]、[63]对键矢量动力学进行建模来定量分析15N松弛数据。获得的参数显示在图4中。对于两种金属化状态，蛋白质在ps–ns时间尺度上仍然总体上保持良好有序，如大多数序列中的较高主链序参量S2值（apo和全长HpHypA均为0.81±0.13）所示。这两种状态显示出大致相似的动态剖面，移动性限制在少数几个局部区域。在选定的片段中观察到较低的S2值，特别是在残基约30–40、约80–90以及C端，描述了两种状态下的增强局部灵活性（图5）。相应的内部相关时间τe通常在几百皮秒范围内，这与受限的快速内部运动一致，而不是广泛的无序。无模型分析的一个显著特征是在两种形式中都以残基约60为中心的μs–ms范围内存在构象交换贡献（图5）。

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图4. Zn-HpHypA（红色）和Ni,Zn-HpHypA（蓝色）的无模型参数。顶部：报告ps–ns内部运动幅度的残基特定主链序参量（S2）。中部：报告μs–ms动力学的横向松弛贡献（Rex，s?1）。底部：支持包含快速内部时间尺度的残基的内部相关时间（τe，ps）。（关于此图例中颜色的解释，请参阅本文的网页版本。）
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图5. 根据松弛参数（红色：受低1H15N HOE影响的残基；橙色：受构象交换影响和可测量R2的残基；青色：受低S2值影响的残基）着色的Zn-HpHypA（PDB代码6G81）的NMR集合带状图。图中标出了N端和C端的位置，以及Zn原子的位置。该图使用PyMol 2.6.2（Schr?dinger, LLC的PyMOL分子图形系统）制作。（关于此图例中颜色的解释，请参阅本文的网页版本。）

这些结果表明Ni(II)结合对ps-ns主链灵活性的影响是有限的。另一方面，从这项分析中得出的精炼的旋转扩散张量参数（表1中报告）表明Ni,Zn-HpHypA的翻滚速度显著快于Zn-HpHypA。特别是，扩散张量的所有主成分在Ni(II)结合后都会增加，因此各向同性的平均扩散系数也随之增加，同时整体相关时间减少。由此衍生的有效流体动力学体积和半径在全蛋白状态下也相应减小。相比之下，扩散各向异性基本保持不变，而菱形度增加，这表明Ni(II)的结合影响了质量和/或形状的详细分布，但并未显著改变整体各向异性程度。这些数据表明，Ni(II)的结合使Zn-HpHypA转变为一个更快速翻转、更紧凑的溶解状态，同时保持了整体的核心动态行为。据估计，Ni(II)结合后Zn-HpHypA的旋转扩散系数增加了约15%，相应的τm减小，这意味着全蛋白状态的有效流体动力学半径Rh减小。作为初步近似，可以使用Stokes-Einstein-Debye方程[67]:(11)Dr=kBT/8πηRh3来推断Rhholo/Rhapo≈0.96：这个值与表1.4中报告的流体动力学半径比值（0.94）一致。

讨论：幽门螺杆菌中的镍离子运输必须满足相互冲突的要求：Ni(II)必须足够牢固地结合以避免意外隔离或毒性，同时载体必须保持足够的动态性以交换伙伴并将金属离子传递到尿素酶和[Ni,Fe]-氢化酶的成熟途径。HpHypA在这些要求的交汇点发挥作用，将金属结合与蛋白质-蛋白质识别耦合起来，引导Ni(II)朝向下游的伙伴伴侣分子，如尿素酶伴侣UreE2或[Ni,Fe]-氢化酶的大亚基HyhL，从而最终支持相应酶的激活[10]。这项工作的核心结论是，Ni(II)的结合使Zn-HpHypA的构象集合向一个更加紧凑的溶解状态转变，这通过旋转扩散系数的增加得到了证明。相比之下，apo和holo形式中的残基解析模型自由参数总体上相似，表明镍离子的加载并没有广泛地重新组织ps–ns核心的动态行为。HpHypA–UreE2系统的热力学行为为解释这些观察结果提供了补充框架[32]。量热测量（表2）显示，Ni(II)与Zn-HpHypA的结合相对较弱，伴随着适度的焓变化和较大的熵增益；而Ni(II)与HpUreE2的结合则主要由焓驱动，并且熵变不利。在没有Ni(II)的情况下，Zn-HpHypA和HpUreE2形成微摩尔的Zn-HpHypA•HpUreE2复合物；而Ni(II)的存在使得三元Ni,Zn-HpHypA•HpUreE2复合物更加稳定，其稳定性主要由较大的焓增益主导，并伴随着较小的熵增益。ITC中的熵项反映了平移/旋转、溶剂化和构象成分的净平衡。在这个背景下，NMR证据与Ni(II)修改集合向更紧凑状态的情景一致，并促进了识别几何结构的形成，如果Ni(II)参与了界面处的共享配位环境，那么可以产生大的焓增益[32]；同时，由于三元复合物施加了更严格的几何限制并减少了可访问的界面微观状态的数量，整体熵项变得不那么有利。

表2. HpHypA、HpUreE2和Ni(II)结合的量热数据[32]：
| | | | | |
|---------|-------------|-------------|-------------|-------------|
| Zn-HpHypA | + Ni(II) | HpUreE2 | + Ni(II) | Zn-HpHypA | + HpUreE2 |
| | 0.90 ± 0.04 μM | 0.294 ± 0.09 μM | 0.84 ± 0.01 μM | 0.15 ± 0.09 nm | ΔΗ (kcal mol?1) | ?0.83 ± 0.02 |
| | ?1 | 11.58 ± 0.03 | ?6.33 ± 0.01 | ?12.42 ± 0.02 | ΔS (cal mol?1 K?1) | +24.9 |
| | +6.56 | +3.22 | ?8.23 ± 0.03 | ?8.91 ± 0.03 | ?8.28 ± 0.02 | ?13.38 ± 0.03 |

这种解释证实了旋转扩散和量热数据：如果Ni(II)使Zn-HpHypA向更紧凑的构象转变，那么伙伴分子的相遇可能来自更有限的起始几何结构集合，从而增加了高效复合体形成的概率，而无需在ps–ns核心灵活性上做出大的变化。同时，一旦形成了金属桥接的复合体，定向且高度受限的配位化学可以优化界面处的包装和静电作用，驱动较大的负ΔH。同样的限制——即紧密的配位和优化的接触几何结构——可以减少界面处的构型自由度，并降低溶剂-熵增益，产生了金属锁定复合体常见的焓/熵分配特征。从这个角度来看，Ni(II)不仅通过孤立位点之间的亲和力梯度提供特异性和方向性，还通过稳定一个具有较大焓收益的中间状态来发挥作用。对于Cu(I)的运输也有类似的行为记录[34][35][36][37]。尽管Ni(II)和Cu(I)的配位化学有所不同，但共同的原则是金属直接参与组装一个有效的蛋白质间状态，而不是作为在独立位点之间自由扩散的配体进行交换。值得注意的是，最近详细描述了幽门螺杆菌中Ni(II)触发的变构反应：19F NMR光谱证据[38]和后续的机制研究[39]表明，Ni(II)与apo-HpNikR的结合诱导了一种变构效应，降低了蛋白质的流动性，并使构象平衡向结合DNA和更刚性的状态转变，这与此处观察到的HypA样本的Ni(II)依赖的集合变窄现象相呼应。

HpHypA全蛋白状态增加紧凑性的合理结构基础可能在于Ni(II)结合位点的架构：金属配位域涉及Met1的N末端氨基N原子、His2和Glu3的脱质子化骨架酰胺N原子、His2的咪唑Nδ原子、Glu3的一个羧酸O原子，因此形成了所谓的MHE基序。关键的是，配位还包括Asp40侧链羧酸的一个Oδ原子[31]，该原子位于α2螺旋的C末端，面对α1螺旋（图1）。这种 latter相互作用可能负责α1和α2螺旋的更紧密包装，为观察到的全蛋白状态下减小的流体动力学半径和体积提供了结构上的解释。发现整体压缩仅伴随着残基级别的ps–ns动态的适度变化，这与一种包装效应一致，这种效应改变了螺旋间的几何结构和整体形状，而不是抑制快速的骨架波动。这些结果对HpHypA•HpUreE2网络内的传递机制有影响。该机制必须涉及打破HpHypA和HpUreE2之间的金属桥，据报道这包括HpUreE2相邻单体上的两个保守的His102A和His102B[32]以及HpHypA的MHE基序，并将Ni(II)转变为仅与HpUreE2配位的模式，已知这种模式还包括His102A和His102B以及位于同源二聚体长C末端尾巴上的His152A和His152B[68]。这个过程可能会将后者冻结在不利于与HypA结合的构象中，同时增加HpHypA的构象灵活性，从而导致熵的增加，这有助于apo-HpHypA的释放。Ni-HpHypA•HpUreE2三元复合物的高稳定性表明，镍的转移不太可能仅通过从HpHypA简单 dissociation 然后被HpUreE2捕获来控制。相反，转移可能需要与推动路径前进的额外事件耦合，例如HpUreE2与下游组分（例如HpUreG）的结合，有效地将Ni(II)拉向下一个成熟步骤[10][69]。

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Stefano Ciurli：写作——审阅与编辑，写作——原始草案，方法学，研究，资金获取，正式分析，数据管理，概念化。
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Frans A.A. Mulder：写作——审阅与编辑，方法学，概念化。