寻找细菌细胞色素c过氧化物酶构成活性的基础

《Journal of Inorganic Biochemistry》：Searching for the basis of constitutive activity in bacterial cytochrome c peroxidases

【字体：大中小】 时间：2026年05月07日 来源：Journal of Inorganic Biochemistry 3.2

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　　帕特里克·H·休伊特（Patrick H. Hewitt）| 马科斯·塔皮亚斯（Marcos Tapias）| 马修·A·康格（Matthew A. Conger）| 肖恩·J·埃利奥特（Sean J. Elliott）波士顿大学化学系，24 Cummington Mall，房间

帕特里克·H·休伊特（Patrick H. Hewitt）| 马科斯·塔皮亚斯（Marcos Tapias）| 马修·A·康格（Matthew A. Conger）| 肖恩·J·埃利奥特（Sean J. Elliott）

波士顿大学化学系，24 Cummington Mall，房间1016，波士顿，MA 02215，美国

摘要

细菌细胞色素c过氧化物酶的特点是具有c型过氧化活性位点，以及与电子转移相关的六配位His/Met结合的c型血红素。大多数已报道的bCcPs在两种血红素都处于三价铁（铁氧态）时是不活性的。对于这些bCcPs，只有当His/Met结合的血红素首先被还原为二价铁状态时，过氧化血红素环境才准备好进行催化。相比之下，来自Nitrosomonas europaea（Ne）和Methylococcus capsulatus（Mc）的bCcP家族成员据报道在二价铁状态下是活性的。Ne酶已被证明是结构研究、突变分析和光谱研究的理想工具，而Mc酶仅在天然状态下被报道过，并且仅部分表征。在这里，我们报告了Mc酶的重组表达，并发现其反应性与Ne系统非常一致。生物信息学分析并未显示Mc和Ne酶之间存在主要序列相似性，这可能使它们区别于可激活的bCcPs。系统发育分析进一步支持了Ne酶位于包含可激活酶的演化支中的事实。这些数据共同表明，Mc酶可能是探究bCcP家族成员反应性的另一个有用平台。

引言

细菌细胞色素c过氧化物酶（bCcP）存在于革兰氏阴性细菌的周质中，据认为其功能是解毒过氧化氢。[1]，[2] 这类酶通常具有两个c型血红素，其中六配位的His/Met结合的血红素在电子转移（FeE）中起辅助作用，而活性位点的血红素与过氧化活性（FeP）相关（图1A）。bCcP酶还属于一个更大的超家族，包括MauG、MbnH和BthA，这些血红素也具有HexaHis/Tyr结合。MauG和MbnH作为家族成员，显著使用H2O2作为氧化剂来修饰蛋白质反应物，[1]，[2] 而BthA的反应性尚不清楚，因为它可以生成与MbnH和MauG相同的Fe(IV)物种，但其特定底物仍未知。[5] 本报告关注的是所谓的“真正”的bCcP酶，其中FeE处的His/Met配位化学产生了两种血红素不同的氧化还原电位，从而可以产生稳定的单电子还原态（FeEII FePIII）（这在类似MauG的酶中不存在）。对于大多数已表征的真正bCcPs来说，制备单电子还原态对于其活性至关重要；因为大多数报道的bCcPs在两种血红素都处于三价铁状态（FeEIII FePIII）时是动力学上不活的。具有这种特性的bCcP家族成员必须通过将FeE还原为二价铁状态来使其“激活”。许多bCcP酶的X射线晶体结构已经获得，[3]，[4]，[6]，[7]，[8]，[9]，[10]，[11]，其中一些处于最高氧化态。[6]，[7]，[8]，[9] 完全氧化的可激活酶缺乏活性的结构基础与其高度保守的含His环的构象有关，该环的排列使得His与FeP结合，阻挡了H2O2接触血红素铁（图1A，B）。由于激活是通过还原另一个血红素铁FeE实现的，因此注意到在激活过程中三个环会发生重组，最终将远端的His从FeP位置置换出来，使活性位点的血红素铁能够结合过氧化物（图1C）。几种可激活bCcP在活性和非活性形式的X射线晶体结构很好地支持了这种构象变化模型。[3]，[6]，[7]，[8]，[9]，[11]

虽然未激活（非活性）和激活（活性）形式的bCcP的构象很清楚，但控制开放和闭合构象的分子因素尚不完全清楚，因为已有两种bCcP被报道不需要还原激活化学反应，却具有与可激活bCcP相似的整体折叠（图1A），并且它们具有相同的His，这种His可能作为过氧化血红素的配体。Nitrosomonas europaea（Ne）酶的X射线结构显示，即使在完全氧化状态下，其折叠和含His的Loop 1也已经是激活构象（图1A，C）。我们将这些酶称为“天然活性”的，因为它们不需要外源性氧化还原激活。在这篇报告中，我们探讨了是否可以从一级氨基酸序列的水平预测真正bCcP的活性特性。

我们解决这些问题的方法是从比较两种已报道的天然活性酶开始。Ne酶既来自天然生物体[4]，[12]，也在重组表达系统中获得[13]，[14]，[15]，在这两种情况下，该酶都不需要预还原即可表现出活性。未经氧化还原激活的Ne bCcP的X射线晶体结构清楚地显示了与可激活酶的相同整体折叠，[4]例如Pseudomonas aeruginosa（Pa）的半还原活性形式（图1A）。[3] Einsle及其同事对可激活的Geobacter sulfureducens（Gs）CcpA中的移动环进行了突变，以近似Ne的序列，但在任何情况下都没有实现天然活性酶的活性。[8] Methylococcus capsulatus（Mc）酶是唯一另一种据报道不需要激活的bCcP。该酶最初由DiSpirito及其同事从天然生物体中制备，并证明在基于溶液的测定中，无论是否激活FeE血红素，都能达到相同的活性。[16] 在这里，我们制备了Mc酶的重组版本，以便进一步研究其性质，特别是与新获得的（电）催化数据[13]，[17]，[18]和光谱数据[14]（这些数据在DiSpirito等人最初报告时尚未可用）。我们证明Mc酶是另一种天然活性bCcp酶的模型。最后，我们还进行了生物信息学分析，以确定一级序列的哪些特征可能导致Ne和Mc酶之间的相似性，假设它们的活性相似性可能与保守的序列元素有关。值得注意的是，我们发现这两种天然活性酶的反应性不能仅用一级序列来解释，而且令人惊讶的是，从系统发育学上来看，Ne酶与其他可激活的bCcP家族成员更为接近。

节选

质粒构建

Mc bCcP的蛋白质序列来自NCBI基因组的Methylococcus capsulatus基因组，使用注释的位置标签MCA0345（蛋白质ID：AAU90559.1，Uniprot ID：Q60BW8）。[19] 用于大肠杆菌（E. coli）优化的DNA序列被合成并插入pET21+载体中。在蛋白质的N端还加入了一个OmpA引导序列，以便将其输出到周质中。

Mc bCcP的制备

Mc bCcP被创建为一个无标签的构建体，其密码子经过优化，适用于大肠杆菌（E. coli）的表达，并包含了用于细胞色素c结合的pEC86质粒。纯化后，单独分离的酶在SDS-PAGE上显示为单一条带，A405/A280比为2.81（图2），与原始纯化报告的值2.66相似[16]。通过尺寸排阻色谱（SEC）估计Mc bCcP在溶液中的分子量约为63 kDa。

讨论

在这里，我们探讨了什么决定了bCcP_MauG超家族中真正bCcP酶的明显天然活性。为此，我们重新研究了1997年Zahn和DiSpirito首次报道的M. capsulatus（Bath）中的双血红素bCcP，注意到它具有类似Ne酶的能力，可以在氧化状态下催化H2O2的还原。[16] 我们准备了Mc bCcP的重组版本，以便对其进行更详细的研究

结论

通过研究其电催化和动力学行为，以及与其与H2O2反应后形成的EPR可检测物种，我们证明了Mc bCcP是另一种在完全氧化状态下活性的bCcP家族成员，类似于Ne bCcP。因此，Mc酶可能是探索超越一级序列的天然活性分子决定因素的另一个酶学系统。然而，我们的生物信息学分析表明，当两者

CRediT作者贡献声明

帕特里克·H·休伊特（Patrick H. Hewitt）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，监督，资源，正式分析，数据管理。马科斯·塔皮亚斯（Marcos Tapias）：资源，研究，正式分析。马修·A·康格（Matthew A. Conger）：撰写 – 原稿，可视化，研究，正式分析。肖恩·J·埃利奥特（Sean J. Elliott）：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，监督，资金获取。

利益冲突声明

不存在利益冲突。

致谢

这项研究工作得到了国家通用医学科学研究所和国立卫生研究院的支持，通过MIRA奖项（R35 GM136294）资助给SJE。M.T.衷心感谢NIH本科生研究培训计划（U-RISE）在

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摘要

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质粒构建

Mc bCcP的制备

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