病原体大小对巨型蜈蚣（Scolopendra mutilans）血细胞功能特化的调控

《Journal of Invertebrate Pathology》：Pathogen size–dependent functional specialization of hemocytes in the giant centipede Scolopendra mutilans

　　

崔泰允|李刚勋|李秀俊|李俊镐|赵赛尤

韩国江原道春川市江原国立大学农业与生命科学学院植物医学系，24341

摘要

节肢动物完全依赖于先天免疫；然而，多足类动物的细胞免疫机制仍然知之甚少。在这里，我们对巨型蜈蚣〈Scolopendra mutilans〉中的血细胞介导的免疫进行了细胞类型解析分析。我们建立了一种长期的体外血细胞培养系统，结合了活细胞成像和功能性免疫挑战实验。血细胞被分为粒细胞、血浆细胞和前血细胞。当暴露于大肠杆菌（Escherichia coli）时，粒细胞迅速表现出吞噬行为，并成为观察到的主要吞噬效应细胞，在1小时内完成吞噬和溶酶体激活。相比之下，诸如Sephadex珠子这样的大颗粒物引发的反应主要由血浆细胞主导，粒细胞在早期也参与了其中。差异化的血细胞计数显示，在感染初期循环中的粒细胞迅速减少，而前血细胞数量增加。微管的药理学抑制损害了粒细胞的伪足形成和血浆细胞的扩散，表明免疫功能依赖于细胞骨架。这些发现共同表明了蜈蚣血细胞的功能特化依赖于病原体的大小，并将节肢动物的细胞免疫研究扩展到了昆虫模型之外。

引言

节肢动物占地球上已知动物物种的80%以上，作为捕食者、分解者和疾病传播者占据着广泛的生态位（Edgecombe和Giribet，2007；Zhang，2011）。它们显著的进化成功与其高效的免疫防御机制密切相关，这些机制使它们能够在持续暴露于病原微生物和寄生虫的情况下生存（Sadd和Schmid Hempel，2009）。与脊椎动物不同，节肢动物缺乏适应性免疫，完全依赖于进化上保守的先天免疫机制来防御宿主（Lemaitre和Hoffmann，2007）。节肢动物的先天免疫可以大致分为体液免疫和细胞免疫两种成分。体液免疫涉及识别病原体相关的分子模式（PAMPs），并随后诱导抗菌肽（AMPs）和黑色素化级联反应（Nappi和Christensen，2005；Manniello等人，2021）。相比之下，细胞免疫是由循环在血淋巴中的血细胞介导的，通过吞噬、包封、形成结节、伤口愈合和凝血提供快速而局部的防御（Theopold等人，2004；Strand，2008；Hillyer，2016；Tattikota等人，2020）。因此，血细胞亚型的分类及其功能角色的阐明是对节肢动物免疫策略理解的基础。

在过去的几十年中，人们在昆虫（Insecta）的血细胞生物学研究方面取得了很大进展（Lavine和Strand，2002）。例如黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）、家蚕（Bombyx mori）、甜菜粉虱（Galleria mellonella）、黄粉虫（Tenebrio molitor

相比之下，尽管多足类动物（Myriapoda），特别是蜈蚣（Chilopoda）与昆虫在系统发育上较为接近（Palmer和Jiggins，2015），但其免疫系统仍知之甚少。以往关于蜈蚣血细胞的研究，包括Lithobius forficatus和Scolopendra物种的研究，主要依赖于固定标本和描述性超微结构观察（Hilken等人，2003；Xylander，2009）。因此，缺乏关于血细胞亚型如何在体内或体外动态响应病原体挑战的实验证据。鉴于蜈蚣的生态特征——它们生活在微生物丰富的土壤环境中，且利用毒液捕食其他节肢动物和小型脊椎动物（Lewis，2007；Undheim等人，2015），这一缺口尤为明显。这样的生态压力表明，蜈蚣可能拥有强大且可能高度特化的细胞免疫机制，这些机制与昆虫中的不同。

巨型蜈蚣〈Scolopendra mutilans〉L. Koch是一种广泛分布于东亚的代表性大型蜈蚣物种，包括韩国、中国和日本（Lewis，2010）。除了作为顶级无脊椎动物捕食者的生态作用外，S. mutilans长期以来还被用于传统东亚医学，并因全基因组测序发现了与免疫相关的基因（Zhang等人，2024）以及生物活性抗菌肽（如scolopendin）而受到科学界的关注（Kong等人，2013；Yoo等人，2014；Lee等人，2015；Hu等人，2020）。尽管有这些进展，但关于免疫效应产生和病原体清除的细胞基础，即血细胞的身份、行为和潜在的功能分工，尚未在该物种中进行系统研究。迄今为止，关于蜈蚣血细胞的研究仅限于静态形态描述，留下了关于个体血细胞亚型在免疫反应中的功能角色和动态行为的关键知识空白。

在这项研究中，我们建立了一种长期的蜈蚣血细胞体外培养系统，并结合了活细胞成像和功能性免疫挑战实验，首次对〈S. mutilans〉的细胞免疫进行了细胞类型解析的分析。通过将实验血细胞免疫学扩展到多足类动物，这项研究扩展了当前的节肢动物免疫范式，并为细胞免疫策略的进化多样化提供了新的见解。具体而言，本研究旨在：（i）建立一个优化的体外培养系统，以实现S. mutilans血细胞的长期维持和实时观察；（ii）使用光学显微镜和电子显微镜对血细胞亚型进行详细的形态分类，并量化感染引起的差异血细胞计数（DHC）变化；（iii）使用大肠杆菌（Escherichia coli）和惰性模型颗粒（乳胶和Sephadex珠子）来表征负责吞噬和包封/结节的潜在效应血细胞群体。这些方法为理解蜈蚣的细胞免疫组织和功能提供了全面的框架，并为比较节肢动物的免疫提供了视角。

章节片段

动物、血淋巴收集及初级血细胞培养条件的建立

成年巨型蜈蚣（Scolopendra mutilans）从韩国江原道春川市的森林地区采集。为了与野外捕获的个体进行比较，还从忠清北道奥川郡的一个农场获取了额外的成年个体。实验前，这些动物在实验室条件下进行了适应。为了收集血淋巴，蜈蚣在-20°C下冷冻麻醉10分钟，并使用100%乙醇进行外部灭菌。

〈S. mutilans〉中血细胞的形态分类及细菌感染后的细胞组成变化

对巨型蜈蚣〈Scolopendra mutilans〉血淋巴中的血细胞进行形态分析，发现存在大小和形状各异的细胞群体（图1A）。基于综合形态分析，并结合流式细胞术的光散射特性（FSC/SSC），血细胞被分为三大类：粒细胞、血浆细胞和前血细胞。这种双重验证方法结合了高分辨率显微镜和自动化流式细胞术。

讨论

在这项研究中，我们系统地描述了巨型蜈蚣〈Scolopendra mutilans〉中血细胞的形态和功能分化，特别关注了病原体大小依赖的免疫反应。血细胞被分为三大类（粒细胞、血浆细胞和前血细胞），每种类型在形态和功能上都与昆虫中的血细胞类别有很强的相似性（Go和Cho，2022）。虽然我们认识到当前的分类

结论

在这项研究中，我们分析了巨型蜈蚣〈Scolopendra mutilans〉的细胞免疫反应，并阐明了病原体挑战后的血细胞类型及其功能角色。血细胞被分为三大类——粒细胞、血浆细胞和前血细胞——其中粒细胞在免疫激活的早期阶段表现出快速高效的吞噬作用，成为主要的效应细胞。当被大肠杆菌（Escherichia coli）和其他小

未引用的参考文献

Lin和S?derh?ll（2011）。

CRediT作者贡献声明

崔泰允：撰写——初稿，研究。李刚勋：研究。李秀俊：研究。李俊镐：研究。赵赛尤：撰写——初稿，监督，研究，概念化。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了韩国国家研究基金会（Project Number: NRF2020R1A2C1007529）的支持。