溶菌酶i1型是一种关键的抗菌酶，能够减少Litopenaeus vannamei中Ecytonucleospora hepatopenaei的感染，并具有作为饲料添加剂的潜力

《Journal of Invertebrate Pathology》：Lysozyme i1-type, a crucial antimicrobial enzyme, reduces Ecytonucleospora hepatopenaei infection in Litopenaeus vannamei with potential for feed supplementation

　　

Natthanan Rakchaya|Nutthapon Sangklai|Pattana Jaroenlak|Anchalee Tassanakajon

泰国曼谷朱拉隆功大学生物化学系分子生物学与基因组学卓越中心

摘要

Ecytonucleospora hepatopenaei（EHP）是一种与真菌相关的微孢子虫寄生虫，会感染虾。EHP会引起肝胰腺微孢子虫病（HPM），导致生长迟缓并增加对多种二次感染的易感性。然而，有效应对EHP感染的内在免疫反应仍很大程度上未知。本研究探讨了Litopenaeus vannamei溶菌酶-i1（LvLyz-i1）在虾对EHP感染反应中的作用。LvLyz-i1在EHP感染期间表达显著增加，在肝胰腺和血细胞中的表达分别上调了约13倍和约6000倍。敲低LvLyz-i1会增加EHP的数量，并改变与JAK/STAT、Toll和IMD通路相关的免疫基因的表达。重组LvLyz-i1（rLvLyz-i1）表现出对Bacillus subtilis、Staphylococcus aureus和Pichia pastoris的抗菌活性，并具有潜在的异肽酶活性。用rLvLyz-i1处理EHP孢子会损害其极管，可能是通过分解极管蛋白并减少感染性物质向宿主细胞的转移。在共同饲养7天和9天后，补充rLvLyz-i1可显著降低EHP的数量，同时增加其他抗菌肽和应激相关蛋白的表达。这些结果表明LvLyz-i1在虾的先天免疫中起着关键作用，可能成为预防EHP感染的有效策略。

引言

目前，水产养殖业是人类食物的主要来源（Ahmad等人，2021年）。然而，据报道，水产养殖产品面临着气候变化、生态系统破坏、水污染和疾病爆发等问题（Ahmed和Thompson，2019年；Handisyde等人，2017年；Sarker等人，2023年）。尤其是太平洋白虾Litopenaeus vannamei的养殖具有很高的盈利能力，这种生长迅速的物种能够耐受高密度养殖并比许多其他物种产生更高的产量（Briggs，2005年；Kobayashi等人，2015年）。最近， shrimp养殖遇到了疾病爆发的主要问题，导致产量下降（Lee等人，2008年），尤其是由微孢子虫寄生虫Ecytonucleospora hepatopenaei（EHP）引起的感染。

微孢子虫是细胞内真核病原体，与真菌密切相关。它们可以感染无脊椎动物和脊椎动物（Lee等人，2008年）。EHP是一种感染对虾的微孢子虫，最初在泰国的Penaeus monodon中被发现（Tourtip等人，2009年）。此后，EHP疫情扩散到了东南亚及其他国家，包括马来西亚、越南、印度、中国、澳大利亚和委内瑞拉（Chaijarasphong等人，2021年）。EHP感染会导致肝胰腺微孢子虫病（HPM），从而抑制生长并增加体型差异（Thitamadee等人，2016年）。虽然EHP不会导致虾死亡，但它会导致严重的体型差异，可能造成产量损失。EHP的生活周期分为两个阶段：首先是细胞外阶段，成熟的孢子破裂并萌发极管，将感染性物质注入宿主细胞；其次是细胞内阶段，寄生虫利用宿主细胞的机制繁殖孢子（Boakye等人，2017年）。EHP主要感染的虾器官是肝胰腺和白色的后肠道（Tang等人，2016年；Tangprasittipap等人，2013年）。成熟的孢子通过虾的粪便传播到另一只虾（Chaijarasphong等人，2021年）。

虾缺乏适应性免疫，主要依赖先天免疫（Kloc等人，2024年），包括吞噬作用、包囊化和细胞凋亡等细胞反应（Tran等人，2022年），以及涉及prophenoloxidase系统、凝血级联反应和抗菌肽（AMPs）的体液反应（Bouallegui，2021年；Tassanakajon等人，2018年）。JAK/STAT、Toll和IMD等信号通路调节免疫效应子和AMPs的产生，以消除病原体（Li和Xiang，2013年）。虾的AMPs包括penaeidins、抗脂多糖因子（ALFs）、crustins和溶菌酶（Destoumieux-Garzón等人，2016年）。溶菌酶是一种普遍存在的细胞酶，它可以水解肽聚糖中N-乙酰葡糖胺（NAG）和N-乙酰氨基丁酸（NAM）之间的β-(1,4)-糖苷键，通过muramidase活性破坏细菌细胞壁（Kaizu等人，2011年）。溶菌酶一般分为三种类型：c型（鸡）、g型（鹅）和i型（无脊椎动物）（Bachali等人，2002年）。在虾中，目前已鉴定出c型和i型溶菌酶（Peregrino-Uriarte等人，2012年）。

c型溶菌酶对细菌具有muramidase活性，对真菌具有酯酶活性（Sangklai等人，2024年）。i型溶菌酶或destabilase具有endo-ε-(γ-Glu)Lys异肽酶活性，可以水解肽聚糖中的赖氨酸-谷氨酸键，具有抗菌和抗真菌作用（Van Herreweghe和Michiels，2012年；Yudina等人，2012年；Zavalova等人，2010年）。在太平洋白虾中，LvLyz-i1含有类似于医用水蛭Hirudo medicinalis溶菌酶-i的destabilase结构域，表明其具有广泛的抗菌潜力（Peregrino-Uriarte等人，2012年）。在小龙虾Pacifastacus leniusculus中，i型溶菌酶表现出凝血-稳定酶活性，能够水解ε-(γ-谷氨酰)-赖氨酸异肽键，这使其被归类为凝血-稳定酶（Ekblom和S?derh?ll，2024年）。研究表明LvLyz-i1的表达会受到脂多糖（LPS）的调控（Peregrino-Uriarte等人，2012年），而LvLyz-i3表现出对多种细菌的凝集和抗菌活性（Li等人，2025年）。先前在P. monodon中的研究表明，LvLyz-i1在Vibrio harveyi感染期间表达显著增强，并对不同的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌（包括Micrococcus luteus和Vibrio属细菌）表现出抗菌活性（Supungul等人，2010年；Wu等人，2022年）。

最近我们发现LvLyz-c是一种重要的抗菌蛋白，能够抑制EHP孢子的萌发并降低其感染性（Sangklai等人，2024年）。本研究旨在探讨LvLyz-i1在虾免疫防御中的作用，特别是对抗EHP感染的作用。我们检测了EHP感染期间LvLyz-i1的表达，并通过RNA干扰研究了LvLyz-i1敲低对EHP数量和先天免疫信号的影响。重组LvLyz-i1（rLvLyz-i1）在大肠杆菌中表达，以评估其对细菌和真菌的抗菌和异肽酶活性，以及其抑制EHP感染的能力。此外，我们还评估了添加LvLyz-i1的饲料对减少EHP感染的效果。总体而言，这项工作探索了LvLyz-i1作为增强虾免疫力和减少EHP感染的潜在策略。

小节片段

微生物菌株和实验动物

为了评估重组LvLyz-i1的抗菌活性，使用了多种微生物，包括革兰氏阳性细菌（Bacillus subtilis和Staphylococcus aureus）、革兰氏阴性细菌（Vibrio parahaemolyticus、V. cholerae、V. harveyi、V. mimicus和Escherichia coli 363），以及真菌（Candida albicans和Pichia pastoris）。此外，还使用了E. coli BL21（DE3）-codonPlus菌株进行重组蛋白表达。

具体病原体-free（SPF）虾（Litopenaeus vannamei）

EHP感染期间LvLyz-i1在血细胞和肝胰腺中的表达上调

使用EF-1α作为内参基因，通过半定量RT-PCR技术检测了健康L.vannamei的肝胰腺、肌肉、血细胞、肠道、鳃、眼柄、心脏和胃中LvLyz-i1的组织特异性表达。结果显示LvLyz-i1在所有检测组织中都有表达，尤其是在肝胰腺中表达最高（图1A）。

EHP期间LvLyz-i1的表达变化

讨论

海洋无脊椎动物主要依靠先天免疫，因为它们通常缺乏适应性防御机制（Wang等人，2021年）。先天免疫系统能够识别病原体入侵，并通过细胞和体液免疫反应将其清除。在虾中，病原体相关的分子模式（PAMPs）被模式识别受体（PRRs）检测到，从而触发信号通路，诱导体液因子和AMP的产生（Bouallegui，2021年；Li和Xiang，2013年）。虾的AMPs提供

未引用的参考文献

Sukonthamarn等人（2023年）。

CRediT作者贡献声明

Natthanan Rakchaya：撰写 – 原稿撰写、方法学设计、实验研究、数据分析。Nutthapon Sangklai：撰写 – 原稿撰写、方法学设计、实验研究、数据分析。Pattana Jaroenlak：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源提供、方法学设计、概念构思。Anchalee Tassanakajon：撰写 – 审稿与编辑、验证、资金争取、数据分析、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了?泰国科学研究与创新基金、朱拉隆功大学?[项目编号?FOOD_FF_68_016_2300_004]；以及朱拉隆功大学Ratchadaphisek Somphot捐赠基金对分子生物学与基因组学卓越中心（CEMS）的支持。NS获得了朱拉隆功大学的Second Century Fund (C2F)颁发的博士学位奖学金。