自扩增RNA脂质纳米颗粒(saRNA-LNP)疫苗对猪流行性腹泻提供有效保护

《Transboundary and Emerging Diseases》：A Self-Amplifying RNA Lipid Nanoparticle (saRNA-LNP) Vaccine Provides Effective Protection Against Porcine Epidemic Diarrhea

　　

开发能够诱导持续、强效且具有成本效益的免疫力的疫苗平台仍然是兽医疫苗学的一项主要挑战，特别是对于冠状病毒而言，其疫苗诱导的保护往往持续时间较短。在此，研究人员建立了一个自扩增RNA(saRNA)脂质纳米颗粒(LNP)疫苗平台，并以猪流行性腹泻病毒(PEDV)作为代表性冠状病毒模型对其应用进行了评估。单次接种即诱导了强烈的特异性体液和细胞免疫反应。在接种后28天(dpv)，接种疫苗的仔猪表现出显著更高的PEDV-S特异性IgG和中和抗体滴度(1:160)。此外，还观察到了血清IFN-γ和IL-4水平的升高，以及CD4+和CD8+T细胞的增强。接种后的怀孕母猪在血清和初乳样本中表现出显著更高的PEDV中和抗体滴度(约1:224或256)。该saRNA-LNP疫苗不仅为免疫仔猪提供了针对PED的主动免疫保护，还通过接种疫苗母猪的初乳源性抗体为新生儿提供了被动免疫。值得注意的是，截短的刺突蛋白抗原在免疫原性方面优于全长刺突蛋白，揭示了在设计中仔细测试对该PEDV saRNA疫苗的重要性。saRNA-LNP系统代表了一种节省剂量、单剂量的疫苗平台，具有延长保护性免疫、增强母源抗体反应以及降低PEDV和其他兽医冠状病毒疫苗接种成本的潜力。

论文解读：自扩增RNA脂质纳米颗粒疫苗对抗猪流行性腹泻的机制与效能

研究背景与现状

猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种高度接触性肠道传染病，导致新生仔猪严重腹泻和高死亡率，是全球养猪业经济损失最严重的疾病之一。目前的PEDV疫苗，包括灭活疫苗、减毒活疫苗和mRNA疫苗，普遍存在保护期短（通常仅3至6个月）和需要频繁加强免疫的问题。此外，现有疫苗诱导的中和抗体滴度往往不高，且针对异源毒株的保护效果参差不齐。由于新生仔猪的存活主要依赖于母源抗体提供的被动免疫，如何通过母体免疫有效传递高水平的保护性抗体仍是巨大挑战。尽管自扩增RNA(saRNA)疫苗在非复制型mRNA基础上引入了病毒复制子，能够实现细胞内RNA的自我扩增，从而以较低剂量诱导更强、更持久的免疫反应，但该技术在大型天然宿主中的应用及其在冠状病毒防控中的潜力尚未充分表征。因此，本研究旨在建立并验证一种优化的Venezuelan马脑炎病毒(VEEV)来源的saRNA-LNP平台，以PEDV为概念验证模型，系统评估其在自然宿主中的免疫原性和保护效力。

研究方法概要

研究人员通过优化VEEV复制子的非结构蛋白2(nsP2)和poly(A)尾长度，构建了三种不同的saRNA载体变体，并通过体内生物发光成像比较其表达持久性。利用微流控合成仪制备包裹抗原的脂质纳米颗粒(LNP)，并通过动态光散射测定粒径和包封率。实验选用9日龄易感仔猪和怀孕母猪作为实验对象，分为不同组别分别接种saRNA疫苗、非复制型mRNA疫苗、商业灭活疫苗(CIV)或安慰剂(LNP)。通过间接ELISA和病毒中和试验(VNT)检测血清及初乳中的特异性IgG、IgA及中和抗体滴度。采用流式细胞术分析外周血淋巴细胞亚群比例，ELISA检测血清细胞因子水平。通过攻毒实验评估疫苗对主动免疫仔猪和通过母源抗体获得被动免疫的新生仔猪的保护效果，并结合临床评分、组织病理学分析和qRT-PCR定量粪便病毒载量进行综合判断。

研究结果

3.1 疫苗构建体的平台优化

研究人员优化了saRNA的nsP2编码区和poly(A)尾长度，构建了三种变体。小鼠体内成像显示，与非复制型mRNA组信号在15天内降至基线相比，saRNA组（特别是saRNA-2变体）表现出显著延长的荧光素酶表达持续时间，直至22至30天仍可检测到信号，证实了saRNA技术的自我扩增特性及优化的saRNA-2在维持抗原表达方面的优势。

3.2 PEDV-S saRNA疫苗的表征

基于优化的saRNA-2构建体，研究人员设计了编码PEDV S1亚基和部分S2结构域（残基735-785）的疫苗。LNP封装后的粒径约为95纳米，包封效率超过96%。体外实验表明，虽然非复制型mRNA在早期（12小时内）转录效率较高，但saRNA在24小时后介导的抗原表达量和持续时间均显著优于前者。

3.3 仔猪中的体液免疫反应

通过比较全长S蛋白与截短S蛋白(1-785aa) saRNA疫苗发现，截短版本诱导的特异性IgG和中和抗体滴度显著更高。在比较saRNA、非复制型mRNA和商业灭活疫苗(CIV)的研究中，saRNA组在接种后14至28天表现出最高的IgG水平，且中和抗体滴度持续增长至28天，显著优于mRNA组和CIV组。这表明saRNA疫苗能诱导比现有疫苗更强劲且持续的抗体反应。

3.4 仔猪细胞免疫反应的评估

流式细胞术分析显示，saRNA疫苗组仔猪外周血中CD8⁺T细胞的比例显著高于其他组。同时，saRNA组血清中Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4的浓度均显著升高，证明该疫苗能有效激活细胞免疫应答，平衡Th1/Th2反应。

3.5 PEDV-S saRNA疫苗免疫策略的优化

剂量梯度实验表明，20μg与50μg剂量组在诱导抗体和细胞免疫反应方面无显著差异，而10μg剂量效果较弱。免疫频率研究表明，单次免疫(sa-Once)与两次免疫(sa-Twice)在诱导免疫应答方面效果相当，且均优于CIV组。这确立了20μg单剂肌肉注射为最优免疫程序。

3.6 saRNA疫苗对攻毒仔猪的保护作用

在攻毒实验中，免疫仔猪仅出现轻微临床症状，肠道组织病理损伤轻微，且在攻毒后第10天完全恢复。相比之下，对照组仔猪出现严重水样腹泻和精神沉郁。qRT-PCR结果显示，免疫仔猪粪便中的病毒载量显著低于对照组，证明该疫苗能有效减轻临床病变并降低病毒排出。

3.7 妊娠母猪的体液免疫反应

怀孕母猪免疫后，血清和初乳中均检测到高水平的PEDV-S特异性IgG和IgA。中和抗体滴度在分娩时达到约1:224或256，显示出强大的体液免疫激活能力。

3.8 通过初乳转移实现哺乳仔猪的被动免疫

来自免疫母猪的哺乳仔猪在攻毒后，仅有40%出现轻度腹泻，且肠道形态基本完好；而对照组的仔猪则出现严重腹泻、呕吐甚至死亡，空肠绒毛严重萎缩。免疫组仔猪粪便中的病毒载量显著降低，证实通过母源抗体传递的被动免疫能为新生仔猪提供强有力的保护。

讨论与结论

本研究成功构建并验证了基于VEEV复制子的saRNA-LNP疫苗平台。研究发现，针对saRNA平台，截短的S蛋白抗原比全长蛋白更能有效诱导免疫反应，这可能与全长RNA分子较大导致的稳定性或翻译效率下降有关。该平台仅需单剂20μg即可诱导与传统疫苗多次免疫相当甚至更强的细胞与体液免疫应答，并能有效通过母源抗体保护新生仔猪。尽管肌肉注射诱导的黏膜IgA反应相对有限，但高水平的中和抗体与细胞免疫的协同作用足以抵御病毒攻击。该研究不仅为PEDV的防控提供了一种高效、节省剂量且生产周期短的新策略，也为其他兽医冠状病毒的疫苗研发提供了重要的技术参考。论文结论指出，这项工作突显了PEDV-S saRNA疫苗相对于商业灭活疫苗和非复制型mRNA疫苗的优越功效，并强调了saRNA技术作为一种具有成本效益的兽医疫苗开发平台的巨大潜力。