综述：功能性间充质干细胞治疗脊髓损伤的现状与展望

《Journal of Orthopaedic Translation》：Current status and future prospects of functionalized mesenchymal stem cells for the treatment of spinal cord injury

　　

脊髓损伤（SCI）是一种以复杂病理生理过程为特征的关键性神经系统疾病。继发性损伤诱导的恶劣局部微环境显著阻碍了内在的神经修复，且现有疗法的临床疗效有限。近年来，间充质干细胞（MSCs）因其基于旁分泌的治疗特性，包括免疫调节、神经营养因子分泌和促进血管生成等，引起了广泛关注。然而，传统的MSCs移植面临着细胞注射后存活率低、归巢能力不足以及在损伤后不利微环境中治疗效果差等重大障碍。因此，对MSCs进行“功能化”以增强其治疗潜力至关重要。本文系统综述了三种主要的MSC功能化策略：基于生物材料的递送平台、基因工程方法以及药物或物理协同疗法。临床前证据表明，这些策略可协同改善运动功能恢复、促进轴突再生和髓鞘形成，并抑制炎症反应。总体而言，功能性MSC治疗显示出比传统细胞移植更大的治疗前景。未来的研究应优先考虑安全性、标准化和大规模生产相关的挑战以支持临床转化，并进一步探索多模式功能整合及智能响应型干细胞系统，以实现SCI治疗的突破。

1. 引言

脊髓损伤（SCI）被公认为一种影响中枢神经系统的致残性创伤，主要由外部机械冲击引起。全球范围内，SCI的年发病率估计为每百万人10.5至83.0例。受累患者通常遭受感觉、运动和自主功能的严重损害，给患者、家庭和社会带来巨大的经济后果和护理负担。从病理学角度看，SCI包括初始的原发损伤和随后的继发损伤级联反应。原发损伤由脊髓组织直接机械创伤立即发生，而继发损伤涉及多方面的病理过程，如血管破坏、离子失衡、谷氨酸诱导的兴奋性毒性、氧化应激反应、广泛的炎症级联反应和程序性细胞死亡。这些继发性机制加剧了组织破坏，促进了抑制性的胶质瘢痕形成，诱导囊腔发展，并严重中断神经元信号通路。这种抑制性环境显著降低了脊髓神经组织的固有再生能力，给全球SCI的临床管理带来了重大挑战。因此，基于干细胞的干预措施作为脊髓再生的一种前瞻性治疗策略已获得突出地位。间充质干细胞（MSCs）可从多种组织中分离，包括骨髓、脂肪沉积和脐带，因其低免疫原性特征和体外有效扩增能力而受到青睐。MSC治疗SCI的理论基础主要依赖于其强大的旁分泌效应，而非直接的神经元分化。移植的MSCs分泌神经营养、抗炎和促血管生成因子，从而介导免疫调节、抑制凋亡、促进轴突再生和髓鞘形成，并改善局部血液供应，共同为内源性修复创造有利的微环境。然而，传统的MSC移植在临床转化中面临巨大障碍。因此，将MSCs功能化以增强其在受损组织中的适应性和修复功效已成为一项战略必要性。功能化策略旨在将MSCs从被动的“修复细胞”转变为主动的“治疗平台”。

2. SCI的干细胞治疗策略

尽管MSC治疗为SCI修复提供了希望，但传统的MSC移植在临床转化中面临重大挑战，其疗效受多种因素限制。首先，移植的MSCs表现出极低的存活率和快速清除。损伤核心的微环境恶劣，以严重的缺血、缺氧、营养缺乏以及高水平的炎症因子和氧化应激为特征，新移植的细胞迅速发生凋亡或坏死。其次，MSCs向病变部位的归巢效率低下。即使经过鞘内或血管内注射，只有极小比例的细胞能准确迁移并锚定在损伤区域，大多数细胞分散到其他组织或器官。第三，在恶劣的受伤微环境中，MSC的功能不稳定且不可预测，其旁分泌功能受局部环境动态变化的显著影响。越来越多的证据表明，MSCs在SCI中的主要治疗机制并非细胞替代，而是其强大的旁分泌和免疫调节特性。因此，简单地注射未经修饰的细胞而不增强其适应性不可避免地限制了治疗效果。为了解决这些局限性，“功能化”或“工程化”MSCs的概念应运而生。该策略的核心思想是通过外部干预积极增强或引入MSCs的特定治疗特性，将其转化为更强大、智能的“活体生物药物”。功能化的明确目标是解决传统疗法的固有弱点。基因工程可诱导MSCs过表达抗凋亡蛋白或神经营养因子，增强存活和神经再生能力；生物材料可提供三维支架，提供物理保护、定向生长引导并改善细胞滞留；此外，药物预处理可预先激活MSCs，提高其应激耐受性和修复能力。特别是，功能化MSC策略已整合到急性SCI的标准骨科手术流程中。对于需要手术减压和稳定的脊柱骨折病例，功能化MSCs的局部递送可与内固定手术相结合。考虑到伤后急性期炎症微环境的存在，在完成减压和稳定手术后，将功能化MSCs硬膜外或病变区域局部应用可能是一个理想的治疗窗口。除了直接注射，利用可注射或可植入的生物材料载体在术中将负载的MSCs精确递送到损伤部位，不仅可以提供机械支持和保护，还能实现细胞的持续释放和功能发挥，与手术修复目标产生协同作用。总之，功能化策略旨在将MSCs从被动的修复参与者转变为主动的靶向治疗剂，极大地增强了其在SCI复杂病理环境中的疗效和可靠性。

3. 功能化MSCs的主要策略及研究现状

3.1. 基于生物材料的功能化——构建细胞递送与存活平台

基于生物材料的功能化策略核心目标是克服损伤部位的恶劣微环境，为MSC的存活创造支持性环境。关键目标包括：提供三维物理支撑，模拟天然细胞外基质（ECM）的结构，为MSCs提供附着位点，防止注射过程中的细胞流失，并促进细胞有序生长和组织构建；提供生化信号指导，通过材料本身或加载活性因子向MSCs传递促存活和促神经分化的信号，同时调节损伤部位的免疫炎症反应以支持神经再生；实现受控的细胞/因子递送，材料作为缓释载体，允许MSCs或其分泌的营养因子在损伤部位持续有效地发挥作用，防止快速清除。最终，该策略旨在将传统的“细胞注射”提升为“微组织移植”，增强MSC治疗效果。虽然MSCs移植在SCI治疗中显示出相当大的治疗潜力，但传统的递送方法（如简单的细胞悬浮液注射）经常遇到诸如细胞滞留不足和病变部位存活率降低等障碍。最近的临床前证据表明，采用基于生物材料的支架作为细胞载体可以显著提高移植结果。例如，壳聚糖支架显示出比直接细胞注射显著增加的MSC滞留，导致运动能力的改善。目前，各种生物相容性和可适应的水凝胶，包括明胶基、透明质酸衍生和含胶原的支架，已被设计用于SCI修复，以模拟天然神经ECM。这些支架旨在为MSCs创造最佳的三维生长环境。水凝胶特别受到青睐，因为它们具有优异的生物相容性和生物降解性。这些材料复制了天然ECM的主要成分，可以通过温和的物理或化学交联形成高含水量的三维网络。此外，水凝胶可以被精确地定制特定的理化特性，包括可控的孔隙率、刚度和拓扑取向，以主动指导细胞活动和神经再生。一个很有前途的方法是制造具有各向异性拓扑结构的定向水凝胶支架，以促进广泛的轴突再生和有组织的束状重建。模仿天然脊髓白质的平行排列有效地为再生轴突和细胞迁移提供方向线索。此外，将复杂的空间结构和增强的生物功能整合到水凝胶结构中是当前的研究重点。先进的技术如3D打印使得定制化支架制造成为可能。细胞片技术是一种创新方法，能够收获完整的细胞层及其自然分泌的ECM，而无需酶消化。与单细胞悬液移植相比，细胞片能更有效地维持ECM完整性和细胞间连接。移植后，这些细胞片充当“细胞绷带”，显著增强细胞存活、滞留和旁分泌活性。脱细胞天然材料由于能够紧密模拟神经组织的原生三维ECM结构，在SCI修复中具有独特的优势。随着材料科学的进步，研究人员正从将生物材料视为被动支架的传统观点转向开发能够主动调节损伤微环境的“智能”修复平台。当前的研究趋势涉及将生物活性物质（如神经营养因子、抗炎剂和纳米酶）整合到支架材料中，以实现协同、顺序或刺激响应性释放。这种方法同时针对多个病理途径，显着提高治疗效果。例如，磁性生物材料结合外部物理场提供了一种引导细胞迁移的方法，其核心是将MSCs标记为超顺磁性氧化铁纳米粒子（SPIONs），使其能够在外部磁场引导下主动导航至SCI部位。此外，微球构成了SCI管理中另一类有利的支架类别。

3.2. 基于基因工程的功能化——重塑细胞内在本征功能

基于基因工程的功能化方法旨在利用基因编辑或病毒转导等技术对MSCs进行遗传修饰。这包括过表达具有神经保护、免疫调节或再生作用的基本因子，或沉默不利基因。因此，MSCs从单纯的细胞工厂演变为高效的、持续的特定治疗药物原位生产者，显着增强其治疗效果。目前，研究主要集中在通过靶向基因过表达精确调节MSC的行为和治疗功能。主要策略包括增强神经营养能力、促进神经分化、指导分化为特定的神经细胞类型、改善旁分泌效应以及提高MSC存活率。研究表明，过表达各种神经营养因子或关键的发育基因可显着增强MSC介导的神经再生。例如，鼻黏膜来源的MSCs经基因修饰过表达神经肽S可通过激活PI3K/AKT/GSK3β信号级联刺激神经再生。同样，人脐带MSCs工程化以提高碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达，通过调节PI3K-Akt-GSK-3β途径显着增强了内源性神经干细胞的增殖和神经元分化。此外，过表达Wnt5a或Wnt3a有效地促进了MSCs的神经元分化和轴突再生。更高级的策略涉及直接诱导MSCs分化为少突胶质前体细胞（OPCs）、GABA能神经元或其他必要的神经细胞类型。例如，过表达DNA去甲基化酶TET3可有效将人脐带MSCs转化为OPCs。同时，通过CREB1过表达成功诱导MSC分化为GABA能神经元，改善了运动恢复并减轻了神经性疼痛。增强MSCs旁分泌能力的基因工程是另一种重要的治疗策略。胰岛素样生长因子-1（IGF-1）的过表达显着改善了移植MSCs的存活，并提供多方面的保护作用。基于基因工程的功能化的核心优势在于从根本上增强MSCs的特定治疗功能。然而，这种方法的局限性也不容忽视。安全性仍然是最主要的问题，包括病毒载体的潜在致突变性、不可控的基因整合风险，以及长期基因过表达引起的免疫原性或致瘤性，这些都对临床转化构成重大挑战。此外，实现高效基因转导、精确控制基因表达水平以及确保稳定的长期基因表达构成了技术障碍。从监管角度来看，基因修饰的MSC产品面临着比传统细胞疗法更严格的审批流程。

3.3. 基于药理学或物理干预的功能化、外源性预处理和协同治疗

3.3.1. 药理学干预

基于药理学或物理干预的功能化策略构成了一种不同于基因修饰或简单物理支持的先进治疗范式。该方法的核心是在移植之前或期间，用外源性药物或物理刺激对MSCs进行预处理或联合给药。这种策略并非永久改变细胞基因组，而是瞬时且可控地激活MSCs的内在再生潜力，使其在暴露于SCI恶劣微环境之前达到优化功能状态。主要目标包括：增强细胞耐受性，通过激活内源性保护途径提高MSC对氧化应激、炎症和凋亡的抵抗力；指导细胞分化，通过特定的信号线索诱导MSC向神经元或少突胶质细胞谱系分化或增加神经营养因子分泌；优化细胞递送，通过调节归巢相关受体或与趋化因子结合促进MSCs向病变部位的靶向迁移和滞留；以及协同微环境调节，将MSCs与具有神经保护、抗炎、抗氧化或瘢痕降解特性的药物相结合，作用于多个靶点，为神经再生创造许可的环境。药理学干预代表了该策略中研究最广泛的部分。越来越多的临床前证据表明，用药物化合物预处理MSCs或其衍生物，或与MSCs共同给药，可在多个维度显着增强治疗效果。热休克预处理是一种有效的方法，可诱导MSCs中热休克蛋白（如HSP70和HSP27）的强效表达。同样，激活细胞内适应性应激途径也能获得类似益处。例如，将遗传修饰与药物治疗相结合的协同策略，即MSCs转导HIF-1腺病毒载体诱导HIF-1过表达，同时给予口服红景天苷，可显着改善移植MSCs在损伤脊髓组织内的存活。此外，针对特定凋亡途径也显示出疗效，姜黄素通过激活ERK1/2信号通路显着抑制了TNF-α诱导的人脐带MSC凋亡。改善移植细胞向病变部位的归巢对于达到治疗浓度至关重要。目前的研究主要集中在操纵SDF-1/CXCR4趋化因子轴上。例如，促红细胞生成素（EPO）上调损伤部位的SDF-1表达并增加MSCs上的CXCR4受体表达，从而增强MSC募集并提供抗凋亡作用。丙戊酸（VPA）预处理MSCs同样增强了其CXCR4表达，从而增强其对SDF-1信号的反应性并促进向受伤组织的迁移。将MSCs与直接增强受损微环境的药物联合使用是优化MSC存活和治疗效果的另一个核心方法。多项研究证明了有益的协同效应，例如米诺环素与MSCs联合治疗显着改善了运动功能，减少了中性粒细胞浸润。同样，甲泼尼龙（MP）与羊膜来源MSCs联合给药证实了协同的抗炎和抗凋亡作用。此外，直接修饰抑制性细胞外基质（ECM）是实现神经修复的重要步骤，例如将MSCs与软骨素酶ABC（ChABC）共移植，有效克服了轴突再生和MSC迁移的障碍。指导MSC分化为功能细胞类型或增强其营养功能也是改善治疗结果的另一种直接方法。研究表明，骨形态发生蛋白Noggin和BMP-7有效地诱导了MSCs的神经元分化。此外，用药物预处理MSCs可以增强其分泌的细胞外囊泡（EVs）的治疗效果。例如，用红景天苷预处理MSCs可产生修复血-脊髓屏障和减少炎症的小EVs。总之，基于药理学干预的功能化策略在过去十年中得到了广泛发展，形成了一个包含增强MSC弹性、改善靶向归巢和分化、协同微环境调节以及利用先进技术精确加工细胞衍生物的全面框架。

3.3.2. 物理预处理与联合治疗

除了药理学策略，将MSCs与各种物理干预相结合代表了另一种重要的细胞功能化方法。物理预处理方法可以在移植前非侵入性或微创性地增强MSC功能，或者作为辅助治疗方法直接改善损伤微环境。电刺激和电磁场通过调节生物电活动和细胞行为显着增强治疗效果。例如，人脐带MSCs（hUC-MSCs）和神经干细胞（NSCs）移植与亚急性硬膜外电刺激（EES）相结合，促进了NSC分化和神经元成熟，抑制了急性期小胶质细胞的促炎极化。同样，重复经颅磁刺激（rTMS）与骨髓MSC（BMSC）移植相结合，通过抑制Raf/MEK/ERK信号通路促进轴突再生。调节氧条件通过调节氧分压优化细胞功能和损伤微环境。高压氧（HBO）疗法与人胎盘MSC来源的外泌体（hpMSCs-Exos）相结合，协同增强了抗氧化酶活性。相反，缺氧预处理赋予了MSCs能力，研究表明，在生理缺氧条件下预处理MSCs可升高神经营养因子（HGF、BDNF、VEGF）的表达。此外，物理调节策略，如温度调节、声光刺激，在调节细胞生物活性方面显示出潜力。例如，低强度脉冲超声（LIPUS）显著提高了细胞活力、迁移能力和神经营养因子表达。光生物调节效应显示，630 nm激光照射与hUC-MSCs移植相结合显着增强了神经丝修复和运动功能恢复。关于温度调节，轻度低温与静脉BMSC移植相结合增加了细胞增殖并显着增强了电生理和运动功能恢复。生理调节方法，包括运动训练，与细胞疗法配对时也表现出实质性的治疗协同作用。例如，跑步机运动与BMSC移植相结合显着改善了运动恢复结果，保留了白质完整性，并增加了有髓轴突的数量。细胞协同治疗：移植两种或更多种功能互补的细胞类型为SCI提供了一种超越单细胞疗法的综合治疗策略。其主要目标是在损伤区域内利用不同的细胞优势创造协同微环境，从而增强神经保护、轴突再生和功能恢复。基础研究阐明了关键的细胞-细胞相互作用机制。例如，早期静脉输注间充质祖细胞（MPCs）为三天后移植的神经干细胞（NSCs）创造了有利的微环境。进一步细化联合细胞疗法表明，依次移植骨髓来源的MSCs，随后移植源自诱导多能干细胞（iMNPs）的运动神经元祖细胞，显着增强了成熟运动神经元的分化，促进了广泛的轴突再生，并在慢性SCI模型中产生了比单一细胞干预更好的功能恢复。更先进的方法涉及协同细胞的功能增强，例如共移植过表达BDNF的工程化MSCs与iMNPs，证明升高的BDNF表达进一步促进了神经元再生和功能恢复。这些临床前研究共同表明，MSCs充当“微环境调节剂”，改善主要治疗细胞的存活和分化。这种基于机制的协同策略已经走向临床转化。临床研究提供了强有力的证据支持这种方法，研究小组在完全性SCI患者中进行了自体骨髓来源MSCs与施万细胞（SCs）的鞘内联合给药。在超过九年的随访期内，参与者表现出显着且持续的ASIA损伤评分、脊髓损伤独立性测量（SCIM）和基于世界卫生组织标准的生活质量评估的改善。此外，同一研究组的另一项随机对照调查验证了联合MSC和SC移植在治疗SCI患者持续性神经病理性疼痛方面的治疗优势。

4. 临床前研究总结与疗效评价

SCI的临床前研究强调了三种突出的功能化策略，即基于生物材料、基于基因工程和基于药理学或物理干预，每种策略在动物模型中均显示出巨大的治疗潜力。研究表明，负载MSC的支架，如线性有序胶原和丝素蛋白，有效地引导定向轴突再生并桥接病变间隙。过表达神经营养因子或必需信号蛋白的基因修饰显着增强了MSCs的旁分泌效应、抗凋亡能力和神经元分化。此外，药理学或物理预处理激活MSCs的内源性保护机制，显着提高其对损伤微环境的抵抗力和治疗效果。疗效评估的常见发现证实了这些策略在脊髓修复中的协同潜力。在功能方面，动物模型通常表现出运动性能的显着改善。在组织学上，治疗后的动物显示出减小的腔隙体积、增加的轴突再生和髓鞘形成，以及对残留神经元的增强保护。在调节局部损伤微环境方面，这些细胞方法有效地抑制了M1巨噬细胞和microglia的促炎激活状态，同时促进其表型向抗炎M2亚型的转变。此外，促炎细胞因子如IL-1β和TNF-α显着减少，而抗炎细胞因子包括IL-10和TGF-β表达增加，共同建立了支持神经再生的最佳微环境。每种策略都有其独特的优势和挑战。生物材料支架提供物理支持和定向引导，但面临生物降解和潜在免疫原性的限制。基因工程提供细胞功能的精确增强，但遇到重大的安全隐患和复杂的监管障碍。药理学或物理预处理方法具有微创性和易转化性，但可能产生相对短暂的效果。鉴于单一策略可能不足以解决SCI复杂的病理级联反应，未来的方向在于智能地组合这些策略以实现协同效应。

5. 当前研究的局限性

尽管取得了这些令人鼓舞的结果，但目前关于SCI功能性干细胞干预的研究仍面临若干重大挑战。虽然许多研究声称MSCs在体内成功实现了神经元分化，但支持这些观察结果的科学严谨性仍然有限且存在争议。此外，临床研究经常遇到方法学问题，如参与者数量有限、缺乏盲法以及与对照组选择相关的伦理复杂性，所有这些都大大降低了其发现的可靠性和适用性。在转化水平上，临床前动物模型与人类脊髓损伤的病理生理学之间存在显着差异。动物实验中经常实现的显着功能恢复在临床上难以复制，突显了人类损伤的复杂性和物种特异性。从技术和机制的角度来看，移植细胞存活、归巢效率、分化结果和长期安全性等问题仍未解决。此外，还需要进一步优化功能化方法的精确度以及生物材料的免疫原性和降解曲线。重要的是，精确的治疗机制，特别是复杂的细胞宿主相互作用，仍然定义不清，并且缺乏预测治疗反应的可靠生物标志物。患者损伤的内在异质性和最佳治疗时机进一步使实现普遍有效的结果复杂化。特别是，功能化或基因修饰的MSCs作为先进治疗产品，在临床转化中面临着比未修饰MSCs大得多的监管和制药障碍。实现稳定的、可重复的大规模GMP制造是一个重大挑战，涉及复杂功能化过程的标准化和质量控制。这些高监管和CMC标准和障碍构成了功能性MSC疗法从实验室过渡到广泛临床应用必须克服的核心瓶颈。

6. 结论

结合生物材料、基因工程以及药理学或物理干预的功能化干细胞策略，通过增强细胞存活、定向分化和免疫调节能力，在SCI修复中显示出巨大的治疗前景。广泛的临床前证据一致强调了它们在促进运动恢复、轴突再生和改善损伤微环境方面的有效性。初步的临床转化工作进一步验证了其在增强神经功能结果方面的安全性和可行性。然而，重大挑战依然存在，特别是在弥合临床前成功与有意义的临床疗效之间的差距、标准化和个体化治疗方案以及阐明精确机制和长期安全性特征方面。未来的研究应优先优化联合治疗方法，阐明潜在的分子机制，并进行大规模临床试验，最终将这些创新策略转化为临床实践，广泛造福SCI患者。