针对三阴性乳腺癌治疗的、以LRP6为靶点的mRNA疫苗的计算设计

《Cancer Reports》：Computational Design of an mRNA Vaccine Targeting LRP6 for Triple-Negative Breast Cancer Therapy

　　**摘要**

**背景**
三阴性乳腺癌（TNBC）的预后比其他类型的乳腺癌更差，这归因于其侵袭性以及缺乏特定的治疗方法。尽管目前有治疗方法，TNBC的复发率仍然很高，生存期有限，因此迫切需要改进治疗方案。TNBC表现出较高的LRP6表达水平，这与肿瘤相关特征有关，如生长、转移、预后不良、化疗抵抗性和侵袭性。因此，LRP6成为乳腺癌治疗的一个有希望的靶点。

**目的**
本研究旨在利用计算机模拟和生物信息学技术开发一种针对LRP6抗原的mRNA疫苗。

**方法与结果**
最终构建的疫苗含有431个氨基酸，分子量为47.5 kDa，理论pI值为5.11，不稳定性指数为38.3，表明其具有稳定性。群体覆盖分析显示全球覆盖率为99.04%。分子对接显示其与免疫受体（包括HLA-A0201（?812.0）、HLA-A0301（?707.1）、HLA-DRB1*0101（?955.7）和TLR9（?1339.5））具有强烈的结合亲和力。免疫模拟预测产生的IgG1抗体滴度较高，记忆B细胞群持续存在（第365天时超过200个），CD4+ T细胞数量增加（超过3000个），并且IFN-γ反应强烈。密码子优化后，CAI值为0.94，GC含量为58.37%，支持其在人体系统中的有效表达。

**结论**
总体而言，这些结果表明，设计的针对LRP6的mRNA疫苗能够诱导对TNBC的持久体液和细胞免疫反应，值得进一步实验验证。

## 1 引言
在全球范围内，乳腺癌是女性死亡的主要原因之一，占所有癌症的24.5%，其死亡率达到发病率的15.5%。2020年，它超越肺癌成为最常见的癌症类型。三阴性乳腺癌（TNBC）是一种特殊的乳腺癌亚型，其特征是缺乏雌激素受体、孕激素受体和HER2受体。它约占所有乳腺癌病例的10%–15% [1]。目前，化疗和放疗是主要的治疗方法，但效果有限且伴有诸多副作用 [2]。因此，开发有效的疗法至关重要。低密度脂蛋白受体相关蛋白6（LRP6）是一种跨膜受体，在Wnt信号通路中起关键作用，参与胚胎发育、维持组织平衡和促进细胞增殖 [3]。当Wnt配体与Frizzled受体及其共受体LRP6相互作用时，Wnt/β-catenin通路被激活 [4]。Wnt信号通路的紊乱与多种癌症的发生和发展有关，例如胰腺癌、乳腺癌、结直肠癌和肝细胞癌。针对Wnt/β-catenin信号通路的靶向治疗正在研究中，在临床前和临床研究中显示出治疗恶性肿瘤的潜力 [5]。这些肿瘤表现出较高的LRP6表达水平，这与肿瘤相关特征相关，如生长、转移、预后不良、化疗抵抗性和侵袭性 [6, 7]。在人类TNBC患者和细胞系中，LRP6的表达也增加 [8]。因此，LRP6有可能作为乳腺癌治疗的特定分子靶点。临床前和临床研究表明，LRP6在TNBC中过表达，并可通过增强Wnt/β-catenin信号通路促进肿瘤迁移、侵袭和转移表型 [8]。生物信息学分析显示，肿瘤中LRP6 mRNA的水平升高与较差的整体生存率和无病间隔期相关，并与血管生成和药物敏感性等功能状态有关。治疗策略包括使用药物抑制剂（如Niclosamide）、天然化合物（如姜黄素）、非编码RNA、蛋白质和肽来下调LRP6或其相互作用，这比广泛的Wnt抑制剂具有优势，例如减少副作用。这使LRP6成为克服治疗抵抗性和推进个性化癌症治疗的多元靶点 [9]。虽然LRP6在正常组织中作为Wnt共受体普遍表达，但在临床前模型中靶向抑制其副作用可控，尽管疫苗方法需要仔细选择表位以最小化自身免疫风险。癌症疫苗是一种免疫治疗方法，可激活免疫系统识别和消灭癌细胞。FDA批准的疫苗例子包括人乳头瘤病毒（HPV）疫苗，可预防由HPV感染引起的宫颈癌和其他恶性肿瘤，以及Sipuleucel-T疫苗，用于治疗转移性前列腺癌 [10, 11]。此外，癌症疫苗在多种癌症的临床试验中显示出希望，但尚未在临床实践中广泛使用。研究重点在于开发新的、更有效的癌症疫苗，并将其与其他免疫疗法（如检查点抑制剂）结合使用 [10]。

mRNA疫苗是预防传染病和癌症的有前景的方法。与传统疫苗不同，后者使用减毒或灭活的病原体或其成分，mRNA疫苗利用一种称为信使RNA（mRNA）的遗传物质片段来指导细胞合成刺激免疫反应的蛋白质。这种方法具有许多优点，如加速开发和生产、提高安全性以及在针对病原体和癌症抗原方面的适应性 [12]。在这项研究中，我们采用了一种综合的免疫信息学方法来设计一种多表位mRNA疫苗，靶向LRP6。我们系统地预测和筛选了针对细胞毒性T淋巴细胞（CTL）、辅助T淋巴细胞（HTL）和线性B淋巴细胞（LBL）的表位，基于抗原性、免疫原性、毒性和致敏性。这些表位被组装成单个疫苗构象，使用已建立的连接器和辅助剂序列。该构象在抗原潜力、安全特性、结构稳定性以及与免疫受体的分子相互作用方面进行了评估，并通过计算机模拟预测其引发有效抗肿瘤免疫反应的能力。

## 2 材料与方法**

### 2.1 TNBC患者队列中的LRP6表达
TCGA数据获取与处理
三阴性乳腺癌患者的转录组和临床数据通过UCSC Xena浏览器（https://xenabrowser.net；访问日期为2026年1月26日）从癌症基因组图谱（TCGA-BRCA）队列中获取 [13]。根据TCGA的临床注释，TNBC样本被定义为缺乏雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和HER2表达的肿瘤。使用标准化RNA测序数据（标准化计数+1）来评估LRP6基因表达。患者根据TCGA数据集中的基底样分子亚型进一步分类。使用UCSC Xena平台中的Welch's t检验评估了TNBC与非TNBC乳腺癌样本之间以及基底样和非基底样TNBC亚组之间的LRP6表达差异。

### 2.2 免疫相关性分析
为了研究LRP6与免疫相关标志物之间的关系，使用TCGA-BRCA RNA测序数据进行了相关性分析。使用标准化的基因表达值（norm_count + 1）。选取了一组免疫相关基因，包括TLR2、TLR4、TLR7、TLR9、CD8A、CD8B、GZMB、PRF1、CD247、HLA-A、HLA-DRA和HLA-DRB1。使用Pearson相关性分析计算了LRP6与这些免疫标志物基因之间的成对相关性。

### 2.3 目标蛋白序列的检索与分析
从UniProt服务器（https://www.uniprot.org/；访问日期为2025年6月8日） [14]（UniProt ID：O75581）获取了关于氨基酸序列、细胞外结构域和细胞定位的数据。使用VaxiJen服务器（http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html；访问日期为2025年6月8日） [15-17]进行了蛋白质抗原性评估。VaxiJen采用了一种基于自协方差（ACC）变换的无比对方法，以实现精确的抗原预测（70%–89%）。它仅根据蛋白质的理化性质进行分类，避免了序列比对，从而提高了预测保护性抗原的效率 [15]。使用TMHMM服务器—2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/；访问日期为2025年6月8日） [18, 19]评估了蛋白质的跨膜拓扑结构。Alphafold服务器（https://alphafold.ebi.ac.uk/；访问日期为2025年6月8日） [20]用于预测蛋白质的3D结构。

### 2.3 最优免疫原性表位的预测与鉴定**

**2.3.1 CTL表位预测**
使用Immune Epitope Database（IEDB）服务器（https://www.iedb.org/；访问日期为2025年6月8日） [21]预测MHC I表位，采用了多种算法，包括Stabilized Matrix Method（SMM） [22]、SMM结合肽和人工神经网络（ANN） [23]：MHC结合能量协方差矩阵（SMMPMBEC）、来自组合肽库的评分矩阵 [24]、Consensus [25]、NetMHCpan [26]、NetMHCcons [27]、PickPocket [28]和NetMHCstabpan [29]。预测的百分位排名低于2。考虑了不同的HLA，如HLA-A01:01、HLA-A02:01、HLA-A02:06、HLA-A03:01、HLA-A24:02、HLA-A26:01、HLA-B07:02、HLA-B08:01、HLA-B27:05、HLA-B39:01、HLA-B44:02、HLA-B44:03、HLA-B58:01、HLA-B58:02，表位长度为九个氨基酸。IEDB是一个强大的表位预测资源，拥有跨不同免疫环境的广泛实验数据。整合外部资源（如UniProt和NCBI Taxonomy）提高了准确性。IEDB服务器使用定量算法进行MHC I类表位预测，并通过盲预测测试严格评估其准确性和可靠性，用于疫苗开发和免疫治疗 [21, 30]。使用VaxiJen2.0对表位进行了抗原性评估，阈值大于1。通过AllerCatPro 2.0（https://allercatpro.bii.a-star.edu.sg/；访问日期为2025年6月8日） [31]和AllerTOP v. 2.0（https://www.ddg-pharmfac.net/AllerTOP/；访问日期为2025年6月8日） [32]进行致敏性评估，并通过Toxinpred服务器（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/algo.php；访问日期为2025年6月8日） [33, 34]使用SVM方法（基于SVM（Swiss-Prot）+ Motif）进行毒性预测，阈值设为-0.5。IEDB的免疫原性预测工具（http://tools.iedb.org/immunogenicity/；访问日期为2025年6月8日） [35]用于表位免疫原性预测，推荐的掩蔽位置为第一、第二和C末端氨基酸，阈值设为大于0.2。AllerCatPro 2.0服务器使用结合氨基酸序列和3D结构的算法预测蛋白质致敏性，准确率达84.7% [31]。AllerTOP v. 2服务器使用多层感知器（MLP）、朴素贝叶斯（NB）、逻辑回归、决策树和k最近邻居（kNN）等机器学习算法预测过敏原，总准确率为88.7% [32]。ToxinPred服务器使用先进算法准确预测肽的毒性，准确率超过90%，在区分有毒和无毒肽方面表现出色 [33]。IEDB免疫原性服务器使用算法预测HLA I类分子上的肽的免疫原性，大约66%的免疫原性pMHC获得了阳性评分，而非免疫原性pMHC的平均比例为44% [35]。

**2.3.2 HTL表位预测**
IEDB服务器 [21] 使用Consensus [36]、组合库、NN-align-2.3（netMHCII-2.3） [37]、SMM-align（netMHCII-1.1） [38]和Sturniolo [39]等算法预测MHC II表位，百分位排名大于2。还使用了NetMHCIIpan-4.1 BA（https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetMHCIIpan-4.0/；访问日期为2025年6月8日） [40]，强结合剂的阈值（% Rank）设为1，弱结合剂的阈值（% Rank）设为5。预测的表位长度为15个氨基酸，并在All HLAs上进行了预测。NetMHCIIpan-4.0服务器使用NNAlign_MA和NNAlign_MAC模型，显著提高了预测CD4+新表位的准确性，准确率约为70%–80% [40]。使用VaxiJen2.0、AllerCatPro 2.0、AllerTop v. 2.0和ToxinPred服务器分别评估了预测表位的抗原性、致敏性和毒性，标准相同。此外，还使用IFNepitope（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/ifnepitope/application.php；访问日期为2025年6月8日） [41]和IL4pred（http://crdd.osdd.net/raghava/il4pred/；访问日期为2025年6月8日） [42]服务器筛选能够诱导干扰素-γ和白细胞介素-4的表位。IFNepitope服务器使用组合基序和SVM策略预测IFN-γ表位，具有针对IFN-γ与非IFN-γ及IFN-γ与其他细胞因子的不同模型。IL4pred服务器采用SVM（Swiss-Prot）+ Motif方法预测IL4诱导表位，SVM阈值为0.2。IFNepitope服务器使用机器学习算法，包括支持向量机（SVM）模型和混合方法，准确率达到82.10% [41]。IL4pred服务器使用算法预测肽的毒性，准确率超过90%，在区分有毒和无毒肽方面表现出色 [33]。IEDB免疫原性服务器使用算法预测HLA I类分子上的肽的免疫原性，大约66%的免疫原性pMHC获得了阳性评分，而非免疫原性pMHC的平均值为44% [35]。

**2.3.3 表位与HLA的对接**
在疫苗设计中，表位与HLA的对接确保了精确的抗原呈现预测，通过最大化免疫原性和HLA兼容性来识别最佳表位并增强免疫反应效果 [43]。使用HDOCK服务器（http://hdock.phys.hust.edu.cn/；访问日期为2025年6月8日） [44-49]进行了表位对接，将HTL表位与HLA DRB1 0101（PDB ID：1AQD）和CTL表位与HLA A 0201（PDB ID：3MRG）进行匹配。选择了五个具有最高对接分数的HLT和CTL表位进行进一步分析。

2.3.4 线性B细胞表位预测
使用IEDB服务器进行线性B细胞表位预测，采用了诸如Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0 [50-52]、Kolaskar和Tongaonkar Antigenicity [53]方法（阈值：1）、Bepipred Linear Epitope Prediction [54]以及Emini Surface Accessibility Prediction [55]（阈值：0.5）等方法。此外，还使用了ABCpred服务器（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/index.html；访问日期：2025年6月8日）[56, 57]，其阈值为0.51，来预测长度为16个氨基酸的线性B细胞表位。ABCpred服务器利用循环神经网络（Jordan网络）进行表位预测，预测B细胞表位的准确率约为65.93%。与HLT和CTL一样，预测的表位也使用VaxiJen2.0（阈值>0.5）、AllerCatPro 2.0、AllerTop v. 2.0和ToxinPred服务器进行了全面的抗原性、致敏性和毒性筛选。另外，还使用了IgPred服务器（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/igpred/；访问日期：2025年6月8日）来评估表位，并识别出能够诱导免疫球蛋白G（IgG）、A（IgA）和E（IgE）的表位。最终选择了五个表位。

2.4 人群覆盖率评估
在疫苗设计中评估T细胞表位的人群覆盖率对于理解遗传多样性和HLA等位基因的普遍性至关重要。IEDB Population Coverage服务器（http://tools.iedb.org/population/；访问日期：2025年6月8日）在此分析中起着关键作用。

2.5 疫苗结构的构建
mRNA疫苗构建包括从5′到3′排列的多个部分，包括5′帽区、人β-珠蛋白的5′UTR（NCBI ID：NM 000518.5）、Kozak序列、组织纤溶酶原激活剂（tPA）的信号肽（UniProt ID：P00750）、Pan HLA-DR结合表位（PADRE）、作为佐剂的GM-CSF、CTL和HLT表位、MHC I类跟踪域（MITD）（UniProt ID：Q8WV92）、终止密码子、3′UTR和Poly-A尾（120个A）。使用不同的连接子（EAAAK、AAY、GPGPG、GSSG和KK）构建了多种模型，并通过Protparam服务器（https://web.expasy.org/protparam/；访问日期：2025年6月8日）[60]进行了评估。ProParam服务器计算了各种蛋白质属性，包括氨基酸和原子组成、分子量、消光系数、理论等电点（pI）、半衰期、脂肪指数和不稳定性指数（GRAVY）。不稳定性指数用于衡量蛋白质在实验室环境中的稳定性，值低于40表示稳定，高于40表示潜在不稳定[60]。所有分析都是在疫苗结构的可翻译部分进行的，这部分最终构成了其主要蛋白质结构（从PADRE到LBL表位的末端）。

2.6 mRNA疫苗的2D和3D结构计算建模
使用Robetta服务器（https://robetta.bakerlab.org/submit.php；访问日期：2025年6月8日）预测了所有三个设计的疫苗结构的3D结构，采用了自动化领域检测和建模协议，包括同源性建模和从头算方法[61]。对于每个结构，选择了三个预测最好的模型，并通过GalaxyRifine（https://galaxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi?type=REFINE；访问日期：2025年6月8日）[62, 63]进行了精细化处理。在九个精细化模型中，选择了四个最好的模型，并通过GalaxyRifine和Modrefiner服务器（https://zhanggroup.org/ModRefiner/；访问日期：2025年6月8日）[64]进行了重新精细化处理。最终选择了这四个模型中最好的一个。这些模型的选择基于SAVES服务器（https://saves.mbi.ucla.edu/；访问日期：2025年6月8日）进行的评估，包括ProCheck [65]、ERRAT [66]和Verify3D [67, 68]工具。ERRAT使用成对相互作用来识别蛋白质结构中的错误[66]。Verify3D通过检查3D模型与其相应氨基酸序列之间的兼容性来评估蛋白质结构的质量[68]。ProCheck方法使用立体化学考虑来评估蛋白质结构的整体质量，并识别可能需要进一步研究的区域[65]。在获得最终模型后，进行了额外的分析以评估抗原性、致敏性和毒性。这些评估使用了VaxiJen2.0、AllerCatPro 2.0、AllerTop v. 2.0和ToxinPred服务器。

2.7 溶解度和其他物理化学性质的分析
如前所述，使用Protparam服务器评估了疫苗结构的物理化学性质。此外，还使用Protein-Sol服务器（https://protein-sol.manchester.ac.uk/；访问日期：2025年6月8日）[69]评估了溶解度。Protein-Sol算法计算了35个序列特征，包括氨基酸组成、序列长度和复合得分，如KmR和DmE。其他特征包括折叠和无序倾向、β-链倾向、疏水性、pI、序列熵以及pH 7时的绝对电荷[69]。

2.8 翻译后蛋白质性质的评估
使用NetPhos 3.1（https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/；访问日期：2025年6月8日）[70]、NetNGlyc—1.0（https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetNGlyc-1.0/；访问日期：2025年6月8日）[71]、MyrPS/NMT服务器（https://mendel_imp.ac.at/myristate/；访问日期：2025年6月8日）[72]、Big-PI/GPI Animals服务器（https://mendel.imp.ac.at/gpi/gpi_server.html；访问日期：2025年6月8日）[73-75]和PrePS服务器（https://mendel.imp.ac.at/PrePS/；访问日期：2025年6月8日）[76]分别预测磷酸化、N-糖基化、肉豆蔻酰化、糖基磷脂酰肌醇（GPI）修饰和番荔枝酰化。

2.8 2D蛋白质结构预测
使用PSIPRED服务器（http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/；访问日期：2025年6月8日）[77]，基于PSI-BLAST生成的位点特异性评分矩阵，通过两阶段神经网络算法预测了选定模型的2D蛋白质结构。PSIPRED服务器在精确二级结构预测方面的平均Q3得分达到了76.5%-78.3%[77]。

2.10 2D mRNA结构预测
使用RNAfold网络服务器（属于ViennaRNA Package 2.0的一部分，网址：http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi；访问日期：2025年6月8日）生成了mRNA疫苗的预测二级结构。RNAfold使用动态规划预测单个RNA序列的最小自由能二级结构，并通过配分函数算法计算平衡碱基配对概率，从而提供有关RNA结构集合和热力学稳定性的见解[78]。

2.11 疫苗结构中的B细胞构象表位
使用IEDB服务器的Ellipro工具（http://tools.iedb.org/ellipro/；访问日期：2025年6月8日）[79]来预测制备疫苗中的不连续B细胞表位。应用了最小得分和最大距离参数的默认设置。Ellipro服务器使用了三种算法：一种将蛋白质形状近似为椭球体，另一种计算残基突起指数，第三种根据它们的突起指数值对相邻残基进行聚类。这些算法共同实现了0.832的准确率[79]。

2.12 免疫系统模拟的计算模型
使用C-IMMSIM服务器（https://kraken.iac.rm.cnr.it/C-IMMSIM/；访问日期：2025年6月8日）[80]对接种疫苗后免疫系统的反应进行了计算机模拟。该模型结合了三维随机元胞自动机，并采用了生物信息学工具来预测免疫系统成分之间的相互作用。它使用了NetMHCPan和Miyazawa-Jernigan潜力等方法，与实验数据的相关性平均准确率为56%[80]。在C-IMMSIM服务器中使用了一个随机种子12,345，模拟体积为10，总共有1095个模拟步骤，以及特定的宿主HLA选择（MHC I类的A0101和B0702，MHC II类的DRB1:0101）。此外，疫苗接种分三次进行，每次接种间隔28天。

2.13 疫苗肽的分子对接解析
构建的疫苗与七个分子进行了对接模拟，分别是HLA-A02（PDB：3MRG）、HLA-A03（PDB：2XPG）、HLA-DRB1 0101（PDB：1AQD）、TLR2（PDB：2Z7X）、TLR4（PDB：G8A）、TLR7（PDB：7CYN）和TLR9（PDB：Q9NR96），使用ClusPro服务器进行了深入的分子相互作用分析。ClusPro服务器（https://cluspro.bu.edu/login.php?redir=/queue.php；访问日期：2025年6月8日）使用先进算法实现了PIPER、FFT和蒙特卡洛方法以获得高质量的结果。它提供了簇中心的PIPER能量以及每个簇内的最小PIPER能量，有助于预测蛋白质复合物[81-84]。使用PDBsum服务器（https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/；访问日期：2025年6月8日）评估了疫苗与MHC I、MHC II、TLR2、TLR4、TLR7和TLR9的对接结构内的相互作用。PDBsum通过整合PDB条目的数据提供了对接蛋白质复合物的全面结构注释，使用HBPLUS和LIGPLOT算法来可视化相互作用，提供了关于界面残基、氢键和配体接触的见解[85]。

2.14 疫苗构建的宿主特异性密码子优化
为了提高在人类细胞中的翻译效率，使用GenScript提供的GenSmart Codon Optimization工具（https://www.genscript.com/tools/gensmartcodon-optimization；访问日期：2025年6月8日）对肽疫苗构建进行了密码子优化。针对在宿主体内表达的区域（从信号肽到MITD段）的编码序列进行了优化，目标是Homo sapiens。使用GenScript提供的GenSmart Rare Codon Analysis平台（https://www.genscript.com/tools/rare-codon-analysis；访问日期：2025年6月8日）进一步分析了优化后的DNA序列，以评估其在人类细胞中的表达适应性。分析提供了与人类细胞表达效率相关的关键参数，包括密码子适应指数（CAI）、密码子频率分布（CFD）和GC含量。CAI反映了密码子使用与宿主系统的整体兼容性，而CFD指示了可能影响翻译效率的罕见密码子簇的存在。还评估了GC含量，以确保结构稳定性和适合转录处理。

2.15 统计分析
使用UCSC Xena平台进行了TCGA基因表达的Welch's t检验，并应用了Pearson相关性分析来评估LRP6表达与免疫相关标记基因（包括Toll样受体（TLRs）、CD8相关基因、细胞毒性标记基因和HLA基因）之间的关联。对于疫苗表位的选择，使用Python（v3.12.3）分析了抗原性、毒性、致敏性、免疫原性和其他预测特性。根据相关方法部分中描述的预定义阈值系统地过滤了表位，以确保选择过程客观、透明和可重复。使用描述性统计来总结表位得分、对接能量和免疫模拟输出。数据处理、相关性分析、可视化和描述性分析均使用Python进行。外部平台（如UCSC Xena、IEDB工具和免疫模拟服务器）生成的图形输出按照各自工具提供的方式使用。外部生物信息学服务器中嵌入的机器学习算法在相应的方法学小节中有描述。

3 结果
3.1 TNBC患者队列中的LRP6表达
3.1.1 TNBC和基底样亚型中的LRP6表达
对TCGA-BRCA RNA-sequencing数据的分析显示， triple-negative乳腺癌（TNBC）肿瘤中的LRP6表达显著高于非TNBC乳腺癌（Welch's t检验，p = 0.041）。TNBC样本显示了更高的LRP6表达中位数和更广泛的分布，表明这种亚型内的异质性更大。同样，基底样肿瘤的LRP6表达也显著高于非基底样肿瘤（p = 0.030）（图1）。
(A) TCGA-BRCA中的LRP6表达和免疫相关性。(B) TNBC与非TNBC肿瘤中的LRP6表达。(C) LRP6与免疫相关基因之间的Pearson相关性热图。

3.1.2 免疫相关性分析
图1可视化了LRP6与免疫相关基因之间的相关性分析。LRP6表达与多个免疫标记物（包括TLR7、CD8A、HLA-DRA和HLA-DRB1）显示出强烈的正相关性。这些结果表明，升高的LRP6表达与TNBC中免疫相关基因的表达增强有关。

3.2 目标蛋白分析
从UniProt服务器获取了关于LRP6目标蛋白的数据。使用VaxiJen2.0和TMHMM server—2.0进行检测后发现，LRP6被归类为膜蛋白，并表现出可接受的抗原性。图2显示了从服务器获得的结果和LRP6的三维结构。
目标蛋白分析：(A) 从Uniprot数据库获取了LRP6的细胞定位。(B) 通过TMHMM server—2.0的分析获得了蛋白的跨膜排列。(C) 使用Alphafold server获得了LRP6的三维结构。(D) 使用Vaxijen 2.0工具获得了LRP6的抗原性评估。

3.3 最优表位的评估和检查
3.3.1 CTL表位的评估
IEDB服务器使用多种算法成功预测了450个长度为9个氨基酸的非重复CTL表位。根据VaxiJen2.0服务器的发现，有88个表位的抗原性大于一。在这些88个表位中，75个表位的毒性得到了Toxinpred服务器的确认。此外，IEDB服务器还表明，在这77个表位中，有15个表位具有免疫原性的关键特征。通过HDOCK服务器分析对接结果，并结合AllerCatPro 2.0和AllerTop v 2.0服务器进行的致敏性评估，选择了五个表位。这些表位表现出非致敏性质，并且具有最低的对接分数（表1）。
表1. LRP6的CTL、HTL和LBL表位分析。表1：抗原肽的特征

| 序列 | 数量 | 抗原性 | 毒性 | 过敏性 | 其他特征 |
|-------|------|------|-------|--------|---------|
| DKIPHIFGF | 1 | ?0.98 | ?216.42 | 0.30742 | 非过敏原 |
| SRYIYWTCE | 1 | ?0.56 | ?200.44 | 0.33889 | 非过敏原 |
| RRADIRRIS | 1 | ?1.06 | ?195.72 | 0.33478 | 非过敏原 |
| RYIYWTCEA | 1 | ?0.76 | ?194.51 | 0.30472 | 非过敏原 |
| DEVRAIRRS | 1 | ?0.7 | ?176.22 | 0.30278 | 非过敏原 |
| HTL | ... | ... | ... | ... | ... |
| INF Gamma | ... | ... | ... | ... | ... |
| IL4 | ... | ... | ... | ... |
| PHPFGLTQYQDYIYW | 1.1907 | ?1.39 | ?265.91 | 0.7011559 | ... |
| PHPFALTLFEDILYW | 1.2095 | ?0.86 | ?232.11 | 0.2010886 | ... |
| DFTDIVLQLEDIRHA | 1.3371 | ?0.97 | ?236.59 | 0.1171391 | ... |
| EGRTKVQARIAQLSD | 1.3389 | ?1.51 | ?218.1 | 0.15279 | ... |
| RYIYWTCEATNVINV | 1.2018 | ?0.67 | ?216.8 | 0.2136725 | ... |
| LBL | ... | ... | ... | ... | ... |

**注：**部分列的值未能填写或被省略。受体
配体
得分

TLR 9
疫苗
-1339.5

TLR 7
疫苗
-1092.2

TLR 4
疫苗
-829.5

TLR 2
疫苗
-821.6

HLA A 0201
疫苗
-812.0

HLA A 0301
疫苗
-707.1

HLA DRB1 0101
疫苗
-955.7

图10（在图查看器或PowerPoint中打开）
疫苗与不同免疫系统结构的对接分析。(A) HLA A 0201与疫苗的对接。(B) HLA A 0301与疫苗的对接。(C) HLA DRB1 0101与疫苗的对接。(D) TLR 2与疫苗的对接。(E) TLR 4与疫苗的对接。(F) TLR 7与疫苗的对接。(G) TLR 9与疫苗的对接。PDBsum分析（图11）表明，该疫苗与免疫受体建立了强大且多样的相互作用。疫苗-MHC I复合物涉及MHC I和疫苗各自的30个和29个界面残基，界面面积分别为1424 ?2（MHC I）和1526 ?2，通过4个盐桥、21个氢键和200个非键合接触点稳定。MHC II表现出链特异性变异性，其中Chain E的相互作用最为显著（MHC II为749 ?2，疫苗为782 ?2），其次是Chain D（475/482 ?2）、Chain K（192/135 ?2）、Chain H（118/145 ?2）和Chain J（146/146 ?2）。在先天免疫受体中，TLR4的界面面积最大（TLR4为1889 ?2，疫苗为1794 ?2），由11个盐桥、14个氢键和174个非键合接触点支持。TLR9也形成了类似的强相互作用（TLR9为1940 ?2，疫苗为1777 ?2），通过16个氢键和2个盐桥稳定。TLR7的界面面积为1539 ?2（TLR7）和1406 ?2（疫苗），有8个氢键和1个盐桥。TLR2通过1189 ?2（TLR2）和1183 ?2（疫苗）结合，通过18个氢键、3个盐桥和157个非键合接触点稳定。这些结果强调了该疫苗通过稳定和特异性的结合同时激活适应性（通过MHCs）和先天性（通过TLRs）免疫反应的潜力。

图11（在图查看器或PowerPoint中打开）
对接复合物链之间的分子相互作用：(A) MHC I（链A）与疫苗结构（链B）；(B) TLR4（链A）与疫苗（链V）；(C) TLR7（链A）与疫苗（链V）；(D) TLR9（链A）与疫苗（链V）；(E) TLR2（链A）与疫苗（链V）；(F) MHC II链（D, E, H, K）与疫苗（链V）之间的相互作用。

3.14 碱基优化和表达适用性分析
使用GenScript的GenSmart碱基优化工具对疫苗DNA序列进行了优化，以提高其在人体细胞中的翻译效率。优化后的序列保持了原有的2181个碱基对长度和58.37%的GC含量，表明优化过程保留了该构建体的结构特征（图12A）。随后，使用GenSmart稀有碱基分析工具对优化后的序列进行了评估。碱基适应性指数（CAI）计算为0.94（图12B），表明其与人类碱基使用的兼容性很高，而碱基频率分布（CFD）值为0，表明不存在可能阻碍表达的稀有碱基簇。

4 讨论
在乳腺癌亚型中，TNBC（三阴性乳腺癌）是一种特别具有侵袭性的亚型，其分子异质性明显，不同的亚型使其具有侵袭性和不良预后。尽管有当前的治疗方法，TNBC的复发率仍很高，生存期有限，这突显了改进治疗方案的迫切需求[87]。在乳腺癌中检测到LRP6的高表达[88]。LRP6的高表达与乳腺癌病例的死亡率和不良预后呈正相关。进一步的生存分析显示，乳腺癌组织中LRP6表达升高与总体生存率呈负相关[7]。我们的计算发现，特别是在TNBC肿瘤中LRP6的表达升高及其与免疫相关基因特征的关联，与现有实验证据一致，表明LRP6促进了TNBC细胞的侵袭行为。先前的机制研究表明，LRP6的上调增强了Wnt/β-连环蛋白信号通路，并驱动了MDA-MB-231和BT-549等TNBC细胞系的迁移和侵袭，而LRP6的抑制则抑制了这些恶性表型[8]。几项最近的研究探索了TNBC的疫苗策略，这反映了尽管传统治疗方法在这一亚型中历史上取得的效果有限，但人们对免疫治疗方法的兴趣日益增长。关于TNBC的癌症疫苗的系统性回顾强调了基于RNA的新表位疫苗（如RO7198457）与PD-L1抑制剂atezolizumab联合使用的早期临床评估，特别是在晚期实体瘤患者中[89]。乳腺癌疫苗致力于通过使用抗原、递送机制和佐剂来增强免疫系统的防御能力。尽管在不同类型的乳腺癌中检测到了多种免疫原性蛋白，但大多数抗原由弱免疫原性表位组成，这在三阴性乳腺癌中尤为普遍[90]。因此，需要进行计算机模拟研究以选择最合适的抗原。TNBC疫苗开发的重要性在于它有可能彻底改变癌症治疗。免疫信息学和计算生物学的持续研究为推进这一领域的癌症免疫治疗带来了希望[91]。几项最新的计算机免疫信息学研究针对TNBC设计了多表位疫苗，每种疫苗都有不同的抗原选择、设计策略和预测的免疫原性特征。最近的一项多抗原计算研究确定了几种与TNBC相关的细胞外和细胞内蛋白，包括TROP-2、EpCAM、MUC-1、NECTIN4、Mesothelin和NY-ESO-1，以设计蛋白质和mRNA疫苗结构。这种设计实现了显著的患者群体覆盖，并显示出强大的计算机模拟免疫原性，包括高表位结合亲和力和免疫刺激潜力。作者提出了一种新的四部分mRNA疫苗方案，以平衡表位多样性与临床可行性[92]。另一项计算工作聚焦于MZF-1蛋白作为转移性TNBC的抗原，发现其与TLR-4和TLR-9有强烈的相互作用，结构稳定性良好，并预测了免疫反应，尽管这些设计同样需要在体内或临床上进行验证[93]。与这些设计相比，我们的研究特别针对RP6，这是一种在TNBC中具有致癌和免疫调节作用的Wnt/β-连环蛋白通路共受体。虽然其他研究主要关注经典的肿瘤相关抗原（如MUC-1、EpCAM、TRIM25），但LRP6代表了一个机制上不同的、探索较少的免疫治疗目标。这种关注使我们能够将肿瘤信号传导的相关性与免疫靶向结合起来，可能提供与针对一般表面标记物的疫苗相比的独特治疗优势。与这些研究类似，我们使用了反向疫苗学和免疫信息学工具来预测具有高抗原性和广泛HLA覆盖的CTL、HTL和B细胞表位。然而，与那些优先考虑具有潜在大量表位库的多抗原设计不同，我们的多表位设计集中在一个经过充分验证的抗原上。这种靶向策略可能降低复杂性并减少脱靶效应的风险，同时仍能实现广泛的免疫原性潜力，特别是因为LRP6在TNBC肿瘤中的过度表达很常见。此外，我们设计中的群体覆盖率（选定表位的99.04%）显著高于一些已发表的研究；例如，Zahraei等人的多抗原TNBC设计报告的覆盖率为87.75%[92]。这表明我们的表位选择方法可能在不同的遗传背景下具有更广泛的适用性。

mRNA疫苗相对于重组蛋白疫苗具有显著优势。由于mRNA疫苗的合成性质，它们的开发时间线通常更短，能够快速适应抗原。它们在制造方面具有可扩展性和成本效益，因为不需要重组蛋白疫苗所涉及的复杂蛋白质生产过程。此外，mRNA疫苗可能引发强烈的免疫反应，包括细胞免疫和体液免疫。尽管mRNA疫苗面临挑战，包括需要严格的冷链储存和分发以及稳定性问题，但由于其安全性、有效性和多功能性，它们是非常适合设计癌症疫苗的选择[94]。将癌症疫苗转化为可广泛使用的实际治疗方法多年来一直具有挑战性。几种癌症疫苗的方法正在开发中[95]。最近两种mRNA疫苗获得批准用于COVID-19，这可能标志着我们在使用mRNA疫苗进行癌症免疫治疗方面取得了重要里程碑[96]。mRNA技术允许将编码抗原的信息精确地传递到宿主细胞中，从而在细胞质内产生抗原蛋白[97]。因此，设计的疫苗是一种mRNA疫苗。在5′端是7-甲基(3-O-甲基) GpppG Cap，它可以防止外切核酸酶的攻击并促进翻译起始[98]。5′ UTR对于核糖体结合至关重要，有助于形成翻译起始复合物并调节稳定性[99]。Kozak序列（由ACCATGG组成）在真核生物核糖体的翻译起始中起着关键作用[100]。使用组织纤溶酶原激活剂（tPA）作为信号肽可以增强免疫原性，有助于表位的分泌，从而实现强化的抗原呈递[101]。PADRE或pan HLA DR结合表位是一种用于疫苗设计的T辅助肽，以诱导CD4+辅助T淋巴细胞反应[102]。作为癌症疫苗佐剂，GM-CSF通过成熟抗原呈递细胞、刺激其生长并影响CD4+辅助细胞亚群来增强免疫反应[103]。MITD增强了MHC I类表位的呈递，提高了CD8+ T细胞对细胞内病原体的反应[104]。3′ UTR对于稳定性、蛋白质表达和翻译效率至关重要[99]。长的poly(A)尾在mRNA疫苗设计中非常重要，可以增强翻译效率和RNA稳定性。这种修饰增强了蛋白质表达和细胞表面表位的呈递[105]。抗原检测方法有助于识别最佳疫苗候选物，促进个性化免疫治疗策略的开发[91]。在疫苗设计中预测MHC I和II类表位对于识别特定抗原目标并刺激细胞和体液免疫反应至关重要。这增强了疫苗的特异性、有效性和安全性，对于对抗复杂疾病至关重要。准确的表位预测有助于开发副作用最小的高效疫苗[106, 107]。进一步的构象表位提供了关于抗体识别的具体三维结构的信息，有助于精确识别抗原区域[108]。此外，疫苗设计中的对接技术有助于预测蛋白质-蛋白质相互作用，从而识别潜在的抗原-抗体结合位点，这对于理解免疫反应和设计有效疫苗至关重要[83]。在本研究中，这些计算机和生物信息学技术为这种针对TNBC中LRP6的mRNA候选物显示了有希望的结果。蛋白质翻译修饰（PTMs），如磷酸化和糖基化，会影响癌症的免疫原性，影响与免疫系统的相互作用，并指导免疫治疗策略[109]。预测GPI修饰和肉豆蔻酰化在疫苗设计中可以提供优势，如增强免疫原性、改善抗原呈递和增加疫苗稳定性[110]。前缀化，涉及将异戊二烯脂质连接到蛋白质上，可以增强膜关联，这对细胞信号传导、囊泡运输和细胞周期调节至关重要。针对这些蛋白质翻译修饰的研究旨在未来可能的制造中考虑。预测的疫苗构建物的低溶解度（0.291）在实际配方和生产中是一个实际考虑因素，因为溶解度可以影响蛋白质稳定性、配方性能和制造过程。这可以通过基于脂质体或脂质纳米颗粒的配方策略有效解决，这些策略已显示出提高溶解度有限抗原的稳定性、递送和生物利用度的潜力。尽管实验验证仍然是必要的，但脂质体递送为支持疫苗平台的翻译可行性提供了有希望和可扩展的解决方案。当前研究的一个局限性是系统的处理能力；一个更强大的图形处理单元（GPU）将能够分析更多的数据。此外，选择用于稳定我们设计的疫苗3D结构的连接器是另一个限制，这表明需要进一步研究连接器。mRNA技术还面临其他挑战，包括抗原变异性和遗传差异对疫苗效果的影响。额外的挑战包括翻译后修饰、群体特异性反应和复杂的、昂贵的制造过程。虽然免疫模拟没有明确模拟耗竭、Treg诱导、PD-1动态或细胞因子风暴风险，但它们提供了关于疫苗免疫原潜力的宝贵初步见解。这些结果指导了实验设计，并突出了TNBC免疫治疗的关键目标，为未来的体外和体内验证奠定了坚实的基础。未来的验证工作将遵循一个结构化的实验流程，以确认LRP6的生物学相关性并评估疫苗的效果。该路线图包括在TNBC（三阴性乳腺癌）细胞系中从转录水平和蛋白质水平验证LRP6的表达，评估树突状细胞在体外对抗原的摄取和呈现能力，并使用IFN-γ ELISPOT检测方法测量抗原特异性细胞免疫反应。随后将在同源TNBC小鼠模型中测试疫苗的有效性，监测肿瘤进展和生存结果以确定治疗效果。同时，还将开发和优化基于脂质纳米粒子的递送策略，以提高抗原的稳定性、细胞递送效率以及免疫激活效果。这些步骤共同构成了实验验证和转化医学进展的全面框架。

**5 结论**

三阴性乳腺癌由于其侵袭性行为和缺乏针对性的治疗方法，仍然是一个主要的临床挑战。在这项研究中，我们设计并计算验证了一种针对LRP6的创新mRNA疫苗，LRP6是与TNBC进展相关的关键受体。该疫苗表现出高预测抗原性、非致敏性、结构稳定性以及广泛的全球人群覆盖范围。计算分析（包括免疫模拟和分子对接）表明其能够激发持久的适应性免疫和先天免疫反应。尽管存在一些限制，例如计算资源方面的限制，但仍需进一步的研究在临床前和临床环境中验证这些发现。尽管如此，这项研究的结果为开发有效的LRP6靶向mRNA疫苗治疗TNBC提供了坚实的基础。

**作者贡献**

Mohammadreza Heidari：概念构思、方法制定、监督、撰写、审稿和编辑。
Pooriya Teimoori：概念构思、方法制定、实验研究、撰写原始草稿。

**致谢**

作者声明本研究未获得任何外部资金或机构支持。这项工作完全由作者独立完成，没有得到任何直接帮助或赞助。

**披露**

作者声明本研究中未使用任何人工智能生成的图像或数据。仅在手稿准备过程中使用了人工智能辅助工具进行语言编辑和语法优化。这些工具并未生成科学内容，也未影响研究设计、数据分析、结果解释或结论的形成。所有分析、解释和最终决策均由作者自行完成。

**伦理声明**

所有列出的作者都对研究的构思、设计、执行和解释做出了重要贡献。没有任何贡献者被排除在作者名单之外。所有数据均为真实准确，并且按照公认的科学标准进行收集和分析。原始数据和支持材料可应要求提供。

**利益冲突**

作者声明没有利益冲突。

**数据可用性声明**

支持本研究结果的数据可向通讯作者提出合理要求后获取。