多巴胺D4受体的激活可通过增强脊髓的抑制性张力，维持吗啡的镇痛效果并减轻耐受性

《The Journal of Pain》：Dopamine D4 receptor activation preserves morphine analgesia and attenuates tolerance by enforcing inhibitory spinal tone in rats

　　**作者列表：**
Marina Ponce-Velasco | M. ángeles Real | Adrián Ruiz-Villalba | Belén Gago | Iván Fatuarte-Juli | Mireya Moreno-Ruiz | Ismael Aranda-Bravo | Carolina Roza | Alicia Rivera

**机构：**
西班牙马拉加大学理学院细胞生物学、遗传学与生理学系

**摘要：**
基于阿片类的治疗方法的临床效果受到了适应性不良神经可塑性的严重限制，这种可塑性不仅导致了镇痛耐受性的产生，还引发了矛盾的疼痛敏感化现象。尽管这些过程涉及脊髓中的痛觉传导回路，但目前仍缺乏能够选择性抑制适应性不良可塑性而不影响阿片类镇痛效果的内源性调节系统的完整表征。先前研究发现，多巴胺D4受体（D4R）能够限制与成瘾相关的脊髓上回路的形态学变化，这使其成为调节脊髓水平阿片类诱导的神经可塑性的重要候选分子。本研究探讨了D4R激活是否能够调节与吗啡耐受性和痛觉过敏相关的脊髓机制。通过综合运用行为学、分子生物学和神经解剖学方法，我们发现D4R激活可以在维持吗啡镇痛效果的同时，减轻耐受性并预防痛觉过敏。这种效果是通过重塑背角神经系统实现的，具体包括调节非肽类C纤维传入神经、增强儿茶酚胺能神经元的活性以及调整兴奋性与抑制性神经元的平衡。在细胞层面，D4R激活会减弱CREB依赖性的信号通路，并降低I层投射神经元中神经激肽-1（NK1）受体的数量，而这些神经元是向脊髓上级痛觉中枢传递信息的主要通道。这些发现表明D4R是一种状态依赖性的调节因子，它能够选择性抑制阿片类诱导的适应性不良可塑性，同时保留镇痛效应。这些结果扩展了D4R的调节作用范围，从脊髓上级的成瘾相关回路扩展到脊髓疼痛通路，有望成为提高阿片类镇痛长期安全性的治疗靶点。

**展望：**
D4R作为连接脊髓上级成瘾相关回路与脊髓痛觉通路的关键调节因子显得尤为重要。通过抑制适应性不良可塑性并保留镇痛效果，D4R为预防耐受性和痛觉过敏提供了状态依赖性的机制。因此，靶向D4R可能成为增强阿片类疗法长期安全性和有效性的新策略。

**引言：**
反复接触阿片类药物会导致镇痛效果与逐渐出现的疼痛敏感化状态之间的分离。虽然初始的抗痛反应较为显著，但长期使用会导致耐受性的产生以及矛盾的阿片类诱导的痛觉过敏（OIH）和异常疼痛（allodynia）。这些现象反映了协调的神经适应性变化过程，其影响超出了单纯的阿片受体脱敏范围。慢性阿片暴露会促使脊髓背角发生适应性重构，表现为兴奋性与抑制性神经元的平衡失调（主要由谷氨酸能兴奋性增强引起）以及促炎信号的释放增加。脊髓I层表达神经激肽-1（NK1+）的投射神经元是将痛觉信息传递到脊髓上级中枢的主要通道。研究表明，这些神经元对痛觉过敏行为的形成至关重要。然而，目前尚不清楚内源性神经调节系统是否能够在不影响阿片类镇痛效果的情况下选择性抑制这些适应性变化。明确此类调节机制对于将阿片类药物的镇痛效果与其长期副作用分离至关重要。下行单胺能系统对脊髓痛觉处理具有强大的调控作用，但尽管去甲肾上腺素和5-羟色胺通路已被广泛研究，多巴胺能系统的调节机制在阿片类诱导的神经可塑性中的作用仍不够清晰。脊髓中的多巴胺信号通过D1类和D2类受体的对立作用对痛觉产生复杂的双向影响：D1类受体通常促进疼痛反应，而D2类受体则主要发挥抗痛效应。尽管有这些认识，但这些受体亚型在其中的具体功能贡献仍不明确，限制了我们判断不同多巴胺受体是否能分别调节镇痛效果和适应性不良可塑性的能力。

多巴胺D4受体（D4R）被认为是调节脊髓阿片类诱导的神经可塑性的关键候选分子。在脊髓上级回路中，D4R已被证明能够限制与阿片类药物成瘾相关的分子和细胞变化。鉴于D4R在脊髓背角的表达及其在C纤维痛觉受体中的抑制作用，我们假设其选择性激活可以调节阿片类诱导的适应性不良可塑性及镇痛效果的逐渐减弱。本研究通过选择性药物激活D4R，评估其调节脊髓兴奋性与抑制性平衡、背角神经回路及吗啡作用下的痛觉传导能力。

**方法：**
**实验动物：**
实验使用成年雄性Sprague-Dawley大鼠（Janvier Labs，法国Le Genest-Saint-Isle），实验开始时体重为180-200克，饲养条件为标准环境（室温22 ± 2°C、相对湿度55-60%），并提供环境丰富化设施及12小时的光暗循环（模拟黎明/黄昏转换）。实验动物可自由摄取自来水及标准啮齿类食物。实验过程符合欧盟理事会指令（2010/63/EU）和西班牙政府法规（RD 53/2013），并获得了马拉加大学伦理委员会（CEUMA 79-2019-A）的批准。所有实验设计和报告均遵循ARRIVE指南，动物使用数量及所遭受的痛苦均符合3R原则（减少动物使用、减轻痛苦、确保伦理）。为保持与我们先前研究结果的一致性，仅使用雄性大鼠。性别作为生物学变量可能的影响在讨论中进行了分析，所有数据均包含所有实验动物的结果。

**药物治疗：**
吗啡硫酸盐购自Alcaliber S.A.（西班牙马德里），获得途径需经西班牙药品和医疗器械管理局批准；PD168,077马来酸盐（D4R激动剂）和L745,870（D4R拮抗剂）由Tocris Bioscience（英国布里斯托尔）提供。所有药物均溶解在含0.9% NaCl和2% DMSO的溶剂中（根据制造商建议，DMSO的添加是为了提高PD168,077的水溶性）。PD168,077的剂量（1 mg/kg）基于其在对抗阿片类药物引起的细胞和行为变化中的效果确定。吗啡剂量（7 mg/kg）通过初步研究确定，该剂量能在连续8天每日给药后产生最大急性镇痛效果并诱导镇痛耐受性（见补充图S1A-B）。

**实验设计：**
大鼠被随机分配到不同的实验组，分别接受溶剂、吗啡、PD168,077、L745,870或吗啡+PD168,077处理。实验者对动物的身份和处理条件不知情。药物通过腹腔注射（i.p.）方式给药，持续8天。每组样本量（n）根据类似实验的经验确定。

**抗痛效果评估：**
通过测量大鼠对热刺激（尾部摆动试验）和机械刺激（von Frey试验）的痛觉反应，评估D4R激活对吗啡镇痛效果和耐受性发展的影响。实验前两天对大鼠进行适应训练。基线数据在首次给药前30分钟获取。在实验的第1天（急性期）和第8天（慢性期）评估抗痛效果。

**具体实验步骤：**
- **尾部摆动试验：**
使用尾部摆动装置（LE106，Panlab，西班牙巴塞罗那）进行，按照先前描述的方法进行。限制大鼠的活动自由度，将尾巴固定在装置平台上，用卤素灯照射尾巴背部，记录撤退潜伏期。调整刺激强度至基线潜伏期为3-5秒，设置15秒的截止时间。在给药后150分钟内每隔30分钟测量一次潜伏期，以百分比形式表示抗痛效果（%抗痛 = [(测试潜伏期 - 基线潜伏期) / (截止时间 - 基线潜伏期) × 100]。

- **von Frey试验：**
采用 ascending force 方案测量大鼠的足部撤退阈值。将大鼠放入透明塑料笼子（17厘米长×22厘米宽×14厘米高）中，让它们适应至少30分钟。用一系列力量逐渐增加的von Frey刺激丝（Ugo Basile，意大利Gemonio，力量范围1.4至26.0克）刺激足底中部。当40%的试验中出现足部撤退反应时停止实验。记录给药后150分钟内每次刺激的潜伏期，以百分比形式表示抗痛效果（%抗痛 = [(测试阈值 - 基线阈值) / (截止阈值 - 基线阈值) × 100）。

**免疫染色：**
从接受尾部摆动试验的大鼠中选取部分（每组3-7只），在最后一次给药后90分钟（用于双荧光标记）或4小时（用于单免疫组化染色）处死。大鼠先用戊巴比妥钠（60 mg/kg）麻醉至反射消失，然后进行心灌流（0.1 M磷酸盐缓冲液，pH 7.4）。脊髓通过液压提取，用4%戊二醛固定24小时，再用30%蔗糖溶液在PBS中保存72小时，最后在干冰中冷冻。使用冷冻切片机（CM 1325，Leica，德国Wetzlar）将腰椎脊髓段（L4-6）切成30微米厚的切片。

**抗体信息：**
表1和补充表S1列出了所使用的-primary和secondary抗体的详细信息。初次抗体的浓度经过实验确定，以便进行半定量评估并识别双重标记的神经元。所有实验组的切片均使用相同批次的试剂进行同时处理。

**结论：**
D4R作为连接脊髓上级成瘾相关回路与脊髓痛觉通路的关键调节因子，通过抑制适应性不良可塑性并保留镇痛效果，提供了状态依赖性的机制。靶向D4R可能成为提高阿片类疗法长期安全性和有效性的新策略。对于每种动物，至少分析了五个腰椎背角部分，以确保数据的可靠性。使用安装在奥林巴斯VS120光学显微镜（德国汉堡）上的VC50数码相机，在适当的放大倍数（10倍、60倍或100倍物镜）下捕捉灰度显微照片。OD值通过使用免疫组织化学阴性区域的测量结果进行背景校正。数据表示为相对于Vehicle处理对照组的平均百分比OD；随后分别分析I层和II层，以评估每个标记物的相对分布。对于TH IR曲张末端样纤维，评估了形态特征（面积和圆度）。每个切片至少从10个清晰聚焦的纤维中收集数据（每个纤维包含五个到九个曲张）。在双重免疫荧光实验中，量化了共表达P-CREB的NK1-、CB-、CR-和PV-阳性神经元的比例，并相对于各自神经元的总数表示。

高效液相色谱（HPLC）分析：
在先前接受了von Frey测试的大鼠中（每种处理5只），在连续8天每日给予Vehicle、吗啡和/或PD168,077后，在最后一次药物注射1小时通过斩首法处死大鼠。按照上述方法分离腰椎脊髓的L4-6节段，并分离出背部部分，用于后续的均质化、代谢物提取以及谷氨酸、GABA和甘氨酸的定量。简而言之，每个脊髓提取物在5%高氯酸中均质化，并在15,000转/分钟下离心10分钟。得到的沉淀物洗涤后，重新悬浮在1 N NaOH中，并使用Qubit蛋白测定仪（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）进行总蛋白定量，以标准化神经递质水平。上清液在70°C下与衍生化试剂孵育45分钟，该试剂由三苯基氯甲烷-1-磺酰氯溶液（3 mg/mL）、内标（0.04 nM α-氨基异丁酸在5%高氯酸中）和0.1 M碳酸氢钠缓冲液（pH 9）组成。HPLC分析使用Ultimate 3000 UHPLC-Dionex（Thermo Fisher Scientific）进行，配备反向相AcclaimTM 120 C-18柱（3 μm 4.6 x 100 mm；Thermo Fisher Scientific）。使用已知的谷氨酸、GABA和甘氨酸浓度生成标准曲线。色谱数据使用Chromeleon 7软件（Thermo Fisher Scientific）处理。神经递质水平表示为每毫克总蛋白的纳克数。

RNA分离和定量聚合酶链反应（qPCR）：
从先前接受了尾部闪避测试的大鼠亚组中收集脊髓节段（L4-6）和大脑皮层（每种处理5只）。在最后一次药物注射后的第8天，通过斩首法处死动物。根据制造商的推荐使用E.Z.N.A total RNA kit II（Omega Bio-tek，美国佐治亚州诺克罗斯）提取总RNA。使用Nanodrop One分光光度计（Thermo Fisher Scientific）测量RNA纯度（260/280比率≥1.8）和浓度。总RNA存储在-80°C。在cDNA制备之前，通过DNAse处理去除基因组DNA（Thermo Fisher Scientific）。使用iScript? cDNA Synthesis Kit（Bio-Rad，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）以每个样本500 ng的总RNA进行cDNA合成。

引物（表2）使用Primer-Blast（GeneBank，美国马里兰州贝塞斯达的国家生物技术信息中心）基于NCBI核苷酸数据库中的大鼠核苷酸序列设计，并使用Oligoanalyzer v3.1（Integrated DNA Technologies，美国爱荷华州科拉尔维尔）进行验证。
表2. PCR引物和扩增子信息。

**引物** | **序列（5’至3’）** | **扩增子长度（bp）**
| --- | --- | --- |
| Drd2 | NM_001409379 | 多巴胺D2受体 | FW: AGACACCACTCAAGGGCAACR | RV: CGCCTGTTCACTGGGAAACT |
| Drd4 | NM_012944 | 多巴胺D4受体 | FW: CATCAGCGTGGACAGGTTTGR | RV: GACAGGGCAGGAAGAAGGAA |
| Eef1e1 | NM_001106106.1 | 真核生物翻译延长因子1 epsilon 1 | FW: CAGACTCTGCTGAAGGATCTC | RV: AATGTGGCAAAACCAGCGAG |
| Oprd1 | NM_012617.1 | Delta阿片受体（DOR） | FW: GGTCTTGGCTTCAGGTGTTG | RV: ACGGTGATGATGAGAATGGGC |
| Oprk1 | NM_00131874 | Kappa阿片受体（KOR） | FW: TGGTGTTTGTGGTGGGCTT | RV: GCACTCTGGAAGGGCATAGT |
| Oprm1 | NM_00103859 | Mu阿片受体（MOR） | FW: GCCATCGGTCTGCCTGTAATR | RV: GGAGAACGTGAGGGTGCAAT |
| Tbp | NM_001004198.1 | TATA框结合蛋白 | FW: GCACAGGAGCCAAGAGTGA | RV: CTGAACTGCTGGTGGGTCAA |

qPCR反应包含相当于5 ng初始RNA的cDNA、0.5 μM的前向和反向引物浓度以及FastStart Essential DNA Green Master mix（Roche，瑞士巴塞尔）。扩增在LightCycler 96仪器（Roche）上进行，使用以下方案：95°C预热5分钟，然后是45个循环，每个循环包括95°C 10秒、60°C 20秒和72°C 20秒。通过熔解曲线分析（LightCycler480，Roche）和3%琼脂糖凝胶电泳（补充图S2A-C）确认产物特异性。

为了确保qPCR实验的准确量化，进行了参考基因的稳定性分析。根据先前的研究选择了几个候选参考基因（Eef1e1、Hprt1、H2az1、Pgk1、Pppia、Rpl13a、Tbp），并在包括药物处理和组织样本类型在内的八种实验条件下评估了它们的稳定性。这项分析确定Eef1e1和Tbp是最适合的参考基因组合。

扩增曲线的数据导出到LinRegPCR程序以确定PCR效率和初始cDNA量（N0）。使用每个样本的两个选定参考基因的几何平均值对N0值进行标准化。使用Factor-qPCR程序校正运行之间的系统差异。

**统计分析**：
数据以平均值±标准误差（SEM）表示。使用Student’s t检验、单因素或双因素方差分析（ANOVA）以及随后的Bonferroni post hoc检验（参数数据）或Kruskal-Wallis分析以及随后的Dunn’s post hoc检验（非参数数据）进行统计比较。当相同的动物在时间上被重复测量时，应用双因素重复测量ANOVA。统计显著性设定为p < 0.05。所有分析均使用SigmaStat 3.5软件（Systat Software，美国加利福尼亚州圣何塞）进行。

**结果**：
**D4R激活减弱吗啡诱导的镇痛耐受性和痛觉过敏**
为了研究D4R对吗啡诱导的镇痛效应和耐受性发展的影响，使用尾部闪避测试和von Frey测试分别评估了对热刺激和机械刺激的行为反应，在急性（8天）和慢性药物给药后进行了评估。与先前的研究结果一致15，无论是急性还是慢性给药D4R激动剂PD168,077均未引发可检测到的镇痛效应（图1A-B, A’-B’）。相比之下，使用选择性拮抗剂L745,870进行慢性D4R阻断在von Frey测试中引发了机械性痛觉过敏（图1B’）。

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**图1. D4R刺激和阻断对热痛觉和机械痛觉的影响**。在急性（A, B）和慢性（8天）（A’-B’）给药D4R激动剂PD168,077或D4R拮抗剂L745,870后，通过尾部闪避（A-A’）和von Frey（B-B’）测试评估镇痛反应的百分比变化时间过程。急性或慢性PD168,077均未引发镇痛效应，而慢性D4R阻断引发了机械性敏感化。数据以平均值±标准误差（n = 8-9每组）表示。统计显著性通过双因素重复测量ANOVA以及随后的Bonferroni post hoc检验确定；*p < 0.05 vs. Vehicle。

**急性联合给药PD168,077与吗啡产生了与单独使用吗啡相当的镇痛时间过程**（图2A, B），特征是在注射后30-60分钟达到镇痛高峰，随后在150分钟内逐渐下降。值得注意的是，在von Frey测试中，D4R激活延长了吗啡的镇痛效果，在120分钟时间点镇痛效果显著更高（约高于单独使用吗啡25%）（图2B）。

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**图2. D4R激活减弱吗啡诱导的镇痛耐受性**。在急性（A, B）和8天慢性（A’, B’）给药吗啡期间，无论是单独给药还是与D4R激动剂PD168,077联合给药，通过尾部闪避（A-A’）和von Frey（B-B’）测试评估镇痛反应的百分比变化时间过程。急性PD168,077给药对吗啡诱导的镇痛没有显著影响。然而，联合给药PD168,077在慢性吗啡治疗期间显著抑制了镇痛耐受性的发展（A’’, B’’）。急性（A’’, B’’）和慢性（A’, B’’）治疗的总体镇痛效应，以曲线下面积（AUC）表示。数据以平均值±标准误差（n = 8-12每组）表示。统计显著性通过双因素重复测量ANOVA以及随后的Bonferroni’s post hoc检验确定；*p < 0.05 vs. Vehicle; **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. Vehicle; #p < 0.05, ##p < 0.01, ###p < 0.001 vs. 吖啡; ••p < 0.01, ####p < 0.001 vs. 慢性 vs. 急性治疗**。

在8天的慢性治疗后，单独接受吗啡的大鼠表现出明显的耐受性，表现为镇痛效果显著降低（图2A’, B’）。这种效应在尾部闪避和von Frey测试中都一致观察到，并且通过联合给药吗啡+PD168,077显著减弱（图2A’, B’）。通过AUC计算进一步支持了这些发现。慢性吗啡给药导致AUC显著降低（尾部闪避降低约70%，图2A’’；von Frey降低约48%，图2B’’），表明耐受性的发展。相比之下，慢性联合给药吗啡+PD168,077导致AUC显著降低（尾部闪避降低约40%，图2A’’；von Frey降低约25%，图2B’’）。

接下来，我们研究了D4R在调节吗啡诱导的外周敏感性和相关感觉改变中的作用。我们的结果表明，慢性吗啡暴露显著引发了热痛觉过敏，而D4R激动剂的联合给药完全防止了这种效应（图3A）。未观察到显著的机械性痛觉过敏（图3B）。

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**图3. D4R激活阻止吗啡诱导的热痛觉过敏**。（A）热痛觉过敏和（B）机械性痛觉过敏通过尾部闪避和von Frey测试确定的基线痛觉阈值的变化百分比（Δ = 第8天 - 第1天）来评估。慢性吗啡给药降低了基线热痛觉阈值，而联合给药PD168,077完全逆转了这一效应。数据以平均值±标准误差（n = 8-12每组）表示。统计分析使用单因素ANOVA以及随后的Bonferroni’s post hoc检验或Kruskal-Wallis测试以及Dunn方法进行。**p < 0.01 vs. Vehicle; #p < 0.05 vs. 吖啡**。

**总体而言，这些发现表明D4R激活不干扰急性吗啡的镇痛效果，但能有效减弱耐受性的发展，并防止慢性给药后的吗啡诱导的热痛觉过敏**

**慢性D4R激活在吗啡治疗期间不改变脊髓中的阿片类或D2样多巴胺受体表达**
先前的研究表明，选择性激活D4R可以调节大鼠尾状核壳内的MOR表达和信号传导18, 21，这有助于D4R激活对吗啡诱导的成瘾的拮抗作用15。鉴于阿片受体在吗啡镇痛中的重要作用25以及我们观察到D4R激活减弱了对吗啡的耐受性发展，我们假设D4R可能通过调节阿片受体基因表达来影响阿片类镇痛效果。为了测试这一点，我们检查了慢性治疗后背角中MOR、DOR（delta阿片受体）和KOR（kappa阿片受体）的mRNA表达水平。qPCR分析显示，与Vehicle对照组相比，Oprm1（MOR；图4A）、Oprd1（DOR；图4B）或Oprk1（KOR；图4C）的mRNA水平没有显著变化。

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**图4. 慢性D4R激动剂和吗啡治疗不影响背角中的阿片类或D2样受体表达**。（A-C）阿片受体基因Oprm1（MOR；A）、Oprd1（DOR；B）和Oprk1（KOR；C）的mRNA表达水平以平均值±标准误差（n = 5每组）表示，根据初始mRNA量（N0）计算并归一化到两个参考基因Tbp和Eef1e的表达水平。（D）表示在慢性吗啡和/或PD168,077处理后8天背角中MOR IR的代表性显微照片。比例尺为125 μm。I层和II层内MOR IR的半定量分析显示在相邻的条形图中。数据以平均值±标准误差（n = 7-8每组）表示，并归一化为相对于Vehicle处理对照组的百分比；层别分别进行分析。（E-F）多巴胺受体基因Drd4（D4R；E）和Drd2（D2R；F）的mRNA表达以平均值±标准误差（n = 4-5每组）表示，根据初始mRNA量（N0）计算并归一化到两个参考基因Tbp和Eef1e的表达水平。所有统计分析使用单因素ANOVA以及随后的Bonferroni’s post hoc检验进行。缩写：D2R，多巴胺D2受体；D4R，多巴胺D4受体；DOR，δ阿片受体；IR，免疫反应性；KOR，κ阿片受体；MOR，μ阿片受体。由于MOR蛋白的分布具有层次特异性，在I层中的密度显著低于II层（I层，88.7% ± 2.8；II层，111.3% ± 2.8；p < 0.001，学生t检验；数据表示平均值OD值±SEM，以整个背角表面的百分比表示）（图4D），我们进行了层次特异性分析以评估潜在的微观变化。与mRNA数据一致，长期使用吗啡和/或PD168,077并未显著改变MOR的免疫反应性（图4D）。鉴于脊髓中的D2样受体参与多巴胺介导的疼痛调节，并且已被证明会被长期吗啡上调26，我们随后测量了Drd2（D2R，多巴胺D2受体）和Drd4（D4R）的mRNA水平。在任何长期药物治疗后，均未观察到Drd2或Drd4转录水平的显著变化（图4E，F）。

D4R的激活改变了与非肽类IB4+ C纤维和背角内的儿茶酚胺能投射相关的神经化学标志物。长期使用阿片类药物会导致初级传入伤害感受器的适应性可塑性变化，影响肽类和非肽类C纤维28, 29，从而促进耐受性和阿片类药物诱导的敏化。为了探讨D4R的激活是否会影响这些过程，我们分析了背角表面CBRP、SP和IB4的变化。如前所述，CGRP的免疫反应性（图5A）和SP的免疫反应性（图5B）主要位于I层和II层的外部分（IIo），而IB4的结合（图5C）则集中在II层的内部分（IIi）30。单独或与PD168,077联合使用的长期吗啡处理并未显著改变背角中的CGRP免疫反应性（图5A）。相比之下，长期吗啡和与PD168,077联合使用显著增加了神经丝中的SP免疫反应性（分别增加了约20%和约25%；图5B）。关于非肽类C纤维，单独使用PD168,077治疗导致IB4结合增加了约40%，与吗啡联合使用时也观察到类似的效果（增加了约48%；图5C）。

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图5. 长期D4R激活会导致背角中非肽类IB4+ C纤维和儿茶酚胺能投射的适应性变化。 (A-D) 代表性显微照片及相应的半定量光密度分析，显示了在8天长期使用吗啡和/或PD168,077处理后，背角表面CBRP免疫反应性（A）、SP免疫反应性（B）、IB4结合（C）和TH免疫反应性（D）的变化。数据表示为平均值±SEM（每组n = 5-7），并归一化为与溶剂处理对照组的百分比。统计显著性通过Kruskal-Wallis检验后进行Dunn方法确定，*p < 0.05，**p < 0.01 vs. 溶剂；#p < 0.05，##p < 0.01 vs. 吗啡。A-C中的刻度尺为150 μm，D中的刻度尺为10 μm。 (E-F) 对I-II层中TH免疫反应性的形态测量分析，显示了按面积（μm2）（E）和圆度（F）分类的频率分布（占总免疫反应性的百分比）。数据表示为平均值±SEM（每组n = 5-7）。统计分析使用单因素方差分析后进行Bonferroni事后检验或Kruskal-Wallis检验后进行Dunn方法。缩写：CGRP，降钙素基因相关肽；IB4，异 lectin B4；IR，免疫反应性；SP，P物质；TH，酪氨酸羟化酶。

考虑到儿茶酚胺能系统的关键作用，包括来自上位脊髓区域的下行投射和初级伤害感受器纤维在调节背角内伤害感受处理中的作用11，我们接下来研究了长期吗啡处理和/或同时D4R刺激是否可能在该系统中引起适应性变化。为此，我们分析了I-II层中的儿茶酚胺能纤维，重点关注TH表达和轴突突出部的形态特征，这些特征被广泛认为是功能神经元活动的可靠指标。与之前观察到的IB4结合增加类似，在单独使用PD168,077或与PD168,077联合使用的长期处理后，TH的免疫反应性略有但显著增加（约10%和约17%）（图5D）。然而，形态分析显示，在所有处理组中，TH免疫反应性轴突突出部的平均大小（图5E）和圆度（图5F）没有显著变化。

这些发现共同表明，D4R的激活与特定初级传入神经元群体的神经化学标志物变化有关，特别是非肽类IB4+ C纤维以及背角中的儿茶酚胺能投射，可能在长期吗啡暴露期间影响伤害感受处理。

D4R的激活抵消了吗啡引起的vGluT2的下调，但上调了背角中的vGAT。在背角中，谷氨酸能兴奋和GABA能/甘氨酸能抑制之间的平衡决定了伤害感受处理和传递5。神经理释的失调，特别是谷氨酸的失调，被认为与吗啡耐受性的发展有关1。因此，我们测量了背角匀浆中的整体神经递质水平，以评估D4R介导的吗啡耐受性减弱是否与谷氨酸、GABA或甘氨酸信号的变化有关。长期使用吗啡、PD168,077或它们的组合并未显著改变背角中的总谷氨酸（图6A）、GABA（图6B）或甘氨酸（图6C）浓度相对于溶剂对照组。

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图6. 长期D4R激动剂和吗啡联合使用上调背角中的vGAT表达。 (A-C) 在每天使用吗啡和/或PD168,077处理8天后，通过HPLC测量的背角表面（I-II层）中的谷氨酸（A）、GABA（B）和甘氨酸（C）的组织浓度（ng/mg蛋白质）。各处理组之间没有显著差异。数据表示为平均值±SEM（每组n = 5），并通过单因素方差分析进行分析。 (D-E) 同一处理组中背角表面（I-II层）的vGluT2免疫反应性（D）和vGAT免疫反应性（E）的代表性显微照片及相应的半定量光密度分析。数据表示为平均值±SEM（每组n = 5），并归一化为与溶剂处理对照组的百分比，分别对每个层进行比较。统计分析使用Kruskal-Wallis检验后进行Dunn方法或单因素方差分析后进行Bonferroni事后检验。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001 vs. 溶剂；#p < 0.05 vs. 吗啡。刻度尺为150 μm。缩写：IR，免疫反应性；vGAT，囊泡GABA转运蛋白；vGluT2，囊泡谷氨酸转运蛋白亚型2。

尽管在HPLC实验中没有检测到这些神经递质水平的明显变化，我们假设在微观层面和/或背角的特定层中可能发生了变化。为了验证这一假设，我们评估了背角I-II层中vGluT2和vGAT的免疫反应性密度，因为它们分别在兴奋性和抑制性末梢负责将谷氨酸和GABA/甘氨酸装载到突触前囊泡中31, 32, 33, 34。在整个脊髓神经丝中观察到广泛的vGluT2免疫反应性和vGAT免疫反应性的点状标记（图6D和图6E）。与II层相比，I层中的这两种标志物表达更高（vGluT2：I层，118.5% ± 1.0；II层，82.4% ± 2.3；p < 0.001，学生t检验；vGAT：I层，115.0% ± 1.9；II层，85.0 ± 1.9；p < 0.01，学生t检验；数据表示为平均值OD值±SEM，以背角表面总免疫反应性的百分比表示）。如图6D所示，8天长期吗啡处理导致I层（约25%）和II层（约20%）中的vGluT2免疫反应性显著下降，而与PD168,077联合使用则完全抵消了这一下降。相比之下，单独使用长期吗啡时vGAT免疫反应性保持不变，但在同时使用吗啡和PD168,077的动物中显著增加（I层：约88%；II层：约78%）（图6E）。单独使用长期PD168,077在I层中导致vGluT2适度但显著的下降（约13%），而在II层或任一层中与溶剂对照组相比均未观察到vGAT免疫反应性的显著变化。

因此，尽管全球神经递质水平看似稳定，D4R的激活似乎与涉及谷氨酸和GABA/甘氨酸装载的囊泡转运蛋白表达的变化有关，表明背角表面趋向于更抑制性的微环境。

在长期吗啡处理期间，D4R的激活减少了I层投射神经元中的NK1受体表达和CREB依赖性激活。鉴于长期吗啡会增加背角中的P-CREB表达，这是阿片耐受性的一个关键驱动因素35，我们假设D4R介导的吗啡耐受性减弱可能涉及这种转录因子的调节。支持这一假设的是，D4R的激活不仅抵消了吗啡引起的P-CREB上升（约39%），还将其表达降低到低于对照组水平（约40%）（图7A）。

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图7. 长期D4R激动剂和吗啡联合使用下调I层投射神经元中的NK1受体表达和P-CREB激活。 (A) 背角表面的P-CREB免疫反应性及8天长期吗啡和/或PD168,077处理后的相应定量分析。图表显示了P-CREB+核的密度（核/毫米2）。数据表示为平均值±SEM（每组n = 3），并归一化为与溶剂处理对照组的百分比。 (B-D) P-CREB（蓝色）和钙结合蛋白（绿色）的双标记免疫荧光：CB（B）、CR（C）和PV（D）。直方图显示了每种中间神经元亚型的总密度，内部实线表示P-CREB共表达的百分比。数据表示为平均值±SEM（每组n = 3）。 (E) I层投射神经元中的NK1免疫反应性及半定量光密度分析。数据表示为平均值±SEM（每组n = 3），并归一化为与溶剂处理对照组的百分比。 (F) I层投射神经元中P-CREB（蓝色）和NK1（红色）的双标记。直方图显示了NK1+投射神经元的百分比，内部实线表示P-CREB阳性亚群。数据表示为平均值±SEM（每组n = 3）。统计分析使用Kruskal-Wallis检验后进行Dunn方法或单因素方差分析后进行Bonferroni事后检验。*p < 0.05，vs. 溶剂；#p < 0.05 vs. 吗啡。刻度尺为20 μm。缩写：CB，钙结合蛋白；CR，钙视网膜蛋白；IR，免疫反应性；NK1，神经激肽-1受体；P-CREB，磷酸化cAMP反应元件结合蛋白；PV，小清蛋白。

鉴于儿茶酚胺能系统在调节背角内伤害感受处理中的关键作用，包括来自上位脊髓区域的下行投射和初级伤害感受器的纤维11，我们接下来研究了长期吗啡处理和/或同时D4R刺激是否可能在该系统中引起适应性变化。为此，我们分析了I-II层中的儿茶酚胺能纤维，重点关注TH表达和轴突突出部的形态特征，这些特征被广泛认为是功能神经元活动的可靠指标。与之前观察到的IB4结合增加类似，在单独使用PD168,077或与PD168,077联合使用后，TH的免疫反应性略有但显著增加（约10%和约17%）（图5D）。然而，形态分析显示，在所有处理组中，TH免疫反应性轴突突出部的平均大小（图5E）和圆度（图5F）没有显著变化。

这些发现共同表明，D4R的激活与特定初级传入神经元群体的神经化学标志物的变化有关，特别是非肽类IB4+ C纤维以及背角中的儿茶酚胺能投射，可能在长期吗啡暴露期间影响伤害感受处理。

D4R的激活在背角表面对抗了吗啡引起的vGluT2的下调，但上调了vGAT。在背角中，谷氨酸能兴奋和GABA能/甘氨酸能抑制之间的平衡决定了伤害感受处理和传递5。神经理释的失调，特别是谷氨酸的失调，已被认为与吗啡耐受性的发展有关1。因此，我们测量了背角匀浆中的整体神经递质水平，以评估D4R介导的吗啡耐受性减弱是否与谷氨酸、GABA或甘氨酸信号的变化相关。长期使用吗啡、PD168,077或它们的组合并未显著改变背角中的总谷氨酸（图6A）、GABA（图6B）或甘氨酸（图6C）浓度相对于溶剂对照组。

尽管在HPLC实验中未检测到这些神经递质水平的显著变化，我们假设在微观层面和/或背角的特定层中可能发生了变化。为了验证这一假设，我们评估了背角I-II层中vGluT2和vGAT的免疫反应性密度，因为它们分别负责在兴奋性和抑制性末梢将谷氨酸和GABA/甘氨酸装载到突触前囊泡中31, 32, 33, 34。在整个脊髓神经丝中观察到广泛的vGluT2免疫反应性和vGAT免疫反应性的点状标记（图6D和图6E）。与II层相比，I层中的这两种标志物表达更高（vGluT2：I层，118.5% ± 1.0；II层，82.4% ± 2.3；p < 0.001，学生t检验；vGAT：I层，115.0% ± 1.9；II层，85.0 ± 1.9；p < 0.01，学生t检验；数据表示为平均值OD值±SEM，以背角表面总免疫反应性的百分比表示）。如图6D所示，8天长期吗啡处理导致I层（约25%）和II层（约20%）中的vGluT2免疫反应性显著下降，而与PD168,077联合使用则完全抵消了这一下降。相比之下，单独使用长期吗啡时vGAT免疫反应性保持不变，但在同时使用吗啡和PD168,077的动物中显著增加（I层：约88%；II层：约78%）（图6E）。单独使用长期PD168,077在I层中导致vGluT2适度但显著的下降（约13%），而在任一层中与溶剂对照组相比均未观察到vGAT免疫反应性的显著变化。

因此，尽管总体神经递质水平看似稳定，D4R的激活似乎与参与谷氨酸和GABA/甘氨酸装载的囊泡转运蛋白的表达变化有关，表明背角表面趋向于更抑制性的微环境。

在长期吗啡处理期间，D4R的激活减少了I层投射神经元中的NK1受体表达和CREB依赖性激活。鉴于长期吗啡会增加背角中的P-CREB表达，这是阿片耐受性的一个关键驱动因素35，我们假设D4R介导的吗啡耐受性减弱可能涉及这种转录因子的调节。支持这一假设的是，D4R的激活不仅抵消了吗啡引起的P-CREB上升（约39%），还将其表达降低到低于对照组水平（约40%）（图7A）。

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图7. 长期D4R激动剂和吗啡联合使用下调I层投射神经元中的NK1受体表达和P-CREB激活。 (A) 背角表面的P-CREB免疫反应性及8天长期吗啡和/或PD168,077治疗后的相应定量分析。图表显示了P-CREB+核的密度（核/毫米2）。数据表示为平均值±SEM（每组n = 3），并归一化为与溶剂处理对照组的百分比。 (B-D) P-CREB（蓝色）和钙结合蛋白（绿色）的双标记免疫荧光：CB（B）、CR（C）和PV（D）。直方图显示每种中间神经元亚型的总密度，内部实线表示P-CREB共表达的百分比。数据表示为平均值±SEM（每组n = 3）。 (E) I层投射神经元中的NK1免疫反应性及半定量光密度分析。数据表示为平均值±SEM（每组n = 3），并归一化为与溶剂处理对照组的百分比。 (F) I层投射神经元中P-CREB（蓝色）和NK1（红色）的双标记。直方图显示了NK1+投射神经元的百分比，内部实线表示P-CREB阳性亚群。数据表示为平均值±SEM（每组值得注意的是，长期联合使用吗啡和PD168,077治疗能够同时下调NK1受体的表达（约23%；图7E），并将表达P-CREB的NK1+投射神经元的比例从约50%降低到约20%（图7F）。这些结果共同表明，D4R的激活可能通过减少I层投射神经元中的NK1受体表达和CREB依赖性信号传导来减弱吗啡引起的耐受性，从而可能有助于减少向脊髓上级目标的痛觉信号传递。

**讨论**
阿片类镇痛效果的逐渐下降，以及耐受性、OIH（止痛效果减弱）和成瘾等不良反应的出现，严重限制了阿片类药物的长期临床使用。虽然其确切机制尚不清楚，但越来越多的证据表明，介导阿片类镇痛的神经基础与导致适应性神经可塑性和不良反应的神经基础之间存在功能差异。因此，识别差异调节这些过程的分子和细胞成分对于开发更安全的治疗策略至关重要。在此框架下，本研究探讨了D4R在调节吗啡镇痛作用中的作用及其缓解慢性吗啡暴露相关不良反应的潜力。我们之前的工作已经确定D4R是纹状体回路中吗啡诱导的分子和细胞神经适应的负调节因子，可以防止成瘾的发展和巩固。在这里，我们进一步表明，同时使用D4R激动剂PD168,077和吗啡可以保持镇痛效果，显著减弱镇痛耐受性，并完全防止OIH的发生。此外，选择性拮抗剂L745,870的药理阻断会引发机械性过敏反应，这表明内源性D4R信号传导对于维持正常的机械阈值是必需的。

**D4R对下行儿茶酚胺能控制的调节**
去甲肾上腺素和5-羟色胺分别通过蓝斑核和缝核的下行投射来调控疼痛。相比之下，尽管有强有力的证据表明多巴胺能控制在功能上的重要性，但对此的关注较少。这一点在帕金森病中尤为明显，因为多巴胺能通路的退化会改变疼痛感知和痛觉处理。脊髓的多巴胺能神经支配主要来源于下丘脑的A11神经元，并通过D2样受体降低背角的兴奋性来抑制有害和无害刺激的反应。我们的研究结果表明，D4R的激活增加了脊髓中的TH受体表达，表明儿茶酚胺能张力有所增强。由于A11神经元和蓝斑核神经元中不存在D4R表达，这种效应可能是通过扣带回和前额叶皮质中表达D4R的神经元介导的，这些神经元分别支配A11神经元和蓝斑核。此外，背根神经节中也存在一个特定的儿茶酚胺能神经元亚群，这可能提供了另一种外周部位来调节感觉信号传导。多巴胺受体在疼痛回路中广泛表达，已有研究表明D2样受体参与抗痛作用，并与阿片受体相互作用，从而调节阿片类诱导的镇痛和耐受性。然而，不同D2样受体亚型（D2R、D3R和D4R）的相对贡献仍存在争议，这主要是由于它们作用的不同以及缺乏选择性药物工具。解剖学和功能学证据表明，D4R在脊髓的突触前和突触后位点都有表达，支持其在初级传入痛觉神经元和二级背角神经元中起调节作用。尽管如此，无论是先前的研究还是我们的PCR分析都尚未确定其精确的亚细胞定位，这对未来的高分辨率研究来说仍然是一个重要问题。

**D4R驱动非肽类C纤维的结构重塑**
本研究的一个关键发现是D4R选择性地改变了与非肽类C纤维相关的标志物，而肽类C纤维的亚型则保持不变。长期D4R激活即使在慢性吗啡作用下也会增加突触前末梢的IB4结合能力。这与先前的研究结果一致，即D4R激活通过Cav2.2 Ca2+通道减少这些纤维中的高电压门控Ca2+电流，从而限制神经递质的释放。D4R还介导多巴胺对Aδ和C类痛觉神经元向I层投射神经元的兴奋性传递的抑制。为了阐明这种调节的结构基础，我们认为增强的IB4结合可能反映了突触前微结构的重塑。IB4能够识别携带末端α-D-半乳糖的分子，包括球苷型糖鞘脂（并以iGb3为潜在目标），以及细胞骨架成分如轻链和中链神经丝亚单位。球苷是脂质筏的关键组成部分，有助于筏相关蛋白质的高级聚集。因此，D4R对这些分子的变化可能改变脂质筏的结构和下游信号传导。例如，在法布里病中，Gb3/iGb3稳态的改变会破坏脂质筏的组织，从而影响痛觉受体的功能。同样，神经丝成分或组织的变化也会影响突触前末梢的结构和稳定性，进而影响神经递质的释放。

**D4R促进背角神经回路的抑制状态并降低NK1+投射神经元的兴奋性**
脊髓背角的痛觉信号传导由初级传入神经元和脊髓二级神经元产生的谷氨酸能兴奋与局部中间神经元介导的GABA能/甘氨酸能抑制之间的动态相互作用决定。由于谷氨酸水平升高（61, 62）或抑制作用减弱（63, 64），导致过度兴奋，这是阿片类诱导的耐受性和敏感化的基础。囊泡神经递质转运蛋白（vGluT2和vGAT）在这一平衡中起关键调节作用，通过控制谷氨酸和GABA/甘氨酸进入突触前囊泡来决定突触效能（65, 66）。在慢性吗啡处理后，vGluT2的表达显著下调，这可能是为了补偿性地限制突触前兴奋性驱动，与我们观察到的镇痛效果尚未完全消除一致。然而，同时出现的痛觉过敏表明，这种vGluT2的减少不足以防止敏化，可能还涉及其他共同的作用机制，如SP表达增加（我们的研究结果）和NMDA受体功能增强（69）。值得注意的是，D4R激动不仅防止了吗啡引起的vGluT2表达下调，还促进了vGAT的显著上调。这种对囊泡机制的双重作用（即维持兴奋性稳态同时显著增强抑制潜力）强烈表明，D4R激活使背角回路趋于以抑制状态为主。这种调节的一个核心特征是P-CREB信号的广泛抑制，P-CREB是脊髓敏感化和耐受性的公认标志物（35）。虽然慢性吗啡会病理性地诱导P-CREB表达，但D4R激活将其抑制到基线水平以下。重要的是，这种分子抑制与行为的镇痛效果保持和阿片类诱导的痛觉过敏预防相关。通过绘制不同脊髓神经元群体中的P-CREB调节图谱，我们确定了D4R可能通过两种机制对背角回路施加抑制偏见：首先，在CB中间神经元（痛觉传递的关键介质）中，CREB依赖性转录的减少可能限制促痛觉传递；其次，在吗啡耐受动物中的I层NK1+投射神经元中，P-CREB表达的维持表明疼痛信号持续传递到脊髓上级目标。鉴于NK1上调和SP释放是痛觉过敏的标志，这些活跃的NK1+投射神经元可能维持向高级中枢的痛觉驱动，从而促进耐受性的发生。值得注意的是，D4R介导的NK1受体下调与选择性消除神经元以防止阿片类诱导的痛觉过敏和耐受性的功能效果相似（6, 8），有效地关闭了脊髓的痛觉输出通道。从机制上讲，这种下调可能是由于Tacr1（NK1受体）启动子中存在功能性CRE结合位点（71）。因此，这些投射神经元中P-CREB的抑制为D4R信号传导与I层输出神经元兴奋性降低之间的分子联系提供了依据。

**关于AI和AI辅助技术的作用**
本研究中使用了基于人工智能的工具来改进手稿的语法、清晰度和可读性。所有分析、解释和结论均由作者完成。