Systematic Pharmacology Combined With Experimental Validation Reveals the Apoptosis-Related Mechanism of Simiao Yong′an (SMYA) Decoction Against Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury 中药系统药理学结合实验验证揭示四妙勇安汤抗心肌缺血再灌注损伤的细胞凋亡相关机制

《Cardiovascular Therapeutics》：Systematic Pharmacology Combined With Experimental Validation Reveals the Apoptosis-Related Mechanism of Simiao Yong′an (SMYA) Decoction Against Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury

　　

背景：根据传统中医理论，急性心肌梗死（Acute Myocardial Infarction, AMI）主要与气滞血瘀相关。四妙勇安（Simiao Yong′an, SMYA）汤是一种著名的方剂，具有清热解毒、活血止痛的功效。SMYA已被用于治疗缺血性心脏病（Ischemic Heart Disease, IHD）。然而，需要进一步分析以阐明SMYA改善AMI的具体机制，并确定其在心肌梗死急性期不同时间点的治疗效果。 本研究目的：旨在探讨SMYA在不同时间点对AMI的保护作用及其潜在机制。 材料与方法：通过超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用（Ultraperformance Liquid Chromatography-Quadrupole-Time-of-Flight Mass Spectrometry, UPLC-Q-TOF/MS）技术鉴定SMYA中的活性成分。采用综合计算机模拟方法预测这些化合物的潜在靶点，并通过与相关数据库比对建立靶点-通路关联。通过结扎左冠状动脉建立大鼠心脏缺血/再灌注（Ischemia/Reperfusion, I/R）模型，诱导缺血45分钟，再灌注24小时。SMYA治疗给药7天。在心肌梗死急性期不同时间点通过超声心动图评估心功能。使用生化试剂盒测量血清生化指标，并使用蛋白质印迹法（Western Blotting, WB）分析AKT、磷酸化-AKT（p-AKT）、PI3K、磷酸化-PI3K（p-PI3K）、BAX、Bcl-2和caspase-3蛋白。 结果：UPLC-Q-TOF/MS鉴定出SMYA中的25种成分，被视为潜在有效成分。网络分析确定了与SMYA相关的161个关键靶点和167条京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路，其中PI3K-Akt通路尤为显著。实验验证表明，SMYA显著降低大鼠心肌I/R损伤后血清中肌酸激酶同工酶（Creatine Kinase Isoenzyme, CK-MB）和乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase, LDH）的水平，并改善了左室射血分数（Left Ventricular Ejection Fraction, LVEF）和短轴缩短率（Fractional Shortening, FS）。此外，SMYA以剂量依赖性方式减少心肌细胞凋亡并激活PI3K-AKT通路。分子对接证实了SMYA成分与AKT/BCL-2的结合。 结论：本研究阐明了AMI的潜在机制及SMYA的分子作用。SMYA通过激活PI3K-AKT通路减轻大鼠I/R诱导的AMI，提示其作为心肌重构治疗靶点的潜力。SMYA的剂量和时间依赖性保护作用表明，PI3K-AKT通路及其下游靶点BCL-2构成了针对AMI新型干预措施的有希望的治疗靶点。

该论文题为《Systematic Pharmacology Combined With Experimental Validation Reveals the Apoptosis-Related Mechanism of Simiao Yong′an (SMYA) Decoction Against Myocardial Ischemia-Reperfusion Injury》，发表于《Cardiovascular Therapeutics》。研究人员针对急性心肌梗死（AMI）再灌注治疗后 paradoxical 加重的心肌损伤问题，采用网络药理学与实验验证相结合的策略，深入探究了经典中药方剂四妙勇安汤（SMYA）的治疗机制。

研究背景与意义

急性冠脉综合征（ACS）在全球范围内具有高发病率和高死亡率。尽管经皮冠状动脉介入治疗（PCI）等再灌注策略显著改善了患者预后，但缺血/再灌注（I/R）损伤常导致心肌组织进一步受损，包括恶性心律失常和无复流现象。传统中药（TCM）在心血管疾病治疗中显示出潜力，但成分复杂和作用机制不明确限制了其临床应用。SMYA由金银花、玄参、当归和甘草组成，传统用于清热解毒、活血止痛，既往研究提示其具有抗炎和抗氧化特性，但其抗心肌I/R损伤的具体活性成分及分子靶点尚不明确。因此，研究人员旨在通过系统药理学方法筛选SMYA的活性成分，并结合体内实验验证其对心肌保护的作用机制。

关键技术方法

研究人员首先利用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱联用（UPLC-Q-TOF/MS）技术鉴定SMYA含药血浆中的化学成分。随后，综合运用SwissTargetPrediction、TCMSP及DrugBank等数据库预测成分靶点，并与GeneCards、OMIM数据库中的AMI靶点取交集，构建化合物-靶点网络。通过MCODE算法进行模块分析筛选核心基因，并进行基因本体（GO）及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。体内实验采用Sprague–Dawley大鼠建立左冠状动脉前降支（LAD）结扎诱导的I/R损伤模型，随机分为假手术组、模型组、SMYA低剂量组（SMYA-L）和高剂量组（SMYA-H）。通过超声心动图评估心功能，生化试剂盒检测血清CK-MB和LDH水平，苏木精-伊红（H&E）染色和TUNEL法观察组织病理及凋亡情况，蛋白质印迹法（WB）验证PI3K-AKT通路关键蛋白表达，最后通过分子对接模拟核心成分与靶点的结合能力。

研究结果

3.1. SMYA潜在活性成分的定性分析

通过UPLC-Q-TOF/MS分析，研究人员在SMYA给药后的大鼠血浆中鉴定出25种成分，主要包括黄酮类、酚酸和萜类化合物，这些成分被确认为候选生物活性成分。

3.2. 化合物-靶点网络的建立

通过数据库检索与分析，共获得433个与25种成分相关的靶点，并与AMI疾病靶点取交集，得到161个共同靶点。拓扑学分析构建了草本-成分-靶点基因网络，揭示了SMYA治疗AMI的多靶点特性。

3.3. 核心靶基因分析

利用MCODE插件识别出包含27个关键靶点的聚类模块，通过CytoNCA插件筛选出Top 12高连接节点作为核心网络，包括AKT1、ESR1、BCL2、GAPDH、CASP3、EGFR、SRC、HSP90AA1、RELA、BCL2L1、MDM2和GSK3β。

3.4. 功能富集分析

GO分析显示生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞组分（CC）的显著富集。KEGG分析排除了疾病相关通路后，确定了PI3K-Akt、催乳素、HIF-1和甲状腺激素信号通路为关键通路，其中PI3K-Akt通路最为显著。

3.5. SMYA改善I/R大鼠心功能

血清生化检测显示，与模型组相比，SMYA-L和SMYA-H组显著降低了CK-MB和LDH水平。超声心动图结果显示，SMYA治疗逆转了I/R导致的LVEF和FS下降，且随时间推移心功能逐渐改善。H&E及TUNEL染色显示SMYA减轻了心肌形态损伤，促进了毛细血管新生并减少了细胞凋亡。

3.6. SMYA调节I/R期间PI3K-AKT通路的磷酸化

WB分析表明，I/R模型大鼠心肌组织中p-PI3K和p-AKT水平显著降低，而SMYA治疗显著增强了PI3K和AKT的磷酸化。同时，SMYA上调了抗凋亡蛋白BCL-2的表达，下调了促凋亡蛋白BAX及cleaved caspase-3的表达，呈现出剂量依赖性效应。

3.7. 预测PI3K-AKT-BCL-2通路中SMYA的活性化合物

分子对接结果显示，山奈酚（kaempferol）、3,4-二咖啡酰奎宁酸甲酯（3,4-di-o-caffeoylquinic acid methyl ester）、6-异戊烯基木犀草素（6-prenylluteolin）和甘草素（liquiritigenin）与AKT及BCL-2蛋白具有良好的结合活性，结合能分别为-7、-7、-7.1、-8.6和-6 kcal/mol。

讨论与结论

研究人员指出，心肌梗死后的心肌I/R损伤涉及氧化应激、炎症和凋亡等复杂病理生理过程。本研究通过整合化学分析与网络药理学，从SMYA中筛选出25种主要活性成分，并揭示了其通过多靶点调控PI3K-Akt信号通路发挥心脏保护作用的机制。实验数据证实，SMYA通过激活PI3K-AKT通路，调节下游BCL-2家族蛋白（上调BCL-2，下调BAX）及caspase-3的表达，从而抑制心肌细胞凋亡，改善心功能并限制不良重构。尽管研究存在依赖数据库预测和未完全解析单味药贡献等局限性，但该工作为SMYA的临床转化提供了重要的分子药理学依据。

结论部分总结道：本研究结合分析化学、网络药理学和实验验证，系统研究了SMYA治疗AMI的潜在机制。研究人员鉴定出SMYA中的25种主要成分，并通过实验证明SMYA主要以剂量和时间依赖性方式减轻心肌凋亡，其核心机制是通过激活PI3K-AKT信号通路及其下游效应因子BCL-2。这些发现不仅阐明了SMYA心脏保护特性的分子基础，也为其在缺血性心脏病管理中的进一步临床转化奠定了坚实基础。