ATR与核糖核苷酸还原酶的联合抑制在骨肉瘤细胞中表现出协同的抗癌作用

《Cancer Reports》：Combined Inhibition of ATR and Ribonucleotide Reductase Induces Synergistic Antineoplastic Activity in Osteosarcoma Cells

　　**摘要**

**背景**
骨肉瘤是儿童和年轻人中最常见的骨癌类型。自大约40年前引入化疗方案以来，其预后并没有显著改善，这凸显了需要新的治疗策略。

**目的**
本研究旨在评估联合抑制两个有前景的药物靶点——ATR和核糖核苷酸还原酶（RNR）在骨肉瘤细胞中的有效性。

**方法与结果**
我们测试了ATR抑制剂berzosertib以及RNR抑制剂triapine和doxourubicin在TP53野生型（U2OS, MG-63）和突变型（SaOS-2）骨肉瘤细胞系中的效果。通过流式细胞术分析细胞死亡、线粒体膜电位丧失和DNA片段化，以及caspase 3/7活性测定和实时RT-PCR来检测联合效应。使用联合指数分析评估了药物之间的相互作用。单独使用ATR或RNR抑制剂仅产生轻微到中等的效果，而联合使用则产生了强烈且协同的效果。ATR和RNR抑制剂共同作用导致线粒体膜电位丧失、激活caspase 3/7并触发DNA片段化，表明这两种抑制剂的联合使用诱导了细胞凋亡。细胞毒性效应与TP53的突变状态无关。

**结论**
我们的研究表明，联合抑制ATR和RNR在骨肉瘤细胞中是有效的。这些体外发现为进一步研究ATR和RNR抑制剂联合作为骨肉瘤新治疗策略的潜力提供了支持。为了检测RNRi在骨肉瘤（OS）细胞中潜在的类别效应，我们还研究了结构上不同的RNRi衍生物didox。Berzosertib与didox的组合在U2OS细胞中引起的细胞死亡效果与与tripine的组合相当（图1B）。因此，置信区间（CI）分析显示，除了0.25和0.5 μM的berzosertib与50 μM的didox以及0.5 μM的berzosertib与100 μM的didox的组合外，所有组合都表现出协同作用（表4）。在MG-63细胞中，didox作为单一药物时几乎无效，细胞死亡率最高为3.3%±0.4%，而与berzosertib联合使用时，didox诱导的细胞死亡率达到了22.8%±1.6%。CI分析确认，除了这两种药物最低浓度的组合外，所有组合都产生了协同效应（表5）。在SaOS-2细胞中，berzosertib与didox的组合效果明显弱于berzosertib与tripine的组合，CI分析仅显示两种didox最高浓度组合具有协同作用（表6）。

**表4. U2OS细胞中berzosertib与didox组合的CI值**
| Berzosertib (μM) | Didox (μM) | CI |
|-------------|-----------|------|
| 0.25 | 50 | 1.552 |
| 0.25 | 100 | 1.077 |
| 0.25 | 150 | 0.563 |
| 0.25 | 200 | 0.286 |
| 0.5 | 50 | 1.577 |
| 0.5 | 100 | 0.730 |
| 0.5 | 150 | 0.320 |
| 0.5 | 200 | 0.224 |
| 1.0 | 50 | 0.841 |
| 1.0 | 100 | 0.397 |
| 1.0 | 150 | 0.272 |
| 1.0 | 200 | 0.224 |

**注：**基于图1b的数据，CI值是用Chou–Talalay方法计算得出的。粗体CI值表示协同作用（CI值>0.9的未被视为协同作用）。

**表5. MG-63细胞中berzosertib与didox组合的CI值**
| Berzosertib (μM) | Didox (μM) | CI |
|-------------|-----------|------|
| 0.25 | 50 | 1.493 |
| 0.25 | 100 | 0.378 |
| 0.25 | 150 | 0.279 |
| 0.25 | 200 | 0.245 |
| 0.5 | 50 | 0.683 |
| 0.5 | 100 | 0.175 |
| 0.5 | 150 | 0.152 |
| 0.5 | 200 | 0.125 |
| 1.0 | 50 | 0.421 |
| 1.0 | 100 | 0.175 |
| 1.0 | 150 | 0.161 |
| 1.0 | 200 | 0.133 |

**注：**基于图1b的数据，CI值是用Chou–Talalay方法计算得出的。粗体CI值表示协同作用。

**表6. SaOS-2细胞中berzosertib与didox组合的CI值**
| Berzosertib (μM) | Didox (μM) | CI |
|-------------|-----------|------|
| 0.25 | 50 | 2.207 |
| 0.25 | 100 | 2.084 |
| 0.25 | 150 | 0.805 |
| 0.25 | 200 | 0.551 |
| 0.5 | 50 | 1.806 |
| 0.5 | 100 | 1.049 |

**3.2 Berzosertib与tripine的组合治疗在OS细胞中诱导凋亡**
为了深入了解berzosertib和tripine共同诱导的细胞死亡机制，我们通过多种检测方法评估了这种组合治疗的效果。由于大多数类型的细胞死亡，包括凋亡，都涉及线粒体[30]，我们首先通过流式细胞术分析DiOC6(3)染色来测量Δψm的变化来评估组合治疗的效果。与细胞死亡测定结果一致，berzosertib和tripine作为单一药物时作用较弱，而它们的组合在U2OS细胞中导致高达78.5%±1.4%的细胞死亡，在MG-63细胞中导致高达60.6%±3.7%的细胞死亡，在SaOS-2细胞中导致高达90.4%±2.3%的细胞死亡（图2A）。作为凋亡细胞的第二个指标，我们在24小时治疗后使用caspase 3/7的底物Ac-DEVD-AMC来评估caspase的激活情况。在U2OS和MG-63细胞中，这一检测结果与细胞死亡测量结果一致。berzosertib和tripine作为单一药物时仅引起了一定程度的caspase 3/7激活，而它们的组合则显著增强了这种激活（图2B）。然而，在SaOS-2细胞中，尽管Δψm显著降低，但caspase 3/7的活性仅略有增加。

**图2**：Berzosertib和tripine在OS细胞中共同诱导凋亡。Berzosertib给药后一小时，细胞再暴露于tripine 24小时（B）或48小时（A, C–E）。(C–E) 在berzosertib处理前1小时应用z-VAD-fmk。(A, D) 通过流式细胞术分析DiOC6(3)染色来确定Δψm的损失。(B) 使用荧光底物Ac-DEVD-AMC来确定caspase 3/7的活性；相对caspase 3/7活性是处理细胞与未处理细胞的比率。(C) 通过流式细胞术分析PI的摄取来确定细胞死亡。(E) 通过流式细胞术分析PI染色的乙醇固定细胞来确定Sub-G1细胞。每个独立测量的平均值±SEM显示（*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001；(C, D) 黑色条形对比灰色条形）。为了确认caspase激活不仅仅是旁观者效应，而是berzosertib–tripine诱导细胞死亡的关键因素，我们应用了广谱caspase抑制剂z-VAD-fmk。如图2C所示，z-VAD-fmk显著减少了U2OS和MG-63细胞中的berzosertib–tripine诱导的细胞死亡，但在SaOS-2细胞中无效，这与后者中caspase 3/7的弱激活一致。广谱caspase抑制剂也没有影响任何细胞系中berzosertib–tripine介导的Δψm损失，这表明线粒体上游的caspase并未参与（图2D）。

**3.3 Berzosertib与tripine的组合治疗在OS细胞中诱导基因表达**
我们进一步探讨了berzosertib与tripine的组合是否对OS细胞中的p53目标基因表达有影响。我们关注了两个重要的p53目标基因[31]：CDKN1A（编码周期素依赖性激酶抑制蛋白p21）和BBC3（编码促进凋亡的BCL-2家族蛋白PUMA）。实时RT-PCR结果显示，berzosertib–tripine的组合在治疗U2OS和MG-63细胞中显著增加了基因表达，而单独使用berzosertib或tripine仅产生了轻微的效果（图4）。尽管MG-63细胞中检测不到p53蛋白的表达[28]，但残留的p53活性可能足以驱动目标基因的表达。这些处理对p53缺陷的SaOS-2细胞中的CDKN1A和BBC3基因表达几乎没有影响。

**4 讨论**
本研究探讨了联合抑制ATR和RNR在OS细胞中的治疗价值。研究表明，ATRi（berzosertib）与RNRi（tripine和didox）在OS细胞中表现出协同作用，共同发挥抗癌效果。ATRi和RNRi作为单一药物在OS中的有效性已在少数研究中得到验证[17, 18, 23]，但据我们所知，本研究是首次探索ATR和RNR在OS中的联合靶向作用。最重要的是，我们的研究揭示了berzosertib与tripine或didox的组合在大多数检测浓度下通过协同作用显著超过了单一药物的效果。因此，本研究不仅补充了我们之前关于ATRi与RNRi在另一种儿童肿瘤——Ewing肉瘤（ES）[32]中联合应用的研究[32]（ES是儿童和年轻人中第二常见的原发性骨癌[33]），还扩展了这一发现。这些研究表明，ATRi–RNRi组合治疗在OS和ES细胞中同样有效。这一发现非常显著，因为这两种肉瘤在基因上存在很大差异：OS具有最高的突变率之一[34, 35]，而ES的突变率最低[37, 38]。OS的特点是染色体易位[10, 34]，导致多种基因组改变[5, 36]，而ES的突变负担非常低[37, 38]，但其特点是FET::ETS基因融合（最常见的是ESR1::FLI1[33]），这种融合蛋白编码了EWS::FLI1。因此，ES有一个明确的靶点——癌蛋白EWS::FLI1，而OS由于基因组异质性而没有这样的明确靶点。然而，OS和ES细胞都有一个共同点：它们都面临复制压力[39, 40]，尽管水平和机制不同，因此依赖于DNA修复通路来生存。OS和ES都与BRCA1/2突变癌症[41-43]有相似之处[44]，被称为“BRCAness”[44]，这使得它们对利用DNA修复缺陷的治疗方法敏感。因此，靶向DNA修复相关的脆弱性可能是这两种肿瘤的有效治疗途径[21, 45]。在我们之前的研究[32]中，我们已经证明了ATRi与RNRi的组合在OS细胞中有效。在这里，我们进一步证实了ATRi与RNRi的组合在OS细胞中也能诱导DNA片段化（图3E）。此外，z-VAD-fmk显著减少了U2OS和MG-63细胞中的DNA片段化，但在SaOS-2细胞中没有这样的效果，这与这些细胞中caspase 3/7激活较弱的情况一致。我们还研究了berzosertib与didox的组合是否也能诱导凋亡。通过Δψm的变化来看，这两种药物的组合在U2OS和MG-63细胞中的效果与berzosertib与tripine的组合相似（图3A，参见图2A）。在SaOS-2细胞中，berzosertib与didox对Δψm变化的效应不那么明显，这与berzosertib与didox组合在这些细胞中诱导的细胞死亡作用较弱相符。z-VAD-fmk对berzosertib与didox诱导的细胞死亡作用的影响与对berzosertib与tripine诱导的作用类似：它减少了U2OS和MG-63细胞中的细胞死亡，但在SaOS-2细胞中几乎没有影响（图3B，参见图2C）。广谱caspase抑制剂同样没有影响任何细胞系中处理诱导的Δψm变化（图3C，参见图2D）。

**3.3 Berzosertib与tripine的组合治疗在OS细胞中诱导基因表达**
我们还探讨了berzosertib与tripine的组合是否对OS细胞中的p53目标基因表达有影响。我们重点关注了两个重要的p53目标基因[31]：CDKN1A（编码周期素依赖性激酶抑制蛋白p21）和BBC3（编码促进凋亡的BCL-2家族蛋白PUMA）。实时RT-PCR结果显示，berzosertib–tripine的组合治疗显著增加了U2OS和MG-63细胞中的基因表达，而单独使用berzosertib或tripine仅产生了轻微的效果（图4）。尽管MG-63细胞中没有可检测到的p53蛋白表达[28]，但残余的p53活性可能足以驱动目标基因的表达。这些处理对p53缺陷的SaOS-2细胞中的CDKN1A和BBC3基因表达几乎没有影响。

**4 讨论**
本研究探索了联合抑制ATR和RNR在OS细胞中的治疗价值。研究表明，ATRi（berzosertib）与RNRi（tripine和didox）在OS细胞中表现出协同作用，共同发挥抗肿瘤效果。虽然已经有一些研究测试了ATRi和RNRi作为单一药物在OS中的有效性[17, 18, 23]，但据我们所知，我们是首次研究ATR和RNR在OS中的联合靶向作用。最重要的是，我们的研究表明，berzosertib与tripine或didox的组合在大多数测试浓度下通过协同作用显著超过了单一药物的效果。因此，本研究不仅补充了我们之前关于ATRi与RNRi在另一种儿童肿瘤Ewing肉瘤（ES）中联合应用的研究[32]，而且还扩展了这一发现。总体而言，这些研究表明ATRi–RNRi组合治疗在OS和ES细胞中同样有效。这一发现非常显著，因为这两种肉瘤在基因上存在显著差异：OS的突变率在儿童癌症中最高[34, 35]，而ES的突变率最低[34, 35]。OS的特点是染色体重排[10, 34]，导致多种基因组改变[5, 36]，而ES的突变负担很低[37, 38]，但其特点是FET::ETS基因融合（最常见的是ESR1::FLI1[33]）。因此，ES有一个明确的靶点——癌蛋白EWS::FLI1，而OS由于基因组异质性没有这样的明确靶点。然而，OS和ES细胞都有一个共同点：它们都受到复制压力的影响[39, 40]，尽管程度和机制不同，因此依赖于DNA修复通路来生存。OS和ES都与BRCA1/2突变癌症[41-43]有相似之处[44]，这些癌症被称为“BRCAness”[44]，使它们对利用DNA修复缺陷的治疗方法敏感。因此，针对DNA修复相关的脆弱性可能是这两种肿瘤的有效治疗途径[21, 45]。在这里以及我们之前的研究[32]中，我们已经证明了ATRi与RNRi的组合在OS和ES细胞中分别有效，这表明这种组合方案可能是这两种肿瘤的可行治疗选择。在ES中，ATR通路抑制剂与RNRi联合使用的有效性也得到了相关研究的支持[46-49]，但这些组合在OS中尚未得到研究。目前尚不清楚ATR和RNR联合抑制的有益相互作用机制。一个合理的假设是，RNR抑制降低了dNTP的浓度，从而加剧了癌细胞已经很高的复制压力。这导致ATR的激活，以应对复制压力。ATRi中和了这种保护性反应，最终导致癌细胞死亡[50]。另一个假设是，ATR抑制导致RNR亚基RRM2的降解[51]，从而进一步减少了dNTP的浓度。后者与ATR通过下调RRM2降解的SCF（周期素F）泛素连接酶复合体来稳定RRM2的发现一致[52]。我们的研究无法区分这两种机制，因为它并不是为了提供深入的机制解释而设计的。我们的结果表明，ATRi–RNRi组合治疗诱导的细胞死亡机制在不同细胞系中有所不同。在p53野生型的U2OS和MG-63细胞中，它引发了线粒体途径的凋亡，通过评估凋亡的一系列特征确定了这一点。ATRi–RNRi组合治疗导致Δψm损失，表明诱导了线粒体途径的凋亡，以及caspase 3/7的激活和Sub-G1细胞的积累。使用广谱caspase抑制剂z-VAD-fmk进一步证实了凋亡的诱导，因为它阻止了细胞死亡和DNA片段化，从而表明ATRi–RNRi在U2OS和MG-63细胞中主要依赖于caspase的细胞死亡机制。相反，在p53缺失的SaOS-2细胞中，ATRi–RNRi几乎不诱导caspase 3/7的激活，而且z-VAD-fmk也没有减少细胞死亡和DNA片段化。这表明ATRi与RNRi的组合可以在OS细胞中介导依赖于或独立于caspase的细胞杀伤，这一发现可能与OS中的肿瘤间异质性有关[7]。这项研究更具体地指出，ATRi–RNRi诱导的caspase激活可能依赖于p53，这与腺病毒在SaOS-2细胞中表达野生型p53的效果一致；在本研究中，仅在表达p53的细胞中观察到了caspase激活，而在对照组细胞中则没有观察到[53]。无论如何，从临床角度来看，重要的结果是ATRi–RNRi组合在p53功能正常和缺失的OS细胞中都表现出相似的有效性。与此发现一致的是，另一项研究表明，在OS细胞中，p53并不参与由严重DNA损伤、蛋白质周转障碍或纺锤体组装错误引发的细胞凋亡[54]。然而，应当注意的是，我们研究中的细胞凋亡反应在p53野生型细胞和p53缺失细胞之间存在差异。因此，不能排除这种联合疗法的临床疗效可能取决于p53的突变状态，而这在体外研究中是无法 investigate 的。本研究存在一些局限性，其目的是探讨ATRi与RNRi联合使用是否会对OS细胞产生协同的抗癌效果。因此，我们无法对ATRi–RNRi联合治疗的体内疗效和可能的副作用做出任何判断。未来的异种移植研究可能会回答这些问题。我们也无法对该药物组合的临床可行性和治疗窗口做出任何评价。不过，我们将研究范围限制在已经在临床试验中测试过的药物上，以便于将研究结果转化为临床应用，并且避免了任何基因实验。ATRi和RNRi都具有作为抗癌药物的潜力。这里的发现表明，通过将它们结合使用，其有效性可以进一步提高。因此，我们的体外研究表明ATRi–RNRi组合可以作为OS患者的一种新的治疗选择，并为在体内研究这种组合方法提供了依据。

作者贡献：
Natalie Aderhold：撰写原始草案、概念构思、实验设计、方法学研究、数据验证、数据可视化、软件应用、正式数据分析、数据整理、审稿与编辑。
Lisa Immesberger：实验设计、审稿与编辑、方法学研究、数据整理。
Sabine Becker：实验设计、方法学研究、审稿与编辑、数据整理。
Till Milde：撰写与编辑、概念构思。
Bernd Gruhn：概念构思、审稿与编辑、项目监督、项目管理。
Jürgen Sonnemann：概念构思、项目监督、审稿与编辑、项目管理、实验设计、方法学研究、数据验证、数据可视化、数据整理。

资金支持：
作者无需报告任何资金来源。

伦理声明：
作者无需报告任何与伦理相关的问题。

知情同意：
作者无需报告任何与知情同意相关的问题。

利益冲突：
作者声明不存在任何利益冲突。

数据可用性声明：
支持本研究结果的数据可向相应作者提出合理请求后获得。