溶解氧对冻融过程中以及金属催化氧化过程中人类生长激素稳定性的影响

《Journal of Pharmaceutical Sciences》：Dissolved oxygen effects on human growth hormone stability during freeze-thaw and metal-catalyzed oxidation

　　

宫原雄也|娜格尔·里卡达|弗里斯·沃尔夫冈

CMC实验室，研究部门，日本山口县田边制药公司

摘要

人们认为溶解氧（DO）会影响冻融（F/T）过程中的蛋白质稳定性，但其直接影响仍不清楚。本研究评估了溶解氧水平或真空脱气是否会影响人生长激素（hGH）在冻融过程中的稳定性。缓冲液在有无真空诱导表面冻结（VISF）的情况下进行了脱气处理。脱气本身并未引起颗粒形成。在冻结过程中，无论是否存在溶解气体，都会发生显著聚集。为了分离氧气的影响，将hGH溶液分别用氮气、空气或氧气平衡后，对其进行冻融循环处理或在-40°C下冷冻储存。溶解氧水平对浊度、颗粒数量和完整的LC–MS谱图没有显著影响，而SEC检测仅观察到轻微差异。然而，在金属催化的氧化条件下，氧气会改变聚集途径，具体取决于所使用的催化剂。这些发现表明，单独的溶解氧并不会显著影响hGH在冻融过程中的稳定性，但在存在催化氧化应激的情况下会变得重要。实际上，冻结过程中的蛋白质不稳定主要是由界面应力引起的，尤其是与VISF相关的应力。总体而言，这些结果有助于区分溶解气体在蛋白质配方中的化学和物理作用。

引言

水基蛋白质配方中天然含有溶解气体，其中氧气（O?）是能够引起治疗性蛋白质氧化降解的主要成分。^1,2蛋白质氧化是导致其稳定性、效力和安全性下降的主要途径，因此是配方和储存过程中的关键质量问题。³重要的是，单独的溶解氧通常不足以引发蛋白质氧化；通常需要痕量金属、过氧化物或光暴露产生的活性氧物种才能导致氧化损伤。^{4, 5, 6}

除了化学途径外，溶解气体还可能通过物理机制影响冻融（F/T）过程中的蛋白质稳定性。⁷冻结和解冻过程中产生的微气泡会在蛋白质表面形成界面应力，从而促进聚集或颗粒形成。⁸此外，冰-水界面本身也会通过吸附和冷变性现象使蛋白质不稳定。⁹由于气体溶解度在冻结过程中会增加，冷却和解冻过程中的局部气体浓度变化可能会进一步加剧微气泡形成和界面应力。¹⁰

真空脱气可以减少溶解氧并减轻氧化降解。然而，真空还可能引发真空诱导表面冻结（VISF），这会带来额外的应力。¹¹VISF通常由快速减压引发，导致液-气界面处发生蒸发冷却和局部过饱和，从而在表面形成冰核。这种方法可能会引入与整体冻结不同的界面应力。¹²重要的是，真空脱气会降低溶液中的绝对气体含量，而用N?、O?或空气进行气体置换只会改变溶解气体的类型，而不会显著降低其总体浓度。这种区别使我们能够评估蛋白质稳定性是由总气体含量还是特定溶解气体的性质决定的。¹²

尽管在生物制药加工中广泛使用脱气和技术净化，但对溶解氧和真空对F/T过程中蛋白质稳定性影响的系统评估仍然有限。人生长激素（hGH）对氧化和聚集都非常敏感¹⁴，因此是一个适合研究这一问题的模型。在这项研究中，我们通过以下方法来阐明溶解氧对hGH稳定性的影响：（i）在无VISF条件下进行真空脱气；（ii）通过用N?、空气或氧气进行气体置换来控制溶解氧水平；（iii）使用浊度、光遮挡（LO）法检测亚可见颗粒、液相色谱-质谱（LC-MS）和尺寸排阻色谱（SEC）来评估稳定性。最后，我们探讨了金属催化的氧化应激是否会影响依赖于溶解氧的聚集现象。

章节摘录

材料

磷酸二氢钠一水合物、磷酸二钠、L-组氨酸、蔗糖、硫酸铁（II）七水合物、聚山梨酯20（PS20）、乙腈（LC–MS级）和甲酸（LC–MS级）从Merck KGaA（德国达姆施塔特）购买。过氧化氢（H?O?）从Fisher Scientific（英国）获得。L-半胱氨酸由AMINO GmbH（德国弗雷尔施泰特）提供。L-抗坏血酸和二乙炔三胺五乙酸（DTPA）来自Sigma-Aldrich。

冷冻干燥机脱气对溶解氧和蛋白质浓度的影响

在脱气实验中，hGH以0.1 mg/mL的浓度制备在磷酸缓冲液中，并将4 mL溶液装入6R玻璃瓶中。使用冷冻干燥机进行脱气后，两种真空条件下的溶解氧水平均有所降低（见补充表S1）。在50 mbar压力下，溶解氧从8.2 ± 0.1 mg/L降至2.0 ± 0.1 mg/L（n = 3，平均值 ± 标准差）。在5 mbar压力下，溶解氧从8.0 ± 0.1 mg/L降至1.6 ± 0.2 mg/L（n = 3，平均值 ± 标准差），但由于溶剂蒸发，液体体积显著减少，导致蛋白质浓度

讨论

在本研究中，我们系统地评估了氧气和冷冻条件对hGH稳定性的影响。尽管溶解氧的摩尔浓度比hGH高20至200倍（溶解氧：0.06–0.87 mM；hGH：4–20 μM），但在仅含缓冲液的系统中未观察到显著氧化（见补充信息）。相比之下，如Cu2?/抗坏血酸或Fe2?/H?O?这样的催化系统会迅速促进氧化修饰。VISF显著增加了颗粒形成，且这种效应强烈依赖于缓冲液成分

结论

总之，本研究表明，单独的溶解氧不会显著影响hGH在冻融循环或冷冻储存过程中的稳定性。只有在存在氧化还原活性物质的情况下，氧气的影响才会显现出来，它可能会根据化学环境的不同而增加或减少聚集。当避免VISF时，真空脱气不会损害hGH的稳定性，这强调了区分导致不稳定的物理和化学因素的必要性。

利益冲突声明

宫原雄也受雇于田边制药公司。作者声明他们没有其他可能影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

声明

在准备本工作时，作者使用了ChatGPT 5-1来提高可读性和语言表达。使用该工具/服务后，作者根据需要对内容进行了审查和编辑，并对出版物的内容承担全部责任。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：

宫原雄也受雇于田边制药公司。

作者声明他们没有其他可能影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。