靶向NUDT21介导的原癌基因选择性多聚腺苷酸化改善结直肠癌恶性程度及转移

《British Journal of Cancer》：Targeting NUDT21-mediated alternative polyadenylation of oncogenes ameliorates colorectal cancer malignancy and metastasis

　　

背景：结直肠癌（CRC）是全球主要的致死病因之一。缺乏用于早期检测的分子标志物以及合适的靶向治疗候选物是导致CRC恶性的两个主要原因。目的：探索NUDT21在结直肠癌转移中的作用。方法：通过系统的生物信息学分析鉴定了参与结直肠癌的关键基因，随后在体外和体内进行了功能缺失（loss-of-function）和功能获得（gain-of-function）实验进行验证。结果：观察到调节选择性多聚腺苷酸化（APA）的关键因子——核苷二磷酸连接部分X型基序21（NUDT21）在恶性息肉以及人类和小鼠CRC中过表达。生存分析显示高水平的NUDT21与不良预后相关。敲低NUDT21不仅抑制细胞生长，还减少了锚定非依赖性生长（anchorage-independent growth）和癌症干性等恶性特征。RNA测序（RNA-seq）和RNA免疫沉淀测序（RIP-seq）结果表明，NUDT21优先结合众多原癌基因的近端选择性多聚腺苷酸化（APA）位点以促进其表达，从而驱动CRC的进展。针对NUDT21的老药新用（re-purposing drugs）治疗在细胞培养、类器官（organoid）、原位（orthotopic）和患者来源异种移植（PDX）的CRC模型中显示出治疗潜力。结论：这些发现表明NUDT21是结肠癌进展的关键调节因子和有前景的CRC治疗靶点。

论文解读：靶向NUDT21介导的选择性多聚腺苷酸化改善结直肠癌恶性程度及转移

研究背景与立题依据

结直肠癌（CRC）是全球第四大癌症致死原因，其发病率与男性性别、衰老、遗传及环境因素相关。尽管筛查项目旨在降低发病率，但近四分之一的患者确诊时已处于晚期伴转移，无法通过手术彻底切除。目前放化疗策略存在全身毒性、反应率低及耐药性等局限。RNA转录后的选择性切割和多聚腺苷酸化（APA）是一种广泛存在的转录后调控机制，超过50%的人类基因拥有多个多聚腺苷酸化信号（PAS）。剪切因子Im复合物（CFIm）中的NUDT21（CPSF5）亚基作为APA相关蛋白，在不同癌症类型中的报道存在争议且不一致。本研究旨在阐明NUDT21在结直肠癌中的表达模式、功能机制及潜在的靶向治疗价值。该研究成果已发表于《British Journal of Cancer》。

关键技术方法概述

研究人员整合了GEO和TCGA数据库的生物信息学分析，并利用DepMap数据筛选关键基因。通过siRNA/shRNA介导的基因沉默及CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了细胞模型。在体内实验中，建立了原位注射小鼠模型、AOM/DSS诱导的小鼠模型以及患者来源异种移植（PDX）模型。利用RNA-seq、RIP-seq（RNA免疫沉淀测序）和ChIP-seq数据分析分子机制。此外，通过Connectivity Map工具进行药物重定位筛选，并在临床样本来源的结直肠癌类器官（organoid）中验证了候选药物的疗效。

研究结果

NUDT21过表达是结直肠癌的新型关键调节因子

通过对AOM/DSS诱导的小鼠模型及四个独立人类CRC数据集的交叉分析，研究人员筛选出100个一致上调的基因。进一步结合Project Achilles数据库分析，确定NUDT21等9个基因对所有CRC细胞系的存活至关重要。在TCGA-COAD、LinkedOmics及医院收集的临床标本中，NUDT21在mRNA和蛋白水平均显著升高。对211对正常与癌组织的免疫组化（IHC）定量分析显示，NUDT21表达随癌症分期增加而上升，且与患者不良预后正相关。在AOM/DSS诱导的小鼠模型中，Nudt21的表达也随时间延长而上调。

NUDT21过表达是结直肠息肉发生的早期事件并与亚型恶性程度相关

分析显示，相较于正常结肠组织，结直肠息肉中NUDT21水平显著升高。在AOM/DSS处理两周后的小鼠模型中，随着单层上皮向多层转变，NUDT21表达开始上升。重要的是，NUDT21在有恶变风险的管状、绒毛状及管状绒毛状腺瘤中高表达，而在恶性潜能极低的增生性息肉中几乎检测不到，提示其可作为预测息肉恶性转化的生物标志物。

NUDT21缺失减弱结直肠癌的生长和恶性程度

在正常结肠上皮细胞系与多种癌细胞系对比中，NUDT21在癌细胞中高表达。利用HCT116细胞系进行NUDT21敲低实验，结果显示细胞增殖能力显著降低，软琼脂集落形成减少，癌症干细胞群（CD133⁺/CD44⁺）比例下降。反之，诱导NUDT21表达则促进细胞生长和干细胞特性。在原位移植瘤模型中，敲低NUDT21显著抑制了肿瘤生长。

NUDT21通过增强上皮-间质转化（EMT）促进结直肠癌转移

RNA-seq和RIP-seq的GO分析揭示NUDT21调控血管生成、细胞粘附及迁移等转移相关通路。敲低NUDT21损害了EMT过程（下调波形蛋白Vimentin，上调E-钙黏蛋白E-cadherin），削弱了细胞迁移能力。在体内实验中，NUDT21敲低组的肝脏转移灶数量显著减少。

NUDT21通过下调YAP1减弱结直肠癌的生长和恶性程度

通过交叉比对NUDT21敲低下调基因、CRC上调基因及APA数据库，研究人员锁定YAP1为关键下游靶标。在CRC样本中，YAP1及其下游靶点与NUDT21呈正相关。机制上，RIP实验证实NUDT21优先结合YAP1转录本的近端PAS位点，这种结合促进了短3'UTR异构体的产生，使其逃避miR-27a介导的抑制，从而增加YAP1 RNA的稳定性及蛋白表达。CRISPR/Cas9介导的YAP1近端APA位点突变降低了其表达和稳定性，并损害细胞迁移。挽救实验显示，恢复YAP1表达可逆转NUDT21敲低导致的迁移抑制及体内肿瘤生长减缓。此外，YAP1还调控ROBO4、CCL2等转移相关基因的表达。

靶向NUDT21的药物在结直肠癌模型中显示出治疗潜力

基于NUDT21敲低细胞的基因特征，研究人员通过Connectivity Map筛选出地高辛（digoxin）和哇巴因（ouabain）等候选药物。这两种药物在体外以剂量依赖性方式特异性抑制HCT116细胞存活，而不影响正常结肠上皮细胞。在机制上，它们降低了NUDT21和YAP1的表达及细胞迁移能力。在原位移植瘤模型和PDX模型中，地高辛和哇巴因治疗显著抑制了肿瘤生长及转移事件。在CRC类器官模型中，药物同样表现出抑制作用，且不影响正常类器官，同时降低了肿瘤组织中CD31（血管生成标记物）的水平。

讨论与结论

本研究通过无偏倚分析证实了NUDT21在CRC中的过表达，并指出其在癌前息肉恶性转化中的早期作用。针对NUDT21在癌症中功能的争议，本研究数据支持其作为癌基因的功能，即敲低NUDT21可抑制CRC的增殖、干性及转移。机制上，研究揭示了NUDT21通过偏好性结合YAP1等原癌基因的近端APA位点，缩短3'UTR以逃逸miRNA介导的降解，从而驱动癌症进展的独特表观转录组调控机制。最后，通过老药新用策略，证实了心脏糖苷类药物（地高辛和哇巴因）通过靶向NUDT21-YAP1轴，在多种CRC模型系统中展现出特异性的抗肿瘤疗效。这为克服CRC化疗耐药及开发新型靶向疗法提供了重要的理论依据和潜在临床转化路径。