USP7介导的ETV4去泛素化通过激活MAPK7促进非小细胞肺癌发生发展

《HUMAN MUTATION》：Deubiquitination of ETV4 by USP7 Promotes NSCLC Tumorigenesis via MAPK7 Activation

　　

癌症中的转录失调伴随着驱动增殖和代谢适应的合成代谢转录反应。研究人员先前发现致癌的ETS变异转录因子4（ETV4）的过表达与非小细胞肺癌（NSCLC）中的DNA复制、糖酵解代谢、肿瘤进展和不良预后相关。ETV4在多个NSCLC数据集（包括TCGA-LUAD和TCGA-LUSC）中显著过表达。重要的是，ETV4的表达与泛素特异性蛋白酶7（USP7）和丝裂原活化蛋白激酶7（MAPK7）的水平呈正相关。虽然已知E3连接酶组成型光形态发生蛋白1（COP1）调节ETV4的泛素化和降解，但ETV4的去泛素化机制仍不清楚。本研究揭示，USP7在NSCLC细胞中使ETV4去泛素化，保护其免受K11和K48连接的泛素化及蛋白酶体降解。ETV4转录控制MAPK通路关键基因MAPK7的表达，该基因编码细胞外信号调节激酶5（ERK5），并参与细胞增殖的调节。遗传敲低或药理学抑制USP7会影响ETV4对其靶基因MAPK7/ERK5的转录活性。USP7抑制剂P22077在体外显著减弱ETV4-MAPK7诱导的细胞增殖，并在体内抑制肿瘤生长。此外，ETV4、USP7和ERK5蛋白表达升高与NSCLC患者的不良预后相关。这些发现确定USP7调节ETV4的去泛素化、稳定性和转录活性，导致ETV4的恶性表型。抑制USP7可能是治疗ETV4失调或MAPK信号过度激活的NSCLC的一种有前景的策略。

论文解读：USP7介导的ETV4去泛素化通过激活MAPK7促进非小细胞肺癌发生发展

研究背景与立项依据

基因调控程序是发育和疾病中细胞表型的主要驱动因素，由序列特异性转录因子（TF）控制。在癌症中失调并可能引起基因表达程序深刻变化的TF分为三类：参与组织身份的主调控TF、扩增转录输出的增殖控制TF以及响应细胞外信号的信号转导TF。这些失调的转录程序可能导致癌细胞高度依赖某些TF。ETS家族致癌TF是实体瘤肿瘤发生的关键介质。研究人员先前已确定ETS变异转录因子4（ETV4）是与非小细胞肺癌（NSCLC）中糖酵解代谢、DNA复制、肿瘤进展和不良预后相关的主要失调ETS因子。然而，TF因其核定位、结构复杂性及缺乏显著的结合位点而被认为难以成药。尽管已有针对ETS DNA结合域（EDBD）的抑制剂报道，但另一种策略是针对参与翻译后修饰（PTM）的分子，如泛素化。泛素化-去泛素化是最常见的PTM，调节蛋白质稳定性、定位和活性。虽然已知E3连接酶组成型光形态发生蛋白1（COP1）介导ETV4的泛素化降解，但调节ETV4去泛素化的去泛素化酶（DUB）仍不清楚。USP7作为DUB家族成员，在多种癌症中失调，但在NSCLC中通过何种新底物发挥作用仍需探索。因此，本研究旨在阐明USP7对ETV4的去泛素化调控及其在NSCLC中的作用机制。

主要关键技术方法

研究人员利用UCSC Xena和GEO数据库进行生物信息学分析，通过差异表达分析和转录因子富集筛选关键靶点。采用免疫共沉淀（Co-IP）结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的蛋白质组学技术鉴定相互作用蛋白。通过邻近连接试验（PLA）验证蛋白互作，利用染色质免疫沉淀（ChIP）-qPCR和荧光素酶报告基因实验验证转录调控。构建稳定细胞系并使用无标记定量蛋白质组学分析。体内实验采用裸鼠异种移植瘤模型，药物干预使用USP7抑制剂P22077。临床样本来源于河北医科大学第二或第四医院2017至2020年间诊断的77例肺癌患者福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）切片，进行免疫组织化学（IHC）分析。

研究结果

4.1 ETV4在NSCLC中显示出潜在的调控作用

通过对TCGA-LUAD数据集的差异表达分析，研究人员鉴定出3826个差异表达基因（DEG）。转录因子富集分析显示，ETV4表现出最显著的过表达。在TCGA-LUSC、GSE40419、GSE31210和GSE40791等多个独立数据集中均观察到ETV4的一致上调。泛癌分析进一步表明ETV4在大多数癌症类型中上调，提示其可能作为广谱致癌基因发挥作用。

4.2 USP7与ETV4相互作用并促进其在NSCLC中的稳定性

利用UbiBrowser数据库分析人类去泛素化酶及其底物的相互作用数据，发现ETV4与USP7具有最高的相互作用评分和最显著的p值。相关性分析显示ETV4与USP7表达呈显著正相关。在H1299细胞中进行的抗ETV4抗体免疫沉淀-蛋白质组学（IP-proteomics）分析中，发现了USP7的胰蛋白酶片段与ETV4共免疫沉淀。免疫荧光实验表明ETV4和USP7在NSCLC细胞的细胞核中共定位，相互Co-IP实验证实了它们的相互作用。此外，PLA进一步验证了A549细胞中ETV4与USP7的直接相互作用。这些结果证明了USP7与ETV4在NSCLC细胞中存在物理结合。

4.3 USP7通过泛素-蛋白酶体系统（UPS）途径促进ETV4的稳定

为了探索USP7是否影响ETV4的表达，研究人员在A549和H1299细胞中通过siRNA敲低USP7或使用不可逆USP7抑制剂P22077进行处理。Western blot结果显示，这两种干预措施均抑制了ETV4蛋白的表达，且在重新引入USP7后得到恢复。使用蛋白酶体抑制剂MG132处理可阻止由USP7抑制引起的ETV4水平降低，表明USP7缓冲了ETV4的蛋白酶体依赖性降解。此外，在使用蛋白质合成抑制剂放线菌酮（CHX）处理后，USP7的酶活性抑制或敲低加速了内源性ETV4在NSCLC细胞中的降解。为了进一步评估USP7对ETV4泛素化的影响，研究人员进行了泛素化检测。结果显示，USP7的遗传消耗和药理学抑制均增加了内源性和外源性ETV4的泛素化。通过使用野生型泛素质粒和三种泛素突变体（K11、K48和K63）的实验表明，USP7过表达显著减少了HEK293T细胞中ETV4的K11和K48连接泛素化，而对K63连接泛素化无明显影响，表明K11和K48连接泛素链参与ETV4的降解并由USP7调节。

4.4 ETV4通过结合MAPK7启动子区域促进其表达

为了阐明ETV4驱动肺癌进展的分子机制，研究人员对TCGA-LUAD数据集的DEG进行了功能富集分析，这些基因主要参与MAPK和Wnt信号通路。值得注意的是，在TCGA-LUAD队列中，ETV4表达与MAPK7呈显著正相关。随后，研究人员在沉默ETV4后的三种NSCLC细胞系中进行了微阵列分析，结果显示包括MAPK7在内的多个基因在下调的“MAPK信号”通路中富集。RT-qPCR结果证实MAPK7在ETV4敲低后显著受抑制。基于上述发现，研究人员聚焦于MAPK7，因为它编码ERK5，是MAPK通路的关键分子。利用JASPAR预测MAPK7启动子区域的ETV4结合位点。ChIP实验和荧光素酶报告基因实验证实了ETV4与MAPK7启动子的直接结合并转录激活MAPK7。一致地，在多种NSCLC细胞系中，ETV4敲低导致ERK5蛋白水平下降。亚细胞分级分离实验表明，ETV4敲低导致细胞质和核区室中ERK5水平协调下降，表明ETV4调节总细胞ERK5丰度而非其核质分布。这些数据表明ETV4在NSCLC细胞中转录控制MAPK7的表达。

4.5 ETV4-MAPK7促进NSCLC细胞的增殖

为了研究MAPK7在细胞增殖中的作用，研究人员使用特异性siRNA转染敲低其表达。结果显示，MAPK7敲低降低了细胞增殖和集落形成能力。为了确定MAPK7是否参与ETV4调节的细胞增殖，研究人员建立了过表达MAPK7的A549-sh-ETV4稳定细胞。集落形成实验和EdU掺入实验显示，MAPK7过表达挽救了因ETV4敲低导致的集落形成能力和增殖缺陷。上述结果表明，MAPK7是ETV4维持NSCLC增殖的关键下游效应器。

4.6 USP7调节ETV4对MAPK7的转录调控

在TCGA-LUAD和LUSC数据集中，研究人员发现USP7与MAPK7表达之间存在显著相关性。ChIP-qPCR实验表明，敲低或药理学抑制USP7显著降低了ETV4在MAPK7启动子上的结合。RT-qPCR和Western blot分析显示，USP7敲低或抑制降低了MAPK7 mRNA和ERK5蛋白水平，这些变化在USP7重新引入后得到逆转。这些结果表明，USP7介导的ETV4稳定对于其对MAPK7的转录调控至关重要。为了研究USP7对NSCLC细胞增殖的影响，研究人员进行了MTT实验，发现P22077处理显著抑制了NSCLC细胞的增殖。在体内实验中，通过建立来自不同细胞系的异种移植模型，研究人员发现ETV4敲低显著降低了肿瘤生长速度、大小和重量，而过表达MAPK7则逆转了ETV4缺失的抑制作用。与载体对照组相比，P22077治疗显著抑制了sh-NC和sh-ETV4+OE-MAPK7组的肿瘤生长，而在sh-ETV4组中未显示出协同效应。这些发现表明，USP7抑制通过靶向ETV4-MAPK7轴以ETV4依赖性方式减弱细胞增殖和肿瘤生长。

4.7 ETV4、USP7和ERK5蛋白表达升高与NSCLC预后不良相关

为了探索ETV4、USP7和ERK5在NSCLC中的临床相关性，研究人员对77例患者的FFPE切片进行了IHC分析。阳性核ETV4染色与较大的肿瘤体积、淋巴结转移、远处转移和晚期TNM分期显著相关。核USP7染色与肿瘤体积增大和临床分期相关。胞浆ERK5表达与肿瘤体积、转移和临床分期相关。此外，Kaplan-Meier生存分析表明，ETV4、USP7、ERK5的高表达或三者共表达与较差的总生存期显著相关。因此，ETV4、USP7和ERK5的高表达可能是预测NSCLC侵袭性疾病进展和不良临床结局的有价值的生物标志物。

讨论与结论总结

泛癌分析表明ETV4失调发生在多种恶性肿瘤中，其过表达与肿瘤进展、不良预后等相关，提示ETV4可作为多种癌症的治疗靶点。本研究确定去泛素化酶USP7与ETV4相互作用，并在NSCLC中保护其免受泛素-蛋白酶体系统（UPS）介导的降解。USP7抑制破坏了ETV4对其靶基因MAPK7的转录激活，并抑制了体外ETV4-MAPK7诱导的细胞增殖和体内肿瘤生长，表明靶向USP7可能是治疗ETV4过表达肺癌的一种有前景的策略。

TF常通过UPS降解受到调节，这是细胞应激期间实现快速转录变化的关键机制。E3泛素连接酶COP1作为肿瘤抑制因子，靶向包括ETS家族在内的致癌底物进行降解。然而，抵消ETV4泛素化的特定去泛素化酶（DUB）尚不清楚。本研究揭示了USP7是第一个结合、去泛素化并稳定ETV4的DUB。IP-蛋白质组学分析、Co-IP和PLA结果证明了USP7与ETV4之间的物理相互作用。此外，药理学抑制或遗传消融USP7导致ETV4蛋白水平显著降低，而USP7重新引入恢复了ETV4表达，验证了特定的USP7-ETV4调控轴。COP1是公认的ETV4 E3泛素连接酶，而USP7也被证明能稳定ETV4，因此这两种蛋白似乎对ETV4稳定性施加相反的影响。

通过去泛素化酶活性，USP7调节靶蛋白的稳定性、功能和亚细胞定位。不同的泛素化模式导致不同的结果。K48连接的多泛素链代表蛋白酶体降解的典型信号。K63连接促进蛋白底物的自噬降解或调节非降解过程。K11连接也是一种非典型的泛素化类型，通常也作为主要的蛋白酶体降解决定子。在本研究中，研究人员发现USP7裂解ETV4的K11和K48连接多泛素链，但对K63连接链无活性。这一机制与先前报道的USP7结合Raf-1并减少其K11和K48连接多泛素化从而调节ERK1/2信号通路的机制一致。USP7对特定泛素链的选择性可能取决于其结构特征和底物的泛素化模式。目前，究竟是USP7的哪个结构域与ETV4相互作用仍在实验室研究中。总之，研究指出USP7去除ETV4的K11和K48连接多泛素化以保护其免受蛋白酶体降解，揭示了USP7在NSCLC中控制ETV4稳定性的可能机制。

MAPK级联信号将细胞外刺激转导为多种细胞内反应，包括转录重编程。最典型的模式之一是MAPK ERK1/2信号/PEA3-ETS蛋白稳定性轴，它通过COP1介导的ETS蛋白泛素化和降解动态地将ERK激活与转录输出耦合，将ETV4定位为MAPK信号下游的关键效应器。更有趣的是，微阵列分析确定了在NSCLC中富集于“MAPK信号”的一组常见基因，包括RAS/MAPK通路的关键负反馈调节因子DUSP5和DUSP7，暗示了ETV4在维持MAPK稳态中的潜在作用。此外，研究人员发现MAPK7/ERK5受ETV4转录调控，作为维持NSCLC增殖的关键下游效应器。ERK5具有独特的C端延伸，不同于其他MAPK家族成员，代表了一种新发现的MAPK信号通路。据报道，MAPK7/ERK5表达或其激酶活性对肿瘤发生至关重要。总之，ETV4可能是耦合ERK1/2和ERK5 MAPK信号的调控节点，尽管精确的反馈机制仍有待进一步阐明。

越来越多的证据表明，USP7的失调表达和激活与多种癌症类型的肿瘤进展和不良预后密切相关。临床前研究表明，USP7抑制剂P22077和P5091在NSCLC模型中表现出抗增殖作用。本研究表明，P22077通过抑制USP7的DUB活性降低ETV4蛋白的稳定性，从而降低ETV4蛋白水平。作为一种TF，ETV4直接调节MAPK7的转录表达。因此，P22077治疗导致ETV4水平降低，进而抑制MAPK7的表达并最终抑制肿瘤细胞的增殖。在sh-ETV4组中，由于ETV4已被稳定敲低，P22077的关键效应分子（即ETV4蛋白）大部分缺失，导致P22077对sh-ETV4细胞增殖的抑制作用相对较弱，几乎不影响肿瘤生长。预计在sh-ETV4+OE-MAPK7组中，由于ETV4被敲低且MAPK7被外源过表达，P22077也应无法有效抑制肿瘤生长。然而，实验结果显示，在sh-ETV4+OE-MAPK7细胞中，MAPK7的过表达导致ETV4表达水平显著恢复。这一现象表明，MAPK7可能通过某种反馈机制正向调节ETV4的表达，从而恢复sh-ETV4+OE-MAPK7细胞对P22077的敏感性。因此，P22077治疗有效抑制了sh-ETV4+OE-MAPK7细胞的致瘤能力，甚至导致比sh-ETV4+P22077组更小的肿瘤体积。这些发现表明，MAPK7的过表达不仅可能直接促进增殖，还通过上调ETV4表达增强其促肿瘤作用，进一步突出了ETV4-MAPK7轴在NSCLC中的关键调控作用。有趣的是，研究人员发现MAPK7过表达恢复了A549 sh-ETV4细胞中的ETV4蛋白水平，但未增加其mRNA，表明存在翻译后调控。众所周知，激活的ERK1/2信号通过将COP1锚定到核膜来稳定ETV4。推测与ERK1/2结构相似的ERK5（由MAPK7编码）可能通过类似机制稳定ETV4，形成正反馈回路。尽管如此，过表达本身可能赋予基础活性并产生部分效应。这些结果支持USP7抑制剂在治疗ETV4过表达的NSCLC中的潜在治疗价值。USP7抑制剂介导的ETV4减少降低了MAPK7的表达，进而进一步降低ETV4。这种放大的抑制效应可能允许USP7抑制剂在较低剂量下实现有效的ETV4抑制，从而扩大治疗窗口。相反，如果肿瘤存在MAPK7过表达或ERK5激活，正反馈可迅速恢复ETV4水平并驱动耐药，因此需要更高剂量的USP7抑制剂或ERK5靶向联合治疗来恢复窗口。USP7、ETV4和ERK5的表达可能作为预测NSCLC不良预后的潜在生物标志物。

综上所述，研究人员发现USP7是一种以前未被识别的去泛素化酶，它与ETV4相互作用并催化去除多泛素链以维持NSCLC中的致癌基因固定。P22077有效抑制了ETV4-MAPK7诱导的肿瘤生长，且这种抑制效应依赖于底物的可获得性。因此，USP7可能是治疗以ETV4失调或MAPK信号过度激活为特征的NSCLC的新型治疗靶点。