GREB1基因纯合移码突变导致女性不孕

《HUMAN MUTATION》：A Homozygous Frameshift Mutation in GREB1 Leads to Female Infertility

　　

原发性不孕症影响全球15%的夫妇，然而许多遗传病因仍不明确。研究人员通过对一位患有原发性不孕症且反复胚胎植入失败的女性进行全外显子组测序，在GREB1基因中发现了一个新的纯合移码突变（c.5364delC, p.Ala1789Argfs*42）。Sanger测序证实其双亲均为该突变的杂合携带者。功能研究表明，该突变未引发无义介导的mRNA降解，但通过蛋白质印迹法检测到异常的GREB1蛋白表达。计算模型预测了该突变会导致致病性的结构改变。该变异在gnomAD/ExAC数据库中不存在。研究人员的发现确立了GREB1突变是导致女性不孕症的一个新的病因，并突显了其在子宫内膜容受性调节中的作用。

论文解读：GREB1纯合移码突变导致女性不孕的机制研究

一、 研究背景、问题与目的

不孕症是影响全球超过15%育龄夫妇的常见生殖健康问题，其病因复杂，其中约15%的致病因素可能与遗传有关。已知一些基因（如TUBB8、WEE2、PATL2等）的变异与卵母细胞成熟、受精及胚胎发育障碍相关，但仍有大量潜在的致病基因和变异有待发现。GREB1（growth regulation by estrogen in breast cancer 1）基因位于2号染色体，是雌激素和孕激素信号通路的关键调节因子，在子宫、卵巢和乳腺等激素依赖性组织中高表达，参与调节细胞增殖、分化和迁移，这些过程对生殖健康至关重要。然而，GREB1基因变异是否与不孕症相关，以及该基因在生殖功能调节中的作用尚不清楚。本研究旨在通过遗传学和功能学分析，探索女性原发性不孕症与GREB1基因变异之间的潜在关联。

二、 主要关键技术方法

为探究一对临床诊断为原发性不孕夫妇的遗传病因，研究人员采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   遗传学分析：对不孕夫妇进行全外显子组测序，以识别潜在的致病性基因变异。利用生物信息学工具（如PolyPhen-2、MutationTaster、InterVar等）和公共数据库（如gnomAD、ExAC、ClinVar）对变异进行筛选、频率查询和致病性评估。通过Sanger测序对患者父母进行候选基因变异的验证，以确定其遗传模式。
2. 2.
   功能学验证：
   • •
     NMD（Nonsense-Mediated mRNA Decay，无义介导的mRNA降解）验证：针对发现的位于基因倒数第二外显子末端的GREB1移码突变，研究人员构建了包含外显子30-33区域的迷你基因（minigene）真核表达载体，并将其转染至293T细胞（NMD-EJC模型）中，通过qPCR（quantitative Polymerase Chain Reaction，定量聚合酶链式反应）比较野生型和突变型mRNA水平，以评估是否触发NMD。
   • •
     蛋白质表达分析：从患者和正常女性的子宫内膜组织中提取蛋白质，通过蛋白质印迹法（Western Blotting, WB）分析GREB1蛋白的表达水平。
   • •
     保守性与结构预测：对变异位点进行跨物种保守性分析，并利用计算模型（如SWISS-MODEL）预测突变对GREB1蛋白三维结构的影响。

三、 研究结果

3.1. 临床特征与遗传分析结果

研究人员在一名28岁原发性不孕且经历两次试管婴儿（IVF）胚胎移植失败的女性患者中，通过全外显子组测序发现了一个在gnomAD数据库中未报道的GREB1基因纯合移码突变：c.5364delC (p.Ala1789Argfs*42)。该突变发生于第31号外显子，导致第1789位的丙氨酸（Alanine）被精氨酸（Arginine）替代，并引发移码，提前引入终止密码子，造成蛋白质编码的提前终止。Sanger测序证实患者父母均为该突变的杂合携带者。生物信息学分析显示，Ala1789在不同物种中高度保守，该变异位点位于GREB1蛋白的第二个结构域中。

3.2. GREB1纯合移码突变导致的mRNA降解

通过构建野生型和突变型GREB1迷你基因真核表达载体，并转染293T细胞进行分析，结果显示突变型与野生型的mRNA水平无显著差异，表明该突变并未导致NMD的发生。这一结果在患者增殖期子宫内膜组织样本的cDNA测序中得到了进一步确认。

3.3. 蛋白质印迹分析

蛋白质印迹分析结果显示，在患者的子宫内膜组织中，GREB1蛋白的表达出现异常。研究人员预测，尽管该突变位点未引发NMD，但由于翻译的提前终止，可能导致GREB1蛋白功能发生改变。根据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）指南，该变异被归类为致病性变异（PVS1 + PM2_Supporting + PM3_Supporting）。

四、 讨论总结与研究结论

讨论部分总结：

GREB1基因在激素应答组织中扮演重要角色，受雌激素、孕激素等多种核受体调控。研究表明，GREB1表达水平在正常女性月经周期中与雌激素水平波动一致。研究人员在本病例中发现，患者在进行首次冻融胚胎移植前的内膜准备过程中，对低剂量雌激素反应不佳，导致内膜薄而取消移植。而在使用高剂量雌激素的周期中，虽能达到移植厚度但仍未孕，提示GREB1突变可能通过削弱子宫内膜对激素的反应，损害子宫内膜容受性，从而导致胚胎植入失败。先前研究也支持GREB1在子宫内膜中的关键作用，例如敲除GREB1的小鼠表现出子宫内膜蜕膜化受损和生育力降低，反复植入失败的女性子宫内膜中GREB1 mRNA表达降低。本研究发现的纯合移码突变虽不引起NMD，但导致了异常的蛋白表达，可能通过影响GREB1蛋白功能，干扰激素信号通路介导的子宫内膜细胞增殖与分化，最终引发不孕。本研究存在未进行细胞和小鼠功能实验的局限，未来需进一步验证。

研究结论翻译：

总之，本研究通过全外显子组测序，在原发性不孕的女性患者中发现了一种新的GREB1基因致病性突变。该突变预计会导致蛋白质结构异常，从而影响子宫内膜细胞的增殖和分化。这些发现为不孕症的临床诊断和遗传咨询提供了参考。