基于活检的转录组学在2022年班夫会议上对抗体介导的排斥反应类型的分析

《Kidney International Reports》：Biopsy-based Transcriptomics in Banff 2022 Antibody Mediated Rejection Categories

　　佩特拉·赫鲁巴（Petra Hruba）| 埃娃·吉尔马诺娃（Eva Girmanova）| 杜尚·哈马切克（Dusan Harmacek）| 马雷克·诺沃特尼（Marek Novotny）| 弗拉基米尔·汉扎尔（Vladimir Hanzal）| 卡特琳娜·雅克洛娃（Katerina Jaklova）| 凯斯汀·许贝尔（Kerstin Hübel）| 埃琳娜·罗（Elena Rho）| 卡伊·卡斯特雷扎纳·洛佩兹（Kai Castrezana Lopez）| 弗洛里安·韦斯特法尔（Florian Westphal）| 阿丽亚娜·加斯珀特（Ariana Gaspert）| 布里吉特·玛丽亚·赫尔姆琴（Brigit Maria Helmchen）| 赛拉伊娜·冯·莫斯（Seraina von Moos）| 卢卡斯·魏德曼（Lukas Weidmann）| 马丁·克门特（Martin Kment）| 卢德克·沃斯卡（Ludek Voska）| 托马斯·沙赫特纳（Thomas Schachtner）| 安德烈·维克利茨基（Ondrej Viklicky）

捷克共和国布拉格临床与实验医学研究所，移植实验室

**摘要**

**背景**
基于活检的转录组学（BBT）支持抗体介导的排斥反应（AMR）诊断，但2022年Banff分类中可能的AMR以及DSA-/C4d-微血管炎症（MVI）仍未通过BBT得到验证。

**方法**
我们使用组织学和分子显微镜诊断系统（MMDx?）分析了来自布拉格和苏黎世的562份肾移植活检样本。这些活检被分为以下几类：(i) 活性AMR谱系病变但无移植性肾小球病变（cg）；(ii) 活性-慢性病变伴有cg；(iii) 仅表现为cg的慢性AMR；(iv) 无排斥反应的对照组。

**结果**
在可能的AMR样本中，24%的样本检测到分子AMR，在伴有cg的可能AMR样本中这一比例为23%；在MVI、DSA-/C4d-样本中为43%，在活性AMR样本中为51%，在伴有cg的MVI、DSA-/C4d-样本中为56%，在慢性活性AMR样本中为63%。可能的AMR的AMRprob评分高于对照组，而慢性AMR与对照组之间的AMRprob评分相似。在活性AMR、慢性活性AMR和MVI、DSA-/C4d-组之间，AMRprob评分也具有可比性，这些组的TCMRprob评分均高于可能的AMR和对照组。

在苏黎世队列中训练的LASSO惩罚Cox回归模型用于预测3年移植物存活率，结果显示分子模型（cgprob, ctprob, tprob, AKIscore）和组织学模型（Banff cg, ci, ct, t）的性能相似（一致性分别为0.84和0.82），在布拉格队列中的外部验证结果也相同（0.78和0.75）。

**结论**
BBT主要反映了微血管损伤，而非DSA，在可能的AMR和MVI阳性活检中具有特别高的信息价值。

**引言**
微血管炎症（MVI）定义了大多数肾移植中的抗体介导的排斥反应（AMR），这是导致长期肾移植失败的主要原因1。更新的Banff分类引入了新的亚类别：具有亚阈值MVI评分的可能AMR以及同时没有供体特异性抗体（DSA）和C4d阳性的MVI2,3。最近，Sablik及其同事在一项大规模多中心研究中表明，具有MVI的活检涵盖了疾病进展和移植结果多样化的表型4。因此，在这些组织学类别中可能存在不同的病理生理机制，需要进一步探索。基于活检的转录组学（BBT）能够更精确地对AMR进行分子表型分析5,6，并允许详细研究移植组织中的生物学过程。近年来，越来越多的中心在常规移植后护理中实施了BBT，以改善排斥反应的诊断和治疗7, 8, 9。由于评估复杂性、观察者间的变异性和检测DSA方法的异质性，临床医生经常推荐使用BBT来识别AMR10。基于组织的批量转录组学（使用经过验证的微阵列平台）揭示了几种不同的AMR类别，这些类别在移植物预后方面存在差异5,11。分子检测到的完全发展和晚期抗体介导的排斥反应表现出较差的移植物存活率，而早期抗体介导的排斥反应的移植物则具有良好的预后。在最后一次Banff分类更新之前12,13，一些转录组学研究在仅满足两个AMR标准且缺乏DSA的情况下也发现了分子排斥反应。

在可能的AMR和新的MVI类别（DSA阴性且C4d阴性）中，BBT可能特别有帮助12, 13, 14, 15。同样，慢性内皮损伤（表现为肾小球基底膜的双重轮廓，这是一种不可逆的病变）可能在伴随排斥相关病变的情况下成为一个治疗难题16。因此，深入了解AMR的分子诊断，尤其是在已有慢性病变的晚期活检中17,18或来自高龄捐赠者的活检中，具有临床重要性。

在这项来自布拉格和苏黎世两个移植中心的研究中，我们使用组织学和基于活检的转录组学方法评估了肾移植活检，以：(1) 评估与每个Banff 2022 AMR亚型相关的分子特征，重点关注其活动性和慢性程度；(2) 确定其对移植物存活率的预后影响。

**材料与方法**
2018年至2025年间，共有755份肾移植活检样本在苏黎世（n=452）和布拉格（n=303）进行了组织学和分子显微镜诊断系统（MMDx）评估。最终分析的队列（n=562）中，大多数活检是作为指示性活检进行的（82%，表1）。在IKEM，移植后3个月常规进行协议活检（66/222，29.7%），治疗后还进行了10次监测活检（222/222）。在苏黎世中心，仅在AB0i类型移植中进行了协议活检（11/340），分别在移植后3个月和12个月进行，此外还进行了13次随访活检。所有活检均按照Banff 2022分类标准由当地病理学家进行评估，基于活检的转录组学分析由MMDx完成。在苏黎世，2018年至2021年间获得的一些活检在Kashi临床实验室（美国俄勒冈州波特兰）进行了MMDx评估，2021年以后获得的所有活检则在阿尔伯塔移植应用基因组学中心（加拿大埃德蒙顿）进行了评估。自2022年起，布拉格的所有活检都在IKEM实验室内部进行评估。所有实验室都使用相同的标准操作协议进行RNA分离和RNA处理以用于微阵列分析，并使用基于120811份活检的MMDx算法进行比较。与苏黎世相比，布拉格中心仅根据临床指征选择性地对部分活检进行了MMDx分析：亚阈值排斥类别、T细胞介导的排斥反应（TCMR）、抗体介导的排斥反应（AMR）以及组织学发现无法解释移植物功能障碍的情况。MMDx用于进一步细化组织学结果，并结合DSA和临床发现来决定治疗方案；然而，不单独依赖MMDx来确定患者的治疗方案。所有患者均提供了书面同意书，本研究已获得相关伦理委员会的批准（BASEC 2020-02817和A13-02-01），符合《赫尔辛基宣言》的要求。

**表1. 患者人口统计信息**此外，由于移植在第一周内因原发性移植物功能失败而排除的患者的活检样本也被排除在外（n=6）。为了研究组织学评分与分子评分在预测异体移植存活率方面的预后价值，我们建立了两个独立的Cox比例风险模型：一个仅基于Banff组织学评分，另一个基于分子评分。主要观察指标是移植失败的时间，随访在3年时终止。使用单变量Cox回归来计算风险比（HR）及其95%置信区间（CI），以衡量效应大小。在建立多变量模型时，由于事件数量有限（43例移植失败），我们采用了最小绝对收缩和选择算子（LASSO）惩罚的Cox回归，并使用R Studio 21中的glmnet包进行了10倍交叉验证，以减少模型复杂性并防止过拟合。我们纳入了12个来自Molecular Microscope? Diagnostic System（MMDx）的预定义分子评分，包括复合评分（例如AMR评分、Rejection评分）和特定病变的概率评分（例如g、ptc、cg）。为了标准化Banff评分与分子评分的解释，所有分子评分都进行了重新缩放，使风险比（HR）能够反映每增加0.25个单位的效果。选择最佳惩罚参数（λ）以保留每个模型的4个预测因子。在Banff组织学模型中，我们在另一个LASSO-Cox模型中评估了11个单独的Banff组织学病变评分。Zurich队列被用作训练数据集（n=271），IKEM队列（n=183）作为独立的外部验证队列。最终版本的营养和Banff模型使用选定的变量通过标准Cox回归进行了重新拟合。通过计算Harrell一致性指数（C指数）和1000次自助法复制的95%置信区间来评估外部IKEM队列中的模型性能。在验证队列中，使用Zurich训练的LASSO模型预测风险评分。双侧p值<0.05被认为是统计学上显著的。

最终队列包含562例肾脏移植活检样本，根据Banff 2022标准，这些样本被分类为AMR、可能的AMR、MVI、DSA阴性以及C4d阴性的，以及没有拒排证据的样本。活检样本还根据是否存在移植肾小球病变（cg）作为慢性病变的标志进行进一步分层。有cg的情况下，从移植到活检的中位时间显著增加，从活动性AMR、可能的AMR、MVI、DSA阴性和C4d阴性的3.3-13个月，增加到慢性活动性AMR、MVI、DSA阴性且伴有cg以及慢性AMR亚组的83-130个月。最高的活动性和慢性病变指数出现在慢性活动性AMR和MVI、DSA阴性且伴有cg的样本中，表明这些亚组存在持续的炎症。每个亚组和Banff组织学病变的详细特征在表1中呈现。

MMDx诊断结果显示，在可能的AMR中，23%（18/77）、MVI、DSA阴性和C4d阴性中49%（35/71）、AMR中59%（86/146）、慢性AMR中6%（2/31）以及无拒排的样本中14%（33/237）存在分子AMR（图2A、C）。下载：下载高分辨率图像（650KB）；下载全尺寸图像

图2. 根据Banff 2022 AMR谱系的组织学类别，分子拒排诊断的分布。组织学类别包括：活动性AMR、慢性活动性AMR、慢性AMR、可能的AMR，以及无DSA和C4d的微血管炎症（MVI）。这些类别进一步根据是否存在移植肾小球病变（cg）进行分层，其中慢性AMR定义为在没有活动性病变的情况下伴有cg（图B和D）。图A和B显示了每个组织学类别中MMDx?诊断的比例（无拒排[NR]、AMR、TCMR和混合拒排）。图C和D展示了详细的MMDx?典型诊断分布，包括早期AMR（EABMR）、完全发展的AMR（FABMR）、晚期AMR（LABMR）、混合拒排和TCMR分子表型。在图A和B中，为了清晰起见，轻微的TCMR和轻微的ABMR分子诊断分别与TCMR和ABMR归为一类。

在cg=0的情况下，MMDx在可能的AMR中识别出24%（12/51）、MVI、DSA阴性和C4d阴性中43%（15/35）以及活动性AMR中51%（24/47）存在纯分子AMR（EABMR、FABMR、LABMR或轻微ABMR）。在cg>0的情况下，MMDx在可能的AMR中检测出23%（6/26）、MVI、DSA阴性和C4d阴性中56%（20/36）以及慢性活动性AMR中63%（62/99）存在分子AMR。相比之下，慢性AMR中分子AMR很少见（6.5%，2/31），与无拒排组相当（图2B、D）。

**不一致发现的临床效用评估：**为了评估BBT的临床效用，对不一致的病例进行了分析。有60例根据组织学被分类为AMR或MVI、DSA阴性C4d阴性，但根据MMDx未被分类为拒排（表S1）。有趣的是，在7例中，MVI最可能是由潜在的非拒排病理引起的，其中2例移植失败。在4名患者中，AMR治疗后进行的监测活检显示MMDx结果为阴性，但其中1例移植在术后早期失败。3名患者显示强C4d阳性（C4d3）并伴有MVI0或MVI1；这些患者中没有人经历移植失败，且肾脏功能保持稳定。在26例中，MVI完全由肾小球炎症引起，而没有伴随的肾小管毛细血管炎，其中24名患者在随访期间肾脏功能稳定，包括9例未接受拒排治疗；2例移植失败。在整个队列中，与不一致的活检相比，孤立性肾小球炎症（g1–3, ptc0）在不一致的活检中显著更常见（52% vs 13%，p < 0.001）。这种关联在所有诊断类别中都是一致的，并且在MVI、DSA阴性、C4d阴性、活动性和慢性活动性AMR中达到了统计显著性，支持了g无ptc与组织学-分子不一致之间的强关联性（表S2）。在另外18例中，组织学和MMDx之间的差异仍然不清楚，其中4例移植失败。

**AMR亚类之间的MMDx分子评分差异：**组织学类别中的分子评分中值显示在图3、表S3和图S1A及S1B中，组间分子评分差异的p值显示在表S4中。在活动性和慢性活动性AMR以及MVI、DSA阴性且无论是否有cg的情况下，分子拒排评分（Rejectionprob）的中值超过了拒排阈值（>0.3）。同样，在活动性和慢性活动性AMR以及MVI、DSA阴性且伴有cg的情况下，分子AMR评分（AMRprob）的中值也高于AMR分子诊断阈值（>0.2），其中慢性活动性AMR组中的值最高。Rejectionprob和AMRprob与无拒排组、慢性AMR组和可能的AMR组相比均有显著升高（p < 0.001）。在活动性AMR、慢性活动性AMR和MVI、DSA阴性且C4d阴性组之间没有观察到分子AMR评分的统计学差异（图S1）。

**组织学AMR亚类中的死亡-审查移植存活率：**活检后的三年死亡-审查移植存活率在AMR组织学亚类间存在显著差异（p<0.0001，对数秩测试）（图S2，表S5）。与无拒排组相比，MVI、DSA阴性且伴有cg的组（HR 9.15，95% CI 3.41–24.57，p = 1.13×10-5）、慢性活动性AMR（HR 4.85，95% CI 1.94–12.16，p = 7.57×10-4）、慢性AMR（HR 3.74，95% CI 1.09–12.78，p = 0.035）和MVI、DSA阴性且C4d阴性的组中观察到移植存活率受损。其他亚类（可能的AMR、活动性AMR）的移植存活率与对照组没有显著差异。

我们还根据MMDx结果在每个Banff 2022 AMR亚类中进行了三年死亡-审查移植存活率的亚组分析（补充图S3）。尽管各亚组中的事件数量较少且随访时间较短，数据表明MMDx分类为“拒排”的病例的移植存活率倾向于较差。在MVI、DSA阴性且C4d阴性的57例中，有13例移植失败，其中9例通过MMDx确认了拒排。在其他2例中，MMDX发现拒排低于阈值。在72例可能的AMR中，只有3例移植失败。在单变量Cox回归分析中，基于组织学和分子评分评估了这些因素与三年移植存活率之间的关联（表2）。在Banff组织学评分中，慢性病变如cg（HR 2.16，p = 3.5×10-10）、ci（HR 2.28，p = 3.25×10-6）和ct（HR 2.23，p = 2.33×10-5）与移植失败风险增加最显著相关，其次是g和ptc评分。此外，与TCMR相关的病变也与移植失败风险增加显著相关（i，HR 1.66，p=0.023；t，HR=1.69，p=0.0033）。

**分子评分与组织学结果的差异：**不同组织学类别中的分子评分中值显示在图3、表S3和图S1A及S1B中，组间分子评分差异的p值显示在表S4中。在活动性和慢性活动性AMR以及MVI、DSA阴性且无论是否有cg的情况下，分子拒排评分（Rejectionprob）的中值超过了拒排阈值（>0.3）。同样，在活动性和慢性活动性AMR以及MVI、DSA阴性且伴有cg的情况下，分子AMR评分（AMRprob）的中值也高于AMR分子诊断阈值（>0.2）。Rejectionprob和AMRprob在所有组中都显著高于无拒排组、慢性AMR组和可能的AMR组（p < 0.001）。在活动性AMR、慢性活动性AMR和MVI、DSA阴性且C4d阴性组之间没有观察到分子AMR评分的统计学差异（图S1）。

**Banff组织学亚类中的死亡-审查移植存活率：**活检后的三年死亡-审查移植存活率在AMR组织学亚类间存在显著差异（p<0.0001，对数秩测试）（图S2，表S5）。与无拒排组相比，MVI、DSA阴性且伴有cg的组（HR 9.15，95% CI 3.41–24.57，p = 1.13×10-5）、慢性活动性AMR（HR 4.85，95% CI 1.94–12.16，p = 7.57×10-4）、慢性AMR（HR 3.74，95% CI 1.09–12.78，p = 0.035）和MVI、DSA阴性且C4d阴性的组中移植存活率受损。其他亚类（可能的AMR、活动性AMR）的移植存活率与对照组没有显著差异。

我们还根据每个Banff 2022 AMR亚类中的MMDx结果进行了三年死亡-审查移植存活率的亚组分析（补充图S3）。尽管亚组中的事件数量较少且随访时间相对较短，数据表明MMDx分类为“拒排”的病例的移植存活率趋势较差。在MVI、DSA阴性且C4d阴性的57例中，有13例移植失败，其中9例通过MMDx确认了拒排。在其他2例中，MMDX发现拒排低于阈值。在72例可能的AMR中，只有3例移植失败。这种转变使得可以解释原始分子评分增加0.25时的风险比，这大约相当于Banff评分增加1分。从分类变量（例如，cg≥2、ci≥2、ct≥2）得出的风险比表示高级病变与较低级别之间的阈值效应，因此不能直接与从序数变量（例如，cg 0-3）得出的风险比进行比较，后者反映了整个疾病严重程度范围内的逐单位增加。Beta表示回归系数；HR表示风险比；CI表示置信区间。

在原本从0到1缩放的与排斥相关的分子评分中，通过除以0.25重新缩放以便与Banff组织学评分（0–3）直接比较，最强的移植丢失预测因子是cg评分（HR 2.54，p = 2.23×10-13）、ctprob（HR=2.28，p=4.99×10-10）、TCMRprob（HR 2.04，p = 2.35×10-7）和tprob（HR 2.15，p = 8.88×10-8）。在分子损伤评分中，最强的预测因子是萎缩-纤维化（HR 2.25，p = 4.1×10-9）。

为了预测3年的移植结果，我们分别使用12个分子评分和11个Banff评分进行了LASSO惩罚的Cox回归，旨在保留最多四个预测因子。使用苏黎世训练队列（n=272），模型选出了4个分子预测因子（cgprob、ctprob、tprob和AKI评分）和4个Banff评分（cg、t、ci和ct）纳入最终模型。两个模型都显示出了显著的预测价值；分子模型的区分度与Banff模型相当，这一点通过Harrell的一致性指数（C指数：0.838 vs. 0.815）得到证实（表3）。在外部IKEM验证队列中，分子模型的C指数为0.779（95% CI 0.64-0.91），Banff模型的C指数为0.749（95% CI 0.62-0.88）。这些结果表明，两个模型在预测3年同种异体移植物丢失方面都表现良好。表S6和S7提供了MVI、DSA阴性以及C4d阴性的分子和组织学多变量Cox回归模型的详细结果。

表3. 使用A. 分子评分或B. Banff评分预测3年移植失败的最终多变量Cox回归模型，其中变量是通过10倍交叉验证的Lasso惩罚Cox回归选择的。模型是基于训练队列（n=272，19例移植失败）计算的。所有重复活检和因原发性移植功能障碍导致的移植失败都被排除在外。

A. 分子模型（AUC=0.838）
HR（95% CI）
cgprob 2.44 (1.6-3.7) 0.00004
ctprob 1.72 (1.05-2.82) 0.03030
AKI评分 1.06 (0.81-1.39) 0.65210
tprob 1.15 (0.56-2.33) 0.70130

B. Banff模型（AUC=0.815）
HR（95% CI）
cg 2.11 (1.15-3.86) 0.016
ci 2.42 (0.38-3.61) 0.353
ct 0.82 (0.11-6.28) 0.847

**讨论**
在这项双中心研究中，通过经过验证的BBT平台评估了325例具有AMR组织学特征的活检和237例对照样本。关键发现是，同时存在活动性微血管损伤和移植性肾小球病变的组织学类别表现出最高的分子排斥信号，并且无论DSA状态如何，都与最差的死亡校正移植存活率相关。这一结果并不令人惊讶，因为MMDx?是针对g和ptc病变进行训练的，而不是基于DSA阳性进行训练的。因此，即使在没有DSA或C4d染色的情况下，MVI ≥ 2在临床上仍然是相关的——尽管它目前被排除在正式的Banff AMR诊断之外，但支持将其纳入风险分层。与此一致的是，Gupta等人显示，无论C4d染色如何，MVI ≥ 2的活检的基于病理发生的分子评分同样升高，并且高于MVI评分为0或1的活检。另一项使用NanoString平台的研究也获得了类似的结果。在活动性和慢性活动性AMR中，分子AMR的阳性率为70%，这与Halloran小组在INTERCOMEX队列中的报告一致。组织学阴性但分子排斥阳性的活检结果提示可能处于AMR的早期阶段，尤其是在高度敏感的患者中。相比之下，由无活动性炎症的移植性肾小球病变定义的慢性AMR组显示出出乎意料的低分子排斥评分——无论DSA状态如何——以及与无排斥组相当的短期移植结果。由于MMDx算法中的cgprob评分主要是针对慢性活动性AMR队列进行训练的，因此在没有同时存在的组织学活动性评分时，单独使用cgprob无法区分AMR。在慢性AMR中，由于活动性纤维生成过程被瘢痕组织取代，纤维化相关基因的表达可能会下降。这表明仅凭慢性损伤可能不足以驱动持续的分子排斥活动，并强调了活动性病变预测不良移植预后的重要性，而这可以通过当前的创新疗法来逆转。

在活动性AMR和MVI、DSA阴性和C4d阴性的情况下，观察到最高比例的分子早期抗体介导的排斥（EABMR），而在慢性活动性AMR和MVI、DSA阴性和C4d阴性的情况下，则以完全发展的抗体介导的排斥（FABMR）为主。在慢性活动性AMR和MVI、DSA阴性和C4d阴性的情况下，无论是否有cg，移植存活率显著更差。这与Sablik等人的研究结果一致，他们显示MVI和AMR的移植失败风险相似。有趣的是，活动性AMR和可能的AMR并未与增加的移植丢失风险相关。然而，由于这些是在移植后早期诊断的，3年的随访可能不足以观察这一效应。这一观察结果与其他研究一致。

在我们的研究中，组织学和分子模型在预测3年移植结果方面的表现相似。在两个模型中，都选择了与萎缩-纤维化、移植性肾小球病和肾小管炎相关的组织学和分子评分。有趣的是，分子TCMR评分作为一个强烈的移植丢失预测因子显现出来。相当比例的AMR谱系活检表现出边缘性改变或TCMR（30/325，9%），并且在49%（158/325）的病例中存在孤立的肾小管炎，支持了AMR谱系中存在亚阈值TCMR特征的证据。先前的研究表明，混合分子排斥表型与更严重的炎症和更差的移植结果相关，即使组织学仅识别出一种排斥类型。在更晚期的慢性活动性AMR或MVI、DSA阴性和C4d阴性的情况下，分子TCMR活性可能更为突出。这一发现得到了最近的研究支持，这些研究在慢性活动性AMR和TCMR中发现了NK细胞和T细胞的表达，但在活动性AMR中则没有。使用NanoString平台进行的基因表达分析也证实了NK细胞和T细胞的参与。然而，Cristopheri等人在比较MVI、DSA阴性和C4d阴性（n=14）与慢性活动性AMR（n=22）时发现T细胞活性更高。这与我们在MVI、DSA阴性和C4d阴性组中发现的TCMR分子评分升高的结果一致。这些发现突出了分子诊断在揭示可能被组织学单独低估的复杂和重叠的排斥过程中的潜力。同样，Rosales等人使用B-HOT面板显示，在AMR病例中，TCMR相关的转录本在3年活检后对移植存活有负面影响，支持了许多在组织学上被分类为“纯”AMR或“纯”TCMR的活检实际上具有混合排斥的分子特征的概念。分子TCMR特征可能 warrant特定的TCMR治疗决策（例如，除了“常规”AMR治疗外，还使用脉冲类固醇/ATG或新的治疗如抗CD38或抗IL6）。

需要考虑几个限制。首先，虽然我们的DSA阳性阈值（MFI >500）很敏感，但它可能会包括假阳性病例，可能会错误地分类一些可能的AMR或活动性AMR患者。其次，我们没有测量非HLA抗体，尽管这些抗体似乎不影响结果。第三，组织学和分子方法都有一个关键的限制——采样误差。MVI病变通常受局部性的影响较小，而TCMR则不然；然而，样本的充分性，特别是肾小球的数量（根据Banff标准至少10个）很重要。重要的是，组织学和BBT评估的是组织和空间的不同部分：组织学通常检查比MMDx更大的、更多样化的组织区域。病理学家访问的组织部分与BBT分析的部分不同，这可能导致差异。因此，无论是组织学还是分子学上的阴性结果都应谨慎解读，尤其是在临床怀疑较高的情况下。此外，组织学评估受到观察者间变异性的影响；因此，有必要进行中心间组织学和分子诊断一致性的差异分析。最后，还需要研究3年以上的长期结果，特别是在仅限于活动性表型的情况下。

最后，BBT在可能的AMR、MVI、DSA阴性和C4d阴性类别以及组织学上不明确或不完整的活检中具有最高诊断价值。并非所有MVI、DSA阴性和C4d阴性的病例都反映排斥；其他原因可能包括TCMR、NK细胞介导的损伤、先天免疫激活或其他肾小球疾病。尽管如此，MMDx分类器主要反映了与微血管炎症相关的分子模式，并未设计用于区分MVI的不同潜在病因。在我们的队列中，分子AMR仅在部分可能的AMR和MVI阳性活检中被检测到，并且与显著不同的移植结果无关，尽管由于随访时间短和事件发生率低，解释受到限制。BBT检测到的分子变化可能在高度敏感的患者中早于组织学变化。在所有活检中常规应用BBT，尤其是在没有活动性病变的慢性AMR中，不太可能提供额外的临床益处。

总之，我们的研究强调了分子诊断在评估AMR亚型中的临床重要性。被分类为MVI、DSA阴性和C4d阴性的患者表现出强烈的分子排斥特征。此外，组织学未能检测到的TCMR分子信号作为移植失败的重要预测因子浮现出来。最后，分子上具有活动性AMR病变的患者是否可以从创新的NK细胞靶向疗法中受益，需要通过当前正在进行的研究来回答。

**披露**
所有作者均声明没有利益冲突。