《Laboratory Investigation》：Detection and recurrence risk stratification of gastric cancer through DNA methylation profiling of blood
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Jing Guo|Shun Zhang|Shuang Zhou|Hui Wang|Kehui Xie|Chengcheng Ma|Zhixi Su|Rui Liu|Haiyan Han|Yiqin Pan|Jin Tong|Zhiguo Xiong|Liang Cheng|Ren
Jing Guo|Shun Zhang|Shuang Zhou|Hui Wang|Kehui Xie|Chengcheng Ma|Zhixi Su|Rui Liu|Haiyan Han|Yiqin Pan|Jin Tong|Zhiguo Xiong|Liang Cheng|Renquan Lu|Xiaohua Jiang|Dazhi Xu
复旦大学上海癌症中心胃外科
摘要
目的
开发一种基于血液的DNA甲基化检测方法，用于非侵入性地检测各个阶段的胃癌（GC），包括早期和癌前病变，并评估术前GasAiQ阳性是否与可切除GC患者的术后复发风险相关。
材料与方法
我们使用降低表示二硫苏糖醇测序（RRBS）来分析DNA甲基化模式，并识别GC患者与对照组之间的肿瘤特异性差异甲基化区域（DMRs）。在独立的一组组织和血浆中验证了24个最具区分性的DMRs，然后将其纳入定量甲基化特异性PCR检测方法GasAiQ中。在1,372名个体中评估了GasAiQ的性能，这些个体包括GC患者以及患有胃炎、萎缩、肠化生或上皮内瘤变的患者，分为三个队列：训练队列（n=518）、验证队列（n=519）和独立测试队列（n=335）。此外，还在203名可切除肿瘤的GC患者中评估了其与复发风险的相关性，这些患者术后有随访数据。
结果
GasAiQ在所有队列中均显示出高诊断准确性。在训练队列中，曲线下面积（AUC）为0.904，敏感性为83.8%，特异性为82.6%，准确性为83.2%。在验证队列（AUC 0.878，敏感性83.9%，特异性81.9%，准确性81.5%）和独立测试队列（AUC 0.891，敏感性83.5%，特异性86.3%，准确性85.3%）中，其性能同样稳健。对于早期GC（I期），检测率在70.2%到75.0%之间，GasAiQ识别出57.6%的高级别上皮内瘤变。值得注意的是，在调整了关键临床病理因素的多变量Cox回归模型中，术前GasAiQ阳性仍与复发风险显著相关（风险比7.5；95% CI：1.0-55.2；p = 0.047），这支持了其潜在的预后价值。
结论
GasAiQ是一种非侵入性的甲基化检测方法，能够准确检测胃癌，包括早期和癌前阶段，并预测复发风险，为高级筛查、早期诊断和术后管理提供了重要潜力。
引言
胃癌（GC）是全球主要的健康挑战之一，是全球第五大常见癌症和癌症相关死亡的第五大原因1。在东亚和东欧，这一负担尤为严重。尽管治疗方法有所进步，但GC仍然具有高度侵袭性，在早期阶段通常无症状或仅表现出非特异性症状2。这导致诊断延误和预后不良3。因此，这些挑战凸显了对于有效诊断工具的迫切需求，以实现GC的早期检测4。
内镜检查和内镜活检仍是诊断GC的金标准5。然而，这些程序具有侵入性，依赖操作者，且成本较高，常会引起患者不适和焦虑。虽然非侵入性检测方面取得了一些进展，但可靠的诊断生物标志物仍然有限。血清肿瘤标志物，如癌胚抗原（CEA）和碳水化合物抗原19-9（CA19-9），已被研究用于诊断和预后评估<6, 7, 8>，但其低敏感性（分别为24.0%和27.0%）限制了其在筛查中的实用性<9>。尽管如此，在中国等高发病率国家，这些生物标志物仍作为诊断工作的辅助工具使用<10, 11, 12, 13>。
在过去的二十年里，人们投入了大量精力开发GC的非侵入性诊断技术，其中液体活检成为主要研究方向。这些技术包括循环微RNA（miRNA）、循环肿瘤DNA（ctDNA）突变、无细胞DNA（cfDNA）片段组学以及最近的ctDNA甲基化检测14。基于甲基化的检测方法尤其具有前景，因为DNA甲基化的动态变化伴随胃癌从癌前病变发展到晚期转移性疾病4。异常甲基化——尤其是肿瘤抑制基因的过度甲基化——与肿瘤大小、组织学分级、侵袭深度、淋巴结转移、TNM分期和预后密切相关4。许多甲基化生物标志物，如Septin 9、IRF4和Reprimo，在血浆或血清中可被检测到，但其敏感性和特异性各不相同（18%至95.5%和50%至100%）<15, 16, 17, 18, 19>。这些进展增进了对GC表观遗传学的理解，并提出了有希望的早期检测候选标志物。然而，尽管进行了广泛的研究，仍缺乏一种准确、稳健且经济可行的非侵入性方法，以便在临床上广泛应用。
本研究旨在通过全基因组甲基化分析确定最具信息量的GC DNA甲基化标志物，并开发一种定量甲基化特异性PCR（qMSP）检测方法，称为GasAiQ。我们评估了它区分GC与其他常见胃肠道疾病的准确性，以及其与复发风险的相关性，并探讨了其与血清标志物的整合潜力。GasAiQ作为一种非侵入性、经济高效的工具，在GC的诊断辅助、早期检测和预后评估方面具有巨大潜力。
小节片段
研究设计和患者招募
本研究是一项多中心临床研究，遵循《赫尔辛基宣言》进行，并获得了复旦大学上海癌症中心、上海东医院和湖北癌症医院的医学伦理委员会批准。参与者招募时间为2022年2月至2024年2月，共招募了1,372名参与者。所有参与者在研究开始前均签署了书面知情同意书。
GC的诊断依据国家综合癌症网络标准进行
GC相关DNA甲基化标志物的发现与优化
为了识别与GC相关的DNA甲基化标志物，我们对199个样本进行了全基因组甲基化分析，包括32个GC肿瘤组织样本、33个肿瘤周围组织样本、20个白细胞（WBC）样本和114个健康个体的血浆样本（图1）。通过基于调整后的p值、甲基化分位数和CpG位点富集的统计过滤来减少背景噪音，从而得到了一组
讨论
在这项研究中，我们进行了一项多中心研究，涉及1,372名GC患者、胃炎患者和萎缩/IM患者，旨在开发一种新的诊断模型GasAiQ。我们的研究结果表明，它在GC诊断中表现出优异的性能，有助于提高GC的检测率。此外，将GasAiQ与传统肿瘤标志物结合使用提高了诊断准确性，而更高的GasAiQ风险评分也与GC风险增加相关
作者贡献
JG、SZ和SZ是共同的第一作者。DZX、XHJ和RL设计了研究。JG和SZ负责数据收集。JG和SZ参与了数据清洗、随访和验证。JG和SZ分析了数据。JG和SZ起草了手稿。DZX、XHJ、RQL、LC和ZGX参与了结果解释和手稿的关键修订，并批准了最终版本。所有作者都阅读并批准了最终版本
资金支持
本研究得到了国家自然科学基金（资助编号：82303790）和上海帆船计划（资助编号：23YF1407000）的支持。
利益冲突声明
Rui Liu持有Singlera Genomics的股份，并是其员工。Shuang Zhou、Hui Wang、Kehui Xie、Cheng-Cheng Ma和Zhixi Su也是Singlera Genomics的员工。所有其他作者均声明没有利益冲突。
伦理批准和参与同意
本研究遵循《赫尔辛基宣言》进行，并获得了复旦大学上海癌症中心、上海东医院和湖北癌症医院的医学伦理委员会批准。所有参与者在研究开始前均签署了书面知情同意书。
