ASB7通过泛素介导的ATF2降解促进骨肉瘤肺转移

《Cell Discovery》：ASB7 promotes osteosarcoma lung metastasis through ubiquitin-mediated degradation of ATF2

　　

骨肉瘤是一种具有高度异质性和侵袭性的恶性肿瘤，极易发生转移，这凸显了明确其分子驱动因素的必要性。在此，研究人员报道ASB7促进肿瘤细胞突起形成、侵袭、迁移和肺转移。ASB7的高表达与不良预后相关。ASB7与CUL5形成E3泛素连接酶复合物，在K383位点泛素化ATF2并促进其蛋白酶体降解。ATF2的减少损害了HDAC6向ITGB2启动子的募集，从而减轻了转录抑制。随后ITGB2表达上调促进肿瘤肺转移。该研究揭示了ASB7-ATF2/HDAC6-ITGB2轴调控骨肉瘤转移的机制，并提出了潜在的治疗靶点。

骨肉瘤作为一种原发性恶性骨肿瘤，主要影响儿童、青少年及老年群体，具有高度的体细胞拷贝数变异和结构性重排特征，肺转移是其最主要的临床挑战。尽管高通量基因组测序技术的发展增进了学界对其发病机制的理解，但针对转移性骨肉瘤的有效治疗手段仍然有限。在此背景下，ASB7作为Cullin5-RING E3泛素连接酶复合物的关键底物识别组件，已被证实参与维持基因组完整性及调控H3K9me3稳态，且在多种癌症中存在基因组扩增现象，尤其在肉瘤中最为频繁。然而，ASB7在骨肉瘤转移中的具体功能与分子机制尚不明确。为此，研究人员开展了系列实验，旨在阐明ASB7在骨肉瘤进展中的作用及其潜在的靶向治疗价值。该研究成果已发表于《Cell Discovery》。

在研究技术方法层面，研究人员主要采用了DepMap数据库分析结合体内外功能实验。通过构建多西环素（Dox）诱导的ASB7过表达及基因敲除细胞系，结合活体成像、免疫组化（IHC）及苏木精-伊红（H&E）染色评估小鼠胫骨原位移植瘤模型的肺转移情况。分子机制研究则综合运用了蛋白质印迹（Western blotting）、免疫荧光（IF）、染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）、CUT&Tag数据分析以及体外泛素化检测等技术手段，并使用了TCGA及ENCODE数据库进行生物信息学关联分析。

ASB7促进骨肉瘤细胞侵袭、迁移和肺转移

研究人员通过分析DepMap数据发现骨肉瘤细胞系中ASB7的基因组扩增和mRNA表达水平均显著升高，且RNA-seq显示骨肉瘤组织中ASB7表达上调，高表达与患者不良预后相关。功能实验表明，诱导型ASB7过表达促进了143B细胞的肌动蛋白基突起（包括板状伪足和丝状伪足）形成、迁移和侵袭，并在小鼠模型中增加了肺转移结节数量。相反，ASB7基因敲除则抑制了细胞突起形成、迁移、侵袭及体内肺转移。这些数据确立了ASB7是骨肉瘤转移的重要调节因子。

ATF2抑制骨肉瘤细胞侵袭、迁移和肺转移

基于质谱分析及CPTAC数据库数据，研究人员发现ASB7与转录因子ATF2蛋白水平呈负相关，且骨肉瘤样本中ASB7与ATF2的免疫组化染色结果亦呈反向关系。低ATF2表达预示着不良预后。功能获得与缺失实验显示，ATF2过表达减少了细胞突起形成，抑制了细胞迁移和侵袭，并降低了小鼠体内的肺转移率；反之，ATF2敲除则促进了这些恶性表型。这表明ATF2在蛋白水平上受ASB7负调控，并发挥抑制骨肉瘤转移的作用。

CUL5^ASB7泛素化K383位的ATF2以促进其蛋白酶体降解

进一步机制研究表明，ASB7仅降低ATF2蛋白水平而不影响其mRNA水平。利用蛋白酶体抑制剂MG132及NEDD8激活酶抑制剂MLN4924处理可恢复ATF2蛋白水平，而自噬溶酶体抑制剂无效，证实了ATF2通过CUL5依赖的泛素-蛋白酶体途径降解。放线菌酮（CHX）追踪实验显示ASB7缩短ATF2半衰期。免疫共沉淀（Co-IP）证实ASB7直接与ATF2相互作用，并通过其N端ANK结构域与ATF2的N端锌指（ZnF）结构域结合。最终，通过质谱和点突变实验确定ASB7介导ATF2在K383位点的泛素化。

ASB7通过抑制ATF2促进肿瘤肺转移

通过对比ASB7过表达与ATF2敲低细胞中上调基因的富集通路，研究人员发现两者均涉及细胞外基质组织过程。在ASB7诱导过表达的细胞中重新引入ATF2，能够逆转由ASB7引起的细胞突起增多、迁移侵袭增强以及体内肺转移表型。这直接证明了ASB7是通过介导ATF2降解来促进骨肉瘤肺转移的。

ATF2抑制ITGB2转录并抑制肿瘤肺转移

整合分析RNA-seq与ATF2的ChIP-seq数据，研究人员锁定整合素β2（ITGB2）为关键下游效应因子。TCGA数据显示ATF2与ITGB2表达在多种肿瘤中呈负相关，且在肉瘤中相关性最强。ChIP-qPCR证实ATF2直接结合ITGB2启动子。ASB7过表达或ATF2敲除导致ITGB2 mRNA和蛋白水平升高，反之则降低。功能实验表明，ITGB2过表达促进细胞突起形成、迁移、侵袭及体内肺转移，而ITGB2敲除则产生相反效果。这揭示ASB7-ATF2轴通过转录调控ITGB2影响肿瘤转移。

ATF2募集HDAC6抑制ITGB2转录

为探究ATF2抑制转录的机制，研究人员发现ATF2与HDAC3、HDAC6及HDAC10存在相互作用，但仅有HDAC6和HDAC10的敲低会升高ITGB2 mRNA。进一步研究发现，只有HDAC6对ITGB2的转录抑制作用依赖于ATF2的存在。内源性Co-IP证实了HDAC6与ATF2的相互作用。ATF2过表达增加了HDAC6在ITGB2启动子上的占位，而ATF2敲除则减少了该占位。此外，ATF2 ChIP-seq与HDAC6 CUT&Tag数据显示两者在全基因组范围内广泛共定位于基因启动子区。由此确立ATF2通过募集HDAC6至ITGB2启动子抑制其转录。

综上所述，本研究详细阐述了ASB7-ATF2/HDAC6-ITGB2信号轴在骨肉瘤肺转移中的调控机制。讨论部分指出，ASB7在多种肿瘤尤其是肉瘤中频繁扩增，其促转移作用及先前报道的通过降解SUV39H1损害同源重组修复的功能，提示携带ASB7高表达的患者可能对PARP抑制剂敏感，这为正在进行的相关临床试验提供了潜在的精准分型依据。同时，研究首次揭示了ATF2可通过募集HDAC6而非传统的HDAC3来抑制转录，拓展了对于ATF2非经典转录抑制机制的认识。该研究不仅解析了骨肉瘤转移的关键分子路径，也为开发针对这一致命疾病的新型治疗策略提供了理论靶点和科学依据。