初级纤毛（Primary cilia）破坏重塑细胞外囊泡（Extracellular vesicles, EVs）信号在内皮功能障碍（endothelial dysfunction）和心血管疾病（cardiovascular disease）中的作用

《Life Sciences》：Primary cilia disruption reprograms extracellular vesicle signaling in endothelial dysfunction and cardiovascular disease

　　

摘要 目的： 初级纤毛破坏深刻影响血管完整性。在纤毛切除（decapitation）过程中释放的细胞外囊泡已成为这些效应的潜在介质，但其功能贡献仍不清楚。本研究旨在探究由切除纤毛的内皮细胞释放的细胞外囊泡对内皮反应的影响，并评估其临床相关性。 材料与方法： 通过差速离心法收集人脐静脉内皮细胞释放的细胞外囊泡，以及从阻塞性睡眠呼吸暂停综合征（obstructive sleep apnea syndrome, OSAS）患者中分离的循环细胞外囊泡。随后通过蛋白质印迹分析评估纤毛标志物的存在。 主要发现： 在人脐静脉内皮细胞中，药物性切除初级纤毛诱导了富含纤毛标志物的细胞外囊泡的释放。来自切除纤毛细胞的细胞外囊泡不改变一氧化氮的生物利用度，但引发了细胞质活性氧的显著且持续的增加，该过程不依赖于黄嘌呤氧化酶和NADPH氧化酶的活性。相比之下，来自完整纤毛的细胞外囊泡发挥了保护作用，在TNF-α诱导的高通透性期间增强内皮细胞迁移并维持屏障完整性。纤毛的缺失消除了这些保护作用，揭示了由细胞外囊泡来源决定的功能二分法。来自伴有内皮功能障碍的阻塞性睡眠呼吸暂停综合征患者的循环细胞外囊泡显示出乙酰化α-微管蛋白（acetylated α-tubulin）表达增加的趋势，表明纤毛细胞外囊泡特征可能代表了阻塞性睡眠呼吸暂停综合征中血管损伤的新兴生物标志物。 意义： 这些发现揭示了来自切除纤毛的内皮细胞的细胞外囊泡是先前未被认识的内皮行为调节因子，能够根据纤毛状态将血管反应导向保护或氧化损伤。本研究揭示了纤毛动力学、细胞外囊泡信号传导和内皮功能障碍之间的机制联系。

研究背景与目的

原发性纤毛是单生、基于微管的细胞器，从许多细胞类型的表面延伸出来，作为关键的机械传感和信号传导中心。在内皮细胞中，这些细胞器伸入血管腔，通过调节细胞内钙动力学来检测剪切力并调节一氧化氮产生。纤毛结构受损或数量减少与一氧化氮信号传导缺陷有关，促进促炎和血管收缩表型。此外，纤毛脱落过程中释放的细胞外囊泡已成为影响纤毛周转的关键途径，但其在哺乳动物系统中的功能相关性仍未得到充分理解。尽管内皮细胞外囊泡在细胞通讯和血管病理学中扮演着公认的角色，但特异性在纤毛解体过程中释放的细胞外囊泡是否有助于内皮功能障碍、氧化应激或血管炎症，尚未阐明。本研究旨在探究由切除纤毛的内皮细胞释放的细胞外囊泡对内皮反应的功能影响，并评估其在人类心血管疾病中的潜在临床相关性。

研究方法概览

研究人员利用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）进行体外研究。通过血清饥饿（0.2% FBS）促进细胞形成初级纤毛，并使用氯醛水合物（chloral hydrate, CH, 4 mM）处理3天来诱导纤毛解体，从而获得分别来自纤毛完整细胞和纤毛切除细胞的细胞外囊泡。通过差速离心法分离细胞外囊泡，并利用Zetasizer粒度分析、透射电镜、蛋白质印迹和流式细胞术对其进行表征。通过细胞荧光成像和测量技术，评估了细胞外囊泡对内皮细胞一氧化氮生成、细胞质/线粒体活性氧（ROS）水平、细胞增殖、迁移以及屏障通透性的影响。同时，研究了特定ROS抑制剂（阿朴脂素、阿洛嘌呤）的作用。此外，研究还使用了载脂蛋白E敲除小鼠的肠系膜动脉进行血管ROS实验。在临床相关性方面，研究招募了16名中度至重度阻塞性睡眠呼吸暂停综合征患者，根据外周动脉张力法评估的内皮功能进行分层，并从其血液样本中分离循环细胞外囊泡，分析其纤毛标志物（乙酰化α-微管蛋白）的表达。统计学分析使用GraphPad Prism软件进行。

研究结果

3.1. 内皮细胞初级纤毛的体外表征

在血清饥饿条件下，超过90%的人脐静脉内皮细胞对纤毛标志物乙酰化α-微管蛋白和ARL13B呈双阳性。氯醛水合物处理有效消融了初级纤毛，与未处理的对照组相比，有纤毛的细胞数量减少了约90%，并且这种纤毛的丧失与细胞内钙离子浓度的短暂增加相关，这表明纤毛破坏与钙信号传导之间存在功能联系。

3.2. 内皮细胞细胞外囊泡的表征

来自纤毛切除细胞的细胞外囊泡在大小分布和形态上与来自纤毛完整细胞的细胞外囊泡无显著差异。然而，蛋白质印迹和流式细胞术显示，来自纤毛切除细胞的细胞外囊泡显著富集了纤毛标志物乙酰化α-微管蛋白和ARL13B，而来自纤毛完整细胞的细胞外囊泡中这些蛋白的表达较弱。这表明药物性纤毛破坏促进了富含纤毛成分的大型细胞外囊泡的释放。

3.3. 细胞外囊泡对内皮一氧化氮产生的影响

无论来自纤毛完整细胞还是纤毛切除细胞，细胞外囊泡在ATP刺激后均未改变人脐静脉内皮细胞的一氧化氮生成。这表明纤毛解体后释放的细胞外囊泡不会改变内皮一氧化氮的生物利用度。

3.4. 细胞外囊泡对内皮活性氧产生的影响

来自纤毛切除细胞的细胞外囊泡在处理后4小时和24小时均显著增加了细胞质活性氧水平，而来自纤毛完整细胞的细胞外囊泡则无此效应。通过阿洛嘌呤和阿朴脂素分别抑制黄嘌呤氧化酶和NADPH氧化酶，均未能减弱由来自纤毛切除细胞的细胞外囊泡诱导的活性氧增加。线粒体活性氧水平在所有条件下均未改变。这些数据表明，来自纤毛切除细胞的细胞外囊泡通过不依赖于黄嘌呤氧化酶和NADPH氧化酶的机制选择性地增强细胞质活性氧。

3.5. 细胞外囊泡对肠系膜动脉活性氧产生的影响

来自纤毛完整细胞的细胞外囊泡显著降低了小鼠肠系膜动脉中的活性氧水平，而来自纤毛切除细胞的细胞外囊泡则无此效应。抑制黄嘌呤氧化酶或NADPH氧化酶并未改变在纤毛切除细胞的细胞外囊泡存在下的活性氧反应。这些结果表明，来自完整纤毛的细胞外囊泡在血管组织中发挥抗氧化作用，而这种特性在来自纤毛切除细胞的细胞外囊泡中丧失。

3.6. 细胞外囊泡对内皮迁移和通透性的影响

来自纤毛完整细胞的细胞外囊泡显著增强了内皮细胞的迁移能力，而来自纤毛切除细胞的细胞外囊泡则无此作用。在TNF-α诱导高通透性的情况下，来自纤毛完整细胞的细胞外囊泡阻止了跨内皮电阻的下降，从而保护了屏障完整性，而来自纤毛切除细胞的细胞外囊泡未能提供类似的保护。这些发现表明，源自纤毛细胞的细胞外囊泡促进内皮修复并维持屏障稳定性，而源自纤毛切除细胞的细胞外囊泡则不能。

3.7. 携带纤毛标志物的细胞外囊泡的病理生理相关性

对伴有或不伴有内皮功能障碍的阻塞性睡眠呼吸暂停综合征患者的循环大型细胞外囊泡进行分析显示，尽管差异无统计学意义，但来自伴有内皮功能障碍的患者的细胞外囊泡中乙酰化α-微管蛋白的表达有增加的趋势。这表明携带纤毛标志物的细胞外囊泡可能反映了内皮状态，并具有作为阻塞性睡眠呼吸暂停综合征中血管功能障碍生物标志物的潜力。

讨论与结论总结

讨论要点

本研究确定了初级纤毛是内皮稳态的关键调节因子，并证明了纤毛解体过程中释放的细胞外囊泡是血管功能的重要调节器。来自纤毛完整细胞的细胞外囊泡具有保护作用，可促进内皮迁移、减少细胞质活性氧并保护屏障完整性。相反，来自纤毛切除细胞的细胞外囊泡不仅失去保护作用，反而触发了持续的细胞质活性氧产生，其机制不依赖于经典的黄嘌呤氧化酶和NADPH氧化酶通路，可能涉及其他胞质途径或细胞外囊泡自身携带的促氧化分子。在临床转化方面，阻塞性睡眠呼吸暂停综合征患者循环细胞外囊泡中纤毛标志物（乙酰化α-微管蛋白）表达增加的趋势，提示其作为血管内皮损伤潜在生物标志物的价值。值得注意的是，本研究在静态培养条件下进行，未来需要在模拟生理剪切应力的条件下进一步验证。

结论（翻译）

综上所述，我们的研究结果表明，来自纤毛切除细胞的细胞外囊泡是内皮生物学的关键调节因子，在血管保护和损伤中发挥双重作用。通过整合体外机制研究与患者样本的观察，本研究强调了来自纤毛切除内皮细胞的细胞外囊泡对氧化应激和内皮功能障碍的贡献，并强调了它们作为心血管病理学中生物标志物和治疗靶点的前景。