《LWT》：Exploration of the microbial assembly process of Sauce-flavored Baijiu and the core microorganisms responsible for ester production
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存在于酱香型白酒（Sauce-flavored Baijiu, SFB）中的酯类化合物能够减轻白酒固有的浓郁度，同时提升其香气轮廓的清晰度。它们的发酵过程直接决定了白酒的质量，也是关键的呈味成分。然而，驱动微生物演替及相关代谢产物形成的关键环境因素仍不清楚。本
存在于酱香型白酒（Sauce-flavored Baijiu, SFB）中的酯类化合物能够减轻白酒固有的浓郁度，同时提升其香气轮廓的清晰度。它们的发酵过程直接决定了白酒的质量，也是关键的呈味成分。然而，驱动微生物演替及相关代谢产物形成的关键环境因素仍不清楚。本研究发现了核心产酯微生物，包括三类细菌（Kroppenstedtia, Bacillus, 乳酸菌）和三类真菌（Fusarium, Saccharomyces cerevisiae, Basidiomyces deformis）。有趣的是，在群落构建方面，细菌由确定性过程（如均质选择，βNTI ≥ 2）驱动，而真菌主要由随机过程（βNTI < 2）驱动，表明细菌对环境因子更为敏感。冗余分析（Redundancy analysis, RDA）显示pH值、还原糖和酒精含量是群落结构的主要驱动因子。此外，研究人员筛选出一株Limosilactobacillus fermentum，其产酯组成（如棕榈酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁二酸二乙酯）与窖池发酵后期的酯分布相似。这些发现为确保SFB生产质量稳定提供了理论基础和技术方向。
论文解读：酱香型白酒窖内发酵微生物组装与产酯机制研究
研究背景与意义
中国白酒作为世界上最古老的蒸馏酒之一，因其独特的发酵方式和多样的口感特征而享誉全球，其中酱香型白酒（Sauce-flavored Baijiu, SFB）凭借其特有的“酱香”、醇厚口感及悠长回味备受推崇。SFB采用传统的固态发酵法，包含堆积发酵和窖池发酵两个阶段，其中窖池发酵是一个密闭的厌氧过程，一旦酒醅（Zaopei，由蒸粮、大曲、水和发酵材料混合而成）入窖便无法调整，因此入窖前的干预及窖内微生态环境的控制至关重要。SFB的生产遵循“1、2、9、8、7”的工艺特点，即一年一个生产周期、两次投料、九次蒸煮、八次发酵和七次取酒。然而，不同轮次发酵后白酒中酯类化合物的含量存在波动，导致SFB风味特征的阶段性差异，这不仅影响作为勾调基酒的产品质量，也直接关系到企业的经济效益。酯类物质占白酒风味物质总量的60%以上，且多数酯类具有较低的嗅觉阈值，是决定白酒风味的关键。尽管已知微生物群落及其代谢活动对SFB风味形成至关重要，但目前关于SFB窖池发酵过程中连接群落组装机制与产酯功能微生物的研究仍然匮乏，相关的生态学理论尚未得到充分应用。为此，研究人员开展了本项研究，旨在阐明窖内发酵过程中酯类物质的动态变化、微生物群落的演替规律及核心产酯微生物的组成与影响因素，从而为SFB的稳定生产与品质控制提供科学依据。
研究方法概述
研究人员从四川泸州某SFB生产企业的三个窖池中采集发酵酒醅样本，分别在入窖当天（J0）、第2天（J2）、第20天（J20）和第30天（J30）于窖池的上、中、下三层取样，共获得36份样本用于理化指标测定、微生物基因组DNA提取及代谢组学分析。通过顶空固相微萃取（HS-SPME）结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术分析挥发性酯类物质的动态变化。利用Illumina NovaSeq PE 250平台对细菌的16S rRNA基因V3-V4区和真菌的ITS1区进行高通量测序，分析微生物群落多样性、结构及演替。基于零模型计算β最近分类单元指数（βNTI）以解析群落组装机制，并结合冗余分析（RDA）探讨环境因子对群落结构的影响。此外，通过修改MRS培养基初筛乳酸菌，并进行固态模拟发酵实验验证功能菌株的产酯特性。
研究结果
1. 挥发性酯类的动态变化与主成分分析
研究人员追踪分析了发酵过程中检测到的21种主要酯类，发现其含量在窖池发酵期间表现出显著的时空差异。根据变化趋势，将酯类分为累积型（如乳酸乙酯）、峰值型（早期峰值如辛酸乙酯，中晚期峰值如棕榈酸乙酯）和下降型（如癸酸乙酯）。主成分分析（PCA）显示，PC1和PC2累计解释了77.72%的挥发酯信息，样本根据时间点明显分为两类：入窖0天和2天的样本集中在PC1负半轴，20天和30天的样本主要分布在PC1正半轴。据此，将发酵过程划分为前期（EF，0-2天）和后期（LF，20-30天）。
2. 微生物群落多样性与结构分析
2.1 发酵过程中的微生物变化
稀释曲线分析表明测序深度足够。Alpha多样性分析显示，细菌和真菌的群落丰富度与多样性随发酵进程发生显著变化（p < 0.05），进一步支持了EF和LF阶段的划分。细菌Alpha多样性呈下降趋势，而真菌则呈上升趋势，表明群落可能从细菌主导演变为真菌主导。PCoA和NMDS分析均显示微生物群落结构随时间呈现明显的阶段性聚类。
在门水平上，细菌群落从早期以厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）为主演替为后期厚壁菌门（占比78%）占绝对主导。属水平上，乳杆菌属（Lactobacillus）从2.71%急剧增加至77.77%，成为优势菌属。真菌方面，子囊菌门（Ascomycota）虽一直占优但丰度下降。
群落组装机制分析显示，细菌群落主要由确定性过程（如均质选择）驱动，而真菌群落主要由随机过程驱动。中性群落模型（NCM）分析表明真菌群落的迁移率（m）低于细菌，且在LF阶段细菌的扩散能力增强而真菌受限。LEfSe分析鉴定出LF阶段的特征菌包括乳杆菌属（Lactobacillus）、Wallrothiella和镰刀菌属（Fusarium），而EF阶段则以马赛菌属（Massilia）、栖热菌属（Thermus）、Kroppenstedtia、芽孢杆菌属（Bacillus）等为特征。
2.2 产酯窖池核心微生物识别
利用随机森林预测模型结合ROC分析，研究人员识别出窖池发酵产酯的核心细菌为Kroppenstedtia、Bacillus和乳杆菌属（Lactobacillus），核心真菌为镰刀菌属（Fusarium）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和Basidiomyces deformis。Spearman相关性分析揭示了这些核心微生物与特定酯类的关联，例如乳酸菌与乙酸乙酯、苯乙酸乙酯和丁二酸二乙酯呈显著正相关，而Bacillus与这些酯类呈负相关。
2.3 环境因素对产酯微生物的驱动作用
发酵过程中，酒醅的水分、pH值、还原糖、淀粉、酒精含量、温度、总酸和氨基酸态氮均发生显著变化。RDA分析显示，所测环境因子解释了67.25%的微生物群落结构变异，其中pH值、还原糖和酒精含量对群落结构影响极显著（p<0.01）。酒精含量、总酸和氨基酸态氮与LF阶段样本及乳杆菌属呈强正相关，而pH值、还原糖和淀粉含量则与EF阶段样本及Bacillus等早期微生物相关。
2.4 产酯乳酸菌在固态模拟发酵中的应用
基于宏组学分析，乳酸菌与酯类（尤其是酱香特征酯）相关性最强，研究人员从中筛选出了一株具有高耐受性（pH 4-9，乙醇浓度<15%）的Limosilactobacillus fermentum。固态模拟发酵结果显示，该菌株能产生窖池后期的多种核心酯类，如棕榈酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁二酸二乙酯，同时产生乙酸、乙醇及多种醇类和微量健康因子前体物质。
结论与讨论
本研究系统阐明了SFB窖池发酵过程中酯类物质的动态变化规律及微生物群落的演替特征。研究发现，酯类物质可分为累积型、峰值型和下降型三类；微生物群落中，细菌由确定性过程驱动，真菌由随机过程驱动。核心产酯微生物被鉴定为Kroppenstedtia、Bacillus、乳酸菌以及Fusarium、Saccharomyces cerevisiae和Basidiomyces deformis。环境因素中，pH、还原糖和酒精含量是驱动群落结构变化的关键因子。研究证实乳酸菌是窖池发酵后期产酯的主要功能微生物，并成功筛选出一株Limosilactobacillus fermentum，其固态发酵产物与窖池后期酯类分布一致。该研究构建了从基础生态规律到工业应用的完整论证，为SFB生产中的群落结构靶向调控及风味品质提升提供了理论依据和菌株资源，对推动传统酿造行业向科学化、精准化升级具有重要意义。
