邻苯二甲酸酯对沿海浮游植物（裸藻属）影响的生态毒理蛋白质组学评估：从生理抑制到分子适应

《Marine Pollution Bulletin》：Ecotoxicoproteomic assessment of the effects of phthalate esters on coastal phytoplankton (Gymnodinium sp.): From physiological inhibition to molecular acclimation

　　

Kun Lin|Yanru Wang|Hongyan Xu|Liju Tan|Jianlei Chen|Ting Zhao|Jiangtao Wang

中国海洋大学教育部海洋化学理论与技术国家重点实验室，青岛，266100，中国

摘要

作为海洋生态系统中的初级生产者，浮游植物更容易受到新兴污染物的有害影响。本研究评估了邻苯二甲酸酯（PAEs），主要是二丁基邻苯二甲酸酯（DBP）和二（2-乙基己基）邻苯二甲酸酯（DEHP）的生态毒性影响，这些物质在沿海环境中经常以较高浓度被检测到。它们对中国沿海水域中主要的Gymnodinium物种产生了影响。通过蛋白质组学技术，研究了代表性PAEs对微藻的毒性作用以及浮游植物对毒性损伤的分子生物学反应。DBP对Gymnodinium的生长具有明显的抑制作用。OJIP曲线表明微藻的光合电子传递链受到严重破坏，同时光合参数（F_v/F_m和F_t）也显著下降。DBP还导致Gymnodinium出现明显的氧化应激，表现为总蛋白质（TP）含量减少，以及过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平升高。微藻的能量代谢系统也受到影响，最初ATP酶活性下降，随后有所恢复。然而，在实验条件下，高分子量的DEHP对Gymnodinium的危害似乎较小。实验最终阶段，DBP处理组和对照组之间共鉴定出20种差异表达的蛋白质。其中，CP43、PP2A、AMPK和几种核糖体蛋白显著上调，而剪接体相关蛋白下调。结合OJIP荧光结果，这些蛋白质水平的变化表明DBP诱导的光合电子传递损伤可能与氧化还原调控、能量稳态调节和翻译维持有关。

引言

大多数新兴污染物都具有生物毒性，包括致癌性、致畸性和致突变性，主要影响生物体的生长和发育。这些效应表现在内分泌紊乱、免疫毒性、生殖功能障碍和光合作用抑制等方面，并导致遗传和后代影响（Ben Othman等人，2023；Ma等人，2023；Zhang等人，2021）。这些污染物最终会抑制生物体的生长（Chen等人，2017）。浮游植物位于食物链的底部，是海洋生态系统中的初级生产者。它们通过光合作用产生有机物，为各种海洋生物提供食物来源，对全球初级生产力和有机碳的生物地球化学循环做出重要贡献（Falciatore等人，2019）。因此，浮游植物更容易受到新兴污染物的影响，从而加剧了对生态系统的威胁。先前的研究表明，暴露于有机污染物的藻类会产生并积累过多的活性氧（ROS），导致细胞结构严重受损（Rezayian等人，2019）。各种有机污染物会干扰细胞色素的合成，降低浮游植物的光合效率，并引发细胞基因的变化（Guo等人，2020a，Guo等人，2020b）。许多研究证明氧化应激、光损伤和程序性细胞死亡之间存在密切关系（Mao等人，2021；Zhao等人，2020）。Bidle（2016）还指出，在浮游植物的程序性细胞死亡初期，ROS和NO可能作为关键信号分子发挥作用。此外，藻类可以根据多种压力因素调整其光合作用系统、抗氧化系统和其他耐受机制（Guo等人，2020a，Guo等人，2020b）。

当生物体遇到外部刺激时，高通量分子生物学标志物（包括基因、蛋白质和代谢物）的变化可以提供全面的反应数据，有助于从分子生物学的角度阐明其内在毒性机制。基因组学和代谢组学是目前研究浮游植物如何应对环境压力的主要工具（Yang等人，2023；Zhao等人，2023）。蛋白质组学技术能够全面揭示生物体对外部刺激的蛋白质变化，可能揭示相关基因的表达情况，并直接指示生物体内的变化（Tan等人，2012）。近年来，蛋白质组学在研究植物对环境因素和外来污染物的应激反应中的应用日益增多。海藻可以通过下调其光合作用系统和能量代谢来缓解干旱压力（Xu等人，2016）。此外，还可以用于鉴定与光合作用和蛋白质合成相关的抗氧化酶，以及检测辐射引起的突变（Lee和Choi，2017）。Gao等人（2016）指出，杀虫剂氯氰菊酯（CYP）诱导了绿藻细胞中与光合作用、应激反应和葡萄糖代谢相关的蛋白质表达。因此，高通量和高灵敏度的蛋白质组学技术对于生物标志物筛选和环境污染物毒性研究至关重要。

邻苯二甲酸酯（PAEs）是一类常见的环境内分泌干扰物。由于其与塑料分子的化学键强度较低，经过风化和侵蚀后，PAEs会大量释放到不同的环境介质中（Lottrup等人，2006）。目前，在各种环境介质和生物体中发现了高浓度的PAEs（Liu等人，2023；Wu等人，2013；Zhang等人，2021；Zhang等人，2020）。其中，二丁基邻苯二甲酸酯（DBP）和二（2-乙基己基）邻苯二甲酸酯（DEHP）被认为是海洋水体中的主要污染物。Chi（2009）研究了流经天津附近渤海的海河中的PAEs浓度和组成，发现DBP和DEHP是主要污染物，最大浓度达到0.1 mg/L。本研究发现，在中国典型的半封闭海湾中，DBP和DEHP是污染最严重的污染物，其平均浓度在μg/L范围内。这些污染物对渤海生态系统构成了严重威胁。先前的研究表明，PAEs可以被生物体合成并释放，作为化感物质来增强其生长竞争力，从而更好地应对生物和非生物压力（Huang等人，2021）。Paluselli等人（2019）发现老化微塑料（MPs）会释放大量PAE。Ni等人（2023）和Meng等人（2024）也指出，MPs的渗滤液中含有大量PAE，会对微藻的生长产生不同程度的影响（Meng等人，2024；Ni等人，2023）。渤海的主要浮游植物种类是硅藻和甲藻，其中Gymnodinium是一种频率和丰度相对较高的甲藻类群（Song等人，2022）。因此，本研究选择了典型的PAEs（低分子量的DBP和高分子量的DEHP）作为研究对象，探讨它们对Gymnodinium的毒性作用，包括生长抑制、光合作用损伤、氧化应激和能量代谢紊乱。通过蛋白质组学技术研究了Gymnodinium对毒性压力的晚期分子反应及其与细胞活性维持相关的变化。这项研究为应用分子生物学方法研究新兴污染物对海洋微藻的毒性作用提供了新的见解。

章节摘要

微藻培养和暴露实验

Gymnodinium细胞细胞壁较薄，主要由纤维素组成，因此对有机污染物更敏感。本研究中使用的测试生物是从2020年夏季渤海采集的甲藻。经过野外样本筛选和分离后，该菌株在实验室条件下适应性培养，并建立了纯单胞培养物Gymnodinium sp.用于暴露实验。

对Gymnodinium生长的影响

不同浓度的DBP和DEHP对Gymnodinium的生长表现出不同的抑制作用。DBP对Gymnodinium的毒性明显具有时间和剂量依赖性。高浓度处理组（2 mg/L和5 mg/L）中的藻类密度从培养第一天起就显著下降（p < 0.01）（图2）。在显微镜观察中，微藻细胞出现明显的肿胀、不规则的细胞轮廓和广泛的细胞聚集。

讨论

与高分子量的DEHP相比，低分子量的DBP表现出更明显的生长抑制毒性、光合作用抑制、氧化损伤和能量代谢抑制作用。Liu等人（2016）发现，苯环侧链上烷基链较短的PAEs对微藻生长的抑制作用明显强于高分子量PAEs。Kreutzer等人（2022）也表明，低分子量的有机污染物具有更显著的有害抑制作用。

结论

低分子量的DBP对Gymnodinium表现出更明显的生理毒性作用，主要体现在生长抑制、光合作用损伤、氧化应激和能量代谢损伤方面。DBP对Gymnodinium的生长具有明显的时间和剂量依赖性毒性。F_v/F_m和F_t的下降以及OJIP曲线的变化都表明光合系统的电子传递链受到破坏。

CRediT作者贡献声明

Kun Lin：撰写——初稿、可视化、数据分析、概念化。Yanru Wang：可视化、软件操作。Hongyan Xu：验证、方法论。Liju Tan：软件操作、资源管理、项目监督、方法论、数据分析。Jianlei Chen：验证、数据管理。Ting Zhao：验证、形式分析。Jiangtao Wang：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了中国国家重点研发计划[项目编号：2019YFC1407802]和国家自然科学基金[项目编号：41876078]的支持。