巴基斯坦资源匮乏地区产后肠道微生物群特征与早产的关系

《Medicine in Microecology》：Post Partum Gut Microbiome Signatures and Prematurity in Low Resource Settings of Pakistan

　　纳维德·伊克巴尔（Naveed Iqbal）| 萨米亚·坎瓦尔（Samiah Kanwar）| 乌马尔·阿姆吉德（Umar Amjid）| 费尔昆·卡比尔（Furqan Kabir）| 沙克蒂·巴塔拉伊（Shakti Bhattarai）| 法蒂玛·阿齐兹（Fatima Aziz）| 贾瓦伊里亚·哈立德（Javairia Khalid）| 萨赫里什·穆尼尔（Sahrish Muneer）| 阿迪尔·卡拉姆（Adil Kalam）| 扎哈·法蒂玛（Zaha Fatima）| 阿妮塔·霍特瓦尼（Aneeta Hotwani）| M·法鲁克·卡齐（M. Farrukh Qazi）| 瓦尼·布奇（Vanni Bucci）| M·伊姆兰·尼萨尔（M. Imran Nisar）| 菲耶扎·贾汉（Fyezah Jehan）| 瓦卡苏丁·汗（Waqasuddin Khan）

巴基斯坦卡拉奇-74800，阿迦汗大学（Aga Khan University）儿科与儿童健康系，CITRIC生物信息学与计算生物学中心

摘要
全球每年有超过1500万婴儿早产，其中81%发生在低收入和中等收入国家（LMICs），这对健康和生活质量产生了显著影响。早产（PTB）的病因是多因素的，包括母体肠道微生物群受到微生物的影响。通过识别与早产相关的母体肠道微生物群特征，可以深入了解产后微生物模式及其对母婴健康的可能影响。本研究探讨了巴基斯坦（LMIC）资源匮乏环境中的母体肠道微生物多样性，旨在发现产后微生物群与早产之间的关联。为了研究肠道微生物群与早产之间的关系，我们对符合严格纳入标准的AMANHI粪便生物库样本进行了横断面病例对照比较分析（足月组=61例，早产组=47例）。在经过质量控制（QC）和去宿主处理后，我们仅保留了至少在5%的样本中存在的物种，并确保其平均比例≥1e-5，以便进行后续分析。非参数统计假设检验（Wilcoxon）显示，早产组的α微生物多样性显著高于足月组。值得注意的是，Prevotella copri、Bifidobacterium adolescentis、Lactobacillus ruminis和Faecalibacterium prausnitzii是所有样本中最丰富的四种物种。微生物群差异分析显示，Prevotella属和E. coli属的某些物种在足月组和早产组之间存在差异，表明它们与早产有关。随机森林分类（RFC）模型显示，P. copri是最重要的早产/足月区分微生物标志物。具体而言，RFC分析表明，在该产后数据集中，母体肠道微生物群中P. copri的相对丰度<0.13与早产状态有强烈关联。这些发现为在资源匮乏国家（如巴基斯坦）探索针对微生物群的干预措施提供了基础。

研究背景
早产是全球新生儿死亡和发病的主要原因。早产的病因复杂且多因素，越来越多的证据表明肠道微生物群和微生物群调节的免疫系统在理解早产病理生理学及其对妊娠结局的影响方面具有重要作用。我们使用“Gut microbiome and preterm birth”这一关键词在PubMed上检索了过去10年（2015-2025年）发表的英文文章，共找到317篇相关研究，但大多数研究来自高收入国家。尽管早产负担沉重，我们在南亚地区（尤其是巴基斯坦）发现的研究非常少。

本研究的价值
据我们所知，这项研究提供了来自巴基斯坦资源匮乏地区的母体肠道微生物群的全面分析，揭示了母体肠道微生物组成与早产之间的关联。分析发现，早产母亲的肠道微生物群中关键共生菌的丰度降低，而机会性微生物相对增多，表明肠道微生物群失调可能影响妊娠结局。值得注意的是，Prevotella copri的显著减少表明其作为益生菌候选物在缓解脆弱人群早产方面具有潜力。

所有现有证据的启示
我们的发现为现有文献提供了新的数据，这些数据来自高负担的LMIC背景，并使用了高分辨率宏基因组学方法。本研究强调了特定微生物标志物作为早产生物标志物的潜力。这些发现对于开发针对性的基于微生物群的干预措施以预防早产和改善母婴健康具有重要意义。

1. 引言
早产（PTB）定义为妊娠37周之前的分娩，是全球重大的公共卫生问题，估计每年有1500万例。全球每年有超过1350万婴儿早产，其中65%发生在南亚和撒哈拉以南非洲的LMICs。巴基斯坦的早产率（占所有活产婴儿的14.6%）是世界上最高的之一，这对新生儿死亡率和家庭及医疗系统的经济负担造成了巨大影响。早产的多因素病因包括母体感染、炎症、营养缺乏、遗传倾向以及影响免疫反应、胎盘功能和早产易感性的环境压力因素。越来越多的证据表明，母体微生物群在调节人类早产分娩中的免疫反应和小鼠胎盘发育方面起着关键作用。特别是在妊娠期间，母体肠道微生物群会发生显著变化，包括微生物多样性和组成的变化，这被认为是对妊娠生理需求的适应性反应。这些微生物动态直接影响系统炎症和免疫反应，进而可能影响胎儿发育和分娩时间。微生物平衡的破坏或失调与不良妊娠结局（APOs）有关，例如早产。研究表明，患有不良妊娠结局的女性体内存在更多的促炎细菌。例如，Ureaplasma urealyticum、Mycoplasma hominis、Bacteroides spp.、Gardnerella vaginalis和Fusobacterium nucleatum常见于与早产相关的感染中，而有益微生物如Lactobacillus和Faecalibacterium spp.在高风险妊娠中往往不足。在产后时期，多项研究报道了与APOs相关的特征性微生物群失调，表现为Bifidobacterium和乳杆菌等共生菌的丰度降低，以及潜在致病菌群（如链球菌和梭菌目成员）的增多。在撒哈拉以南非洲地区，耐降解淀粉的细菌（如Ruminococcus bromii和Faecalibacterium prausnitzii）与妊娠结局（包括出生体重和新生儿生长）显著相关。关于LMICs（包括巴基斯坦）的母体肠道微生物群的研究有限，而这些地区的APOs负担很高。研究可能作为APOs的潜在微生物生物标志物的微生物分类群有助于填补这一知识空白。此外，鉴于母体微生物群在塑造新生儿微生物群中的关键作用，研究产后微生物群可能为了解与健康结局相关的微生物模式提供宝贵见解。

2. 材料与方法
2.1 研究设计
本研究采用了嵌套病例对照方法，使用来自AMANHI-Pakistan妊娠和新生儿生物库的样本来探讨与早产相关的肠道微生物群特征。该研究是更大的基于人群的前瞻性AMANHI生物库队列的一部分，该队列包括了撒哈拉以南非洲和南亚地区入选孕妇及其婴儿的详细临床、流行病学和社会经济数据，旨在识别APOs的生物标志物。

2.2 伦理
本研究获得了阿迦汗大学伦理审查委员会（ERC）（2022-8264-23575）和国家生物伦理委员会（4-87/NBC-915/22/1432）的批准。

2.3 样本选择标准
AMANHI-Pakistan生物库包含了2014年11月至2020年1月期间收集的母体粪便样本（N = 2,150），使用标准化的AMANHI粪便样本收集方案（见补充方法1）。为了严格评估肠道微生物群在早产病因中的作用，我们应用了严格的、基于文献的选择标准，以尽量减少可能独立导致早产的外部因素。这有助于分离出驱动早产的微生物群相关因素，确保观察到的肠道微生物群差异不是由潜在的母体状况或治疗引起的。选择标准排除了多发性合并症的孕妇，例如糖尿病、甲状腺疾病、癌症、心血管疾病、癫痫、精神疾病、高血压、HIV、疟疾、结核病、丙型肝炎、乙型肝炎、尿路感染、肾脏疾病和其他感染。为了减少药物和生活方式因素引入的潜在偏差，排除了在妊娠期间使用抗生素、咖啡因、安眠药、抗惊厥药、抗逆转录病毒药、降压药、口服降糖药、抗疟疾药物的孕妇。

2.4 粪便DNA提取和鸟枪法宏基因组测序
根据制造商说明，使用DNeasy PowerSoil Pro Kit（QIAGEN，德国）从粪便样本中提取微生物DNA。使用NanoDrop光谱仪（Thermo Fisher Scientific，美国）和Qubit? 1X dsDNA高灵敏度检测（Invitrogen，比利时）评估DNA的质量和数量。样本被标准化至100 ng，并在13 μL无核酸酶水中用于文库制备。使用NEBNext? Ultra? II FS DNA文库制备试剂盒（New England Biolabs，美国）和独特的双重索引引物制备鸟枪法宏基因组文库。采用AMPure XP磁珠进行纯化和清洗步骤。使用Agilent TapeStation 4200确认文库质量和片段大小。文库在Illumina NextSeq 2000平台上进行测序，使用配对末端151 × 2读取和NextSeq? 2000 P3试剂（300循环试剂盒），并加入2%的PhiX spike-in。测序运行设置和数据管理通过BaseSpace Sequence Hub完成。

2.5 生物信息学处理流程
2.5.1 测序读长的质量控制与预处理
原始测序数据以FASTQ文件的形式从NextSeq2000传输到CITRIC生物信息学与计算生物学中心（CBCB）服务器进行安全处理和存储。采用了常规的宏基因组学流程进行微生物群差异丰度和关联分析（图1）。使用FASTQC（v0.11.9）进行读长质量评估，并由KneadData（v0.10.0）进行预处理。

2.5.2 分类群分析
使用MetaPhlAn v3.1.0对微生物群进行分类学分析。高质量读长根据最新的ChocoPhlAn数据库（v31）进行聚类，该数据库包含来自超过100,000个参考基因组的约110万个独特标记，涵盖细菌、古菌、真核生物和病毒分类群。在清洗后的测序数据上进行分类学分析，计算每种分类群的相对丰度、估计的读数计数和覆盖率。分类学信息被解析为层次化级别：界、门、纲、目、科、属和种。使用Bray-Curtis估计和OLO方法对微生物群分类组成进行探索，以便可视化按比例排序的物种级分类群。

2.6.2 微生物群分析的统计框架
2.6.1 分类群过滤和数据标准化
过滤掉丰度低于5%且平均比例低于1e-5的分类群。使用总样本量缩放（TSS）对分类群丰度数据进行标准化，以处理测序深度偏差，减少噪声并提高下游统计分析的可靠性。

2.6.2 多样性分析
使用phyloseq（v1.50.0）中的estimate_richness函数计算Shannon多样性指数，评估α多样性，代表样本内的微生物多样性。采用Wilcoxon秩和检验比较组间的α多样性，并使用Benjamini-Hochberg方法（BH）调整p值以控制假发现率（FDR）。为了评估早产和足月分娩母亲之间肠道微生物组成的差异，计算成对社区距离（Bray-Curtis）以量化β多样性。为了可视化社区组成的差异，使用Vegan（v2.6.4）对Bray-Curtis距离矩阵进行降维处理，即主坐标分析（PCoA）。通过排列多项式方差分析（PERMANOVA）测试了β多样性的统计差异，这为与出生结果相关的组成变化提供了洞察。2.6.3. 差异性分类群丰度分析使用MaAsLin2（v1.12.0）进行了差异丰度分析。估计了一个经过调整的多变量广义线性模型（GLM），考虑了母亲年龄、BMI、MUAC、妊娠期、产次、产前出血史、分娩方式以及产后样本收集时间与分娩时间的关系。协变量是基于其生物学合理性及其对肠道微生物组组成和产前出血风险的潜在影响预先选定的。数值变量使用Wilcoxon秩和检验进行比较，而分类变量则使用卡方检验进行分析。设置了至少5%的流行率截止标准、TSS标准化以及相对丰度的弧-sine平方根转换，显著性调整后的p值阈值<0.05，以识别差异丰度的分类群。差异分类群的趋势和倍数变化分别用热图和火山图可视化表示。为了识别早产母亲与足月母亲中显著富集的分类群，我们对母亲的肠道微生物组样本进行了线性判别分析效应大小（LEfSe）研究。该方法结合了统计显著性和生物学相关性，使用非参数Kruskal-Wallis检验来识别在不同组间有显著差异的特征，然后通过LDA估计每个差异丰度特征的效应大小。使用了2的显著性阈值以确保生物学效应的大小是有意义的。分析配置为在亚组之间进行成对比较，以确保与产前出血相关的分类群能够被稳健地识别。2.6.4. 与产前出血分类相关的微生物组特征采用机器学习（ML）方法进一步探索了微生物组和元数据协变量对产前出血状态的分类能力。构建了随机森林（RF）分类模型，利用微生物特征和母亲协变量（年龄、BMI、MUAC、妊娠期、产次、产前出血史、分娩方式和产后样本收集时间与分娩时间的关系）来区分产前出血和足月分娩。通过将潜在的混杂因素作为额外的分类器包含在模型中来调整协变量，从而使模型能够根据这些母亲协变量来条件化产前出血状态的分类。RF分析涉及选择超参数，包括树的数量（ntree）和每次分割时随机选定的变量数量（mtry）。ntree参数设定为500以确保模型稳定并最小化方差。mtry参数根据模型中包含的特征总数的平方根进行调整。使用Gini指数的平均减少来评估特征的重要性。使用AUC/F1分数评估模型性能，其中变量用于识别对产前出血分类贡献最大的分类群和协变量。将这些协变量同时纳入差异丰度分析和ML建模中，使我们能够考虑潜在的混杂因素，同时评估微生物组关联和模型性能。为了提高RF结果的可解释性，应用了稳定且可解释的规则集（SIRUS，v0.3.3）方法。根据规则的出现频率及其对分类性能的贡献来选择规则。评估表明特定微生物分类群丰度低于定义阈值的规则在区分产前出血和足月分娩方面的能力。统计分析使用R（v4.0）在AKU高性能计算（HPC）设施进行。2.7. 资助者的作用资助者没有参与数据分析、解释或本手稿的撰写，也没有决定是否提交发表。3. 结果3.1. 参与者特征早产和足月分娩的母亲在关键的社会人口统计特征方面相当，包括母亲年龄、MUAC、体重指数、妊娠期、怀孕期间的营养补充剂、分娩方式和财富指数（表1，补充图S2）。产前出血病例的平均妊娠期为34.7周，而足月对照组为39.3周。两组中，正常/阴道分娩是最主要的分娩方式，分别占早产的38（80.9%）和足月的53（88.3%）。表1. 早产组和足月组之间的母亲人口统计学和临床特征。因素相关联早产组足月组总计p值47（43.5%）61（56.5%）108（100%）母亲特征母亲年龄，均值±标准差26.1 ± 5.226.9 ± 5.326.6 ± 5.20.43< 25岁18（38.3%）17（27.9%）35（32.4%）0.5525-35岁26（55.3%）38（62.3%）64（59.3%）> 35岁3（6.4%）6（9.8%）9（8.3%）母亲上臂围（MUAC），均值±标准差，n = 10623.8 ± 3.824.9 ± 4.324.5 ± 4.10.17营养不良（MUAC < 21）10（21.3%）10（16.9%）20（18.9%）0.48正常（21 ≤ MUAC < 23）13（27.7%）12（20.3%）25（23.6%）营养良好（MUAC ≥ 23）24（51.1%）37（62.7%）61（57.5%）母亲体重指数（BMI），均值±标准差21.3 ± 5.323.1 ± 5.422.3 ± 5.40.1体重过低（BMI < 18.5）18（38.3%）13（21.3%）31（28.7%）0.29正常（18.5 ≤ BMI > 25）17（36.2%）28（45.9%）45（41.7%）超重（25 ≤ BMI < 30）8（17.0%）12（19.7%）20（18.5%）肥胖（BMI ≥ 30）4（8.5%）8（13.1%）12（11.1%）妊娠期13（6.4%）10（16.4%）13（12.0%）0.16212（25.5%）12（19.7%）24（22.2%）311（23.4%）7（11.5%）18（16.7%）421（44.7%）32（52.5%）53（49.1%）产次14（8.5%）11（18.0%）15（13.9%）0.43228（59.6%）28（45.9%）56（51.9%）310（21.3%）14（23.0%）24（22.2%）45（10.6%）8（13.1%）13（12.0%）分娩周数的平均妊娠期34.7 ± 1.639.3 ± 1.337.3 ± 2.7< 0.001财富指数中等6（12.8%）10（16.4%）16（14.8%）0.85贫困14（29.8%）16（26.2%）30（27.8%）富裕9（19.1%）11（18.0%）20（18.5%）最富裕11（23.4%）11（18.0%）22（20.4%）最贫困7（14.9%）13（21.3%）20（18.5%）分娩方式，n = 107正常/阴道分娩38（80.9%）53（88.3%）91（85.0%）0.26辅助分娩0（0.0%）1（1.7%）1（0.9%）剖宫产9（19.1%）6（10.0%）15（14.0%）怀孕期间的营养补充剂是8（17.0%）9（14.8%）17（15.7%）0.75否39（83.0%）52（85.2%）91（84.3%）怀孕期间的并发症糖尿病是0（0.0%）1（1.6%）1（1.6%）0.99否47（100.0%）60（98.4%）107（99.1%）高血压是4（8.5%）1（1.6%）5（4.6%）0.16否43（91.5%）60（98.4%）103（95.4%）产后感染是9（19.1%）11（18.0%）20（18.5%）0.88否38（80.9%）50（82.0%）88（81.5%）产科历史早产6（13.6%）6（11.8%）12（12.6%）0.78剖宫产6（13.6%）2（3.9%）8（8.4%）0.089死产3（6.8%）2（3.9%）5（5.3%）0.53流产14（31.8%）20（39.2%）34（35.8%）0.453.2. 读取质量控制和处理去宿主对母亲肠道微生物组样本的霰弹枪宏基因组测序平均每个样本产生了2800万个读取，为下游宏基因组分析提供了稳健的数据集。使用KneadData进行体内质量控制和宿主读取去除，每个样本平均得到1608万个高质量的去宿主读取。这种高保留率确保了我们的测序数据集用于全面微生物分析的可靠性。3.3. 母亲肠道微生物组组成为了达到物种级别的分类分辨率，将高质量的去宿主读取映射到特定于分支的标记基因上。这导致样本的平均映射率为54.69%。平均每个宏基因组检测到773个微生物物种，突显了数据集中捕获的高生物多样性。基于丰度的物种分析显示了样本之间的显著组成差异，反映了个体间的显著差异。使用Bray-Curtis差异度对样本进行聚类，进一步表明数据集内的生态结构。值得注意的是，一部分宏基因组中Prevotella copri占主导地位，它在多个样本中始终是最丰富的物种，表明它是产后肠道生态系统中的潜在定植者（图2）。其他常见的分类群，包括Bifidobacterium adolescentis、Lactobacillus ruminis、Faecalibacterium prausnitzii、Bifidobacterium longum和Escherichia coli，遵循相对丰度的梯度，而低丰度物种共同贡献了社区的总体多样性。此外，较少但始终被检测到的物种，如Dorea longicatena、Eubacterium rectale和Clostridium sp. CAG 568，也进一步塑造了微生物景观。这些发现表明母亲肠道微生物组在个体间具有结构化但异质的组成。下载：下载高分辨率图像（893KB）下载：下载全尺寸图像图2. 基于Bray-Curtis差异度的微生物组样本聚类。水平条形图显示了所有肠道宏基因组样本中10个最丰富分类群的分布。样本根据Bray-Curtis差异度指数进行排序，聚集在一起，并位于具有相似微生物组成的样本旁边。颜色编码的分类群表示表示微生物组成的变化。Prevotella copri在部分宏基因组中占主导地位，成为多个样本中最丰富的物种，表明其作为关键定植者的角色，其次是Bifidobacterium adolescentis，作为第二丰富的定植者。3.4. 稀有分类群的过滤和主导微生物群在分类学分析之后，彻底过滤掉了低丰度分类群，以最小化分析噪声并提高下游分析的统计稳健性，从而得到了包含246个分类群的精炼数据集（补充图S3）。过滤掉稀有分类群后，保留的微生物群显示前20个物种级别的分类群占本研究中包含的总母亲肠道微生物组的68%。这些20个分类群中的每一个都至少对整体微生物组成贡献了1%，突显了它们在塑造社区结构中的主导作用（图3a）。其中，九个被认为是革兰氏阴性菌，十一个是革兰氏阳性菌，反映了分类学上多样化的微生物景观。这些主导分类群的分布和相对丰度在足月母亲中显示出最高的流行率和更大的富集（图3b）。下载：下载高分辨率图像（993KB）下载：下载全尺寸图像图3. 展示母亲肠道样本中发现的多样化微生物群。（a）展示了革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌物种的不同水平。Prevotella copri和Bifidobacterium adolescentis作为主要贡献者，具有更高的相对丰度。（b）使用属物种级别的细菌相对丰度生成的热图。x轴代表分为两组（早产和足月）的样本，而y轴代表物种级别的分类学。热图刻度显示了从100到10-5的细菌物种相对丰度。3.5. 肠道微生物组多样性使用Shannon指数评估的α多样性显示两个母亲群体之间的社区丰富度和均匀性存在显著差异（Wilcoxon秩和检验，p < 0.0001；图4a）。早产案例的肠道微生物组显示出更大的分类学丰富度和均匀性，包含了230个细菌物种，相对丰度分布更均匀（均值：0.436；标准差±1.115），而足月对照组包含了176个物种，平均相对丰度更高（0.57；标准差±2.913），表明社区结构更不均匀。下载：下载高分辨率图像（319KB）下载：下载全尺寸图像图4. 母亲肠道微生物组的微生物多样性。（a）Shannon α多样性矩阵的箱线图，突出了早产和足月母亲肠道微生物组之间社区丰富度和均匀性的显著差异（Wilcoxon p < 0.0001）。（b）使用Bray-Curtis差异度指数的PCoA图，分别显示早产（灰点）和足月（橙点）组。线条椭圆对应于每个组中具有统计显著性（p < 1e-04）的簇，而PCoA轴1和2共同解释了33.1%的早产和足月组之间的变异。在不同的分娩结果组中观察到了不同的微生物群聚类模式。早产的母亲拥有与足月分娩不同的肠道微生物组组成。这种分离在排序空间中显而易见，并得到了PERMANOVA检验的支持（p = 1 × 10-4），证实了整体分类组成的显著差异。这些发现表明与出生结果相关的微生物群发生了显著变化（图4b）。3.6. 微生物组与产前出血的关联在多变量调整潜在混杂因素后，GLM识别出分娩结果之间母亲肠道微生物组组成的显著变化。来自Bacteroidales（Bacteroidaceae科、Prevotellaceae科、Rikenellaceae科）、Clostridiales（Clostridiaceae科、Lachnospiraceae科）和Enterobacterales（Escherichia）目的细菌分类群的丰度和分布在这两组之间表现出显著差异。早产的母亲显示出Prevotella copri物种的显著减少，同时Escherichia coli、Bacteroides、Clostridia、Firmicutes和Methanobacteria的成员增加（图5a）。早产对肠道微生物组的对数2倍数影响显示出明显的分类学变化，丰富了Escherichia coli、Alistipes、Ruminococcus和Bacteroides，而Prevotella copri在足月分娩中占主导地位（图5b）。尽管关键的母亲协变量在早产组和足月组之间没有显著差异（表1；补充图2），但包括这些协变量确保了这些微生物“特征”代表了独立于测量混杂因素的关联。下载：下载高分辨率图像（866KB）下载：下载全尺寸图像图5. 早产和足月样本中差异丰富的细菌物种。（a）热图显示了差异丰富细菌物种的对数10转换相对丰度。x轴代表分为早产和足月类别的个别样本，而y轴列出了物种级别的细菌物种。颜色刻度反映了相对丰度，范围从100到10-5。（b）火山图显示了早产和足月样本之间操作分类单元（OTUs）的差异丰度。x轴代表对数2倍数变化（早产/足月），其中正值表示在早产样本中富集的分类群，负值表示在足月样本中更丰富的分类群。y轴显示了-log10调整后的p值（q值），突出显示了统计显著的物种。标记的分类单元表示在数量上有显著差异的物种，这为与早产（PTB）相关的微生物变化提供了见解。此外，使用LEfSe（LDA效应大小）进行效应大小估计，确定了在不同分娩结果组中差异富集最强烈的分类单元。这项分析揭示了显著的对数2倍变化，发现大肠杆菌（Escherichia coli）、瘤胃球菌（Ruminococcus）、长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）、普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus）以及梭菌属（Clostridia）中的物种在早产儿的肠道微生物组中富集最明显，而普雷沃氏菌（Prevotella）物种则明显减少（图6）。这些组成差异表明与早产风险相关的独特微生物组特征，可能表明存在影响妊娠结果的肠道微生物组失调。

3.7. 与早产相关的肠道微生物组特征
随机森林（Random Forest, RF）模型结合了微生物组特征和关键的 maternal 协变量，显示了对早产的稳健分类，准确率最高（AUC = 0.954；F1 = 0.867），表明早产和足月分娩之间存在强烈的区分能力。将 maternal 变量作为协变量纳入模型，使模型能够解释潜在的混杂因素，并自信地识别相关分类单元。早产后的关键肠道微生物组特征包括普雷沃氏菌（Prevotella copri）的丰度降低，以及普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus）、副拟杆菌（Parabacteroides distasonis）和厚壁菌门细菌（Firmicutes bacterium_CAG_83）的丰度略有增加（图7）。

为了提高 RF 模型的可解释性，我们应用了 SIRUS（Stable and Interpretable Rule Set）规则提取方法。解释结果显示，普雷沃氏菌（Prevotella copri）的丰度临界阈值（< 13%）是与早产状态相关的关键产后肠道微生物特征。这一阈值提供了一个潜在的生物标志物，有助于风险评估，便于识别高风险个体并实施及时的干预策略。

4. 讨论
母体肠道微生物组在早产中的作用已成为一个关键研究领域，我们的研究为早产儿的微生物组特征提供了新的见解。这项研究在资源有限的巴基斯坦环境中对母体肠道微生物组进行了全面分析，揭示了母体肠道微生物组成与早产之间的关联。尽管粪便样本是在产后收集的，但研究群体来自具有相似 maternal 人口统计学特征的相对同质人群，并且足月和早产组之间没有报告医疗干预措施。在这种受控背景下，观察到的微生物特征可能反映了与早产相关的产后微生物状态，而非分娩前的决定因素。我们的研究发现，早产母亲的肠道微生物组表现出与足月分娩者的不同特征，包括 α 多样性的增加、β 多样性的改变以及特定的微生物组特征。这些差异突显了肠道微生物组成与早产状态之间的强烈相关性。
我们的嵌套病例对照研究共有108名女性（47例早产，61例足月分娩），在 maternal 人口统计学特征或临床变量方面没有显著差异，仅 gestational 年龄存在差异，从而减少了混杂偏差。这种严格的匹配增强了我们微生物关联的有效性，符合产科微生物组病例对照研究的建议。

我们研究中最引人注目的发现之一是，在早产母亲中观察到的 α 多样性显著增加。这一观察似乎矛盾，因为通常认为微生物多样性减少与失调和疾病状态相关，而香农多样性（Shannon diversity）的增加则与自然早产的风险降低相关。然而，其他证据表明，较高的 α 多样性也可能是失调状态的特征，尤其是在炎症或不稳定的微生物组背景下。最近的研究也发现早产妇女的肠道微生物组中 α 多样性增加。这种多样性可能反映了与早产状态相关的微生物群落结构的不稳定性，其中机会性或致病菌种会增殖，导致更加异质但可能有害的生态系统。这种组成变化可能表明生态系统的破坏，使群落更容易受到环境干扰，且更难以抵抗潜在有害微生物的定植。

随机森林分析进一步支持了这些结果，确定普雷沃氏菌（Prevotella copri）的丰度阈值（< 13%）是区分早产和足月分娩的最重要微生物特征之一。这些组成变化指向与早产风险相关的独特微生物组特征。普雷沃氏菌（Prevotella copri）的减少尤为显著，因为先前的研究经常将普雷沃氏菌物种与炎症状态和失调相关疾病联系在一起。普雷沃氏菌（Prevotella copri）的保护作用可能与其在碳水化合物代谢和短链脂肪酸（SCFA）生产中的作用有关，这些物质对维持肠道稳态和减少系统性炎症至关重要。因此，早产母亲微生物组中普雷沃氏菌丰度的降低可能反映了肠道生态系统的破坏，以及向不利微生物谱型的转变。法蒂玛·阿齐兹（Fatima Aziz）：写作——审稿与编辑、方法论、数据整理。贾瓦伊里亚·哈利德（Javairia Khalid）：写作——审稿与编辑、撰写初稿、项目管理、数据整理。萨赫里什·穆尼尔（Sahrish Muneer）：写作——审稿与编辑、方法论、数据整理。阿迪尔·卡拉姆（Adil Kalam）：写作——审稿与编辑、方法论、数据整理。
**未引用的参考文献**30。
**利益冲突**
作者声明不存在利益冲突。