热处理对基因组DNA完整性的影响以及数字PCR中的定量偏差

《Methods》：Impact of thermal treatment on genomic DNA integrity and quantification bias in digital PCR

　　

金大孙|申泰珍|洪赛罗姆|裴英京|杨寅喆|李大惠

韩国标准科学研究院生物计量学小组，大田，大韩民国

摘要

保持DNA的完整性（即DNA链的完整性和正确的序列结构）对于分子方法中的测量和解释的可靠性至关重要。基因组DNA的变性温度受多种因素影响，包括GC含量、离子强度以及稳定或不稳定因子的存在。在这项研究中，我们探讨了在低盐和高温条件下人体基因组DNA的变性行为。我们使用数字PCR作为主要的分析工具来检测DNA稳定性，并能够量化DNA链分离的程度。为了确保观察到的变化反映了结构变化而非DNA降解或蒸发，我们采用了定量PCR和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）等互补分析方法。尽管在限制性内切酶的操作过程中广泛使用热失活技术，但我们对这些处理如何影响基因组DNA结构的理解仍存在显著不足。我们的发现对分子生物学程序的可靠性和重复性具有重要意义，尤其是那些依赖于精确DNA定量或结构完整性的程序。

引言

DNA完整性是指核酸分子保持其天然的双链结构，没有断裂、切口或大规模碱基修饰等物理损伤[1] [2]。它从根本上涵盖了防止DNA部分变性及其他可能干扰下游分子过程的结构扰动[3]。随着基因组学、临床诊断和生物制药领域对高保真DNA材料及严格质量保证要求的提高，标准化和全面的DNA完整性评估已成为不可或缺的计量学需求[4] [5]。然而，高分子量基因组DNA固有的结构复杂性常常在测量过程中引入显著的分析偏差，从而使得定量结果的解读变得更加复杂[6] [7]。常见的破坏DNA完整性的外源性因素包括剧烈吸管操作导致的机械剪切、涡旋效应、紫外线照射、固定剂或污染物的化学修饰、反复的冻融循环以及核酸酶的酶促降解[8] [9] [10] [11]。此外，DNA分子的热力学稳定性和构象稳定性会受到环境因素（如温度、离子强度和pH值）的显著影响，而这些因素在实验协议中经常被人为调控[12]。DNA双螺旋的热力学稳定性由内在的碱基组成和外在环境因素之间的复杂相互作用决定。富含AT的区域在较低温度下比富含GC的区域更容易变性，从而产生所谓的“部分变性”或“呼吸”现象，即部分DNA链发生分离，而大部分DNA仍保持双链状态[13]。从外部来看，这种稳定性与周围缓冲液的离子强度和环境热能有关[14] [15]。在离子强度较低的情况下，Debye长度增加，DNA的熔解温度（Tm）显著下降。

目前评估DNA完整性的方法大致可以分为结构和功能两种类型，每种方法都具有不同程度的分析灵敏度和分子分辨率。光谱技术（如紫外-可见光谱光度法和荧光法）可以快速检测DNA浓度和化学纯度，但它们对分子结构的信息量有限[8]。电泳方法（如琼脂糖凝胶电泳和毛细管电泳）可以表征DNA的大小分布并识别不同的片段特征[3] [16]。通过使用对双链DNA具有特异性结合亲和力的荧光染料，这些平台还可以区分不同的构象状态（如变性）[17]。对于超微结构分析，高分辨率成像技术（如原子力显微镜（AFM）和透射电子显微镜（TEM）能够直接观察单个DNA分子。AFM可以在纳米尺度上显示DNA链上的特征，包括切口、弯曲和部分变性[18] [19]。相比之下，TEM可以详细研究DNA的拓扑结构、构象变化和大规模结构完整性[20]。然而，尽管这些方法具有无与伦比的细节分辨率，但它们操作复杂且成本高昂，这限制了其在主流基因组研究中的广泛应用。此外，它们不支持高通量分析，因此不如其他方法适合常规质量控制。

数字PCR作为一种强大的核酸定量工具，相较于传统的定量PCR方法具有更高的精确度和灵敏度[21]。数字PCR无需外部标准曲线即可确定拷贝数浓度。最重要的是，数字PCR可以将DNA分子分配到各自的扩增反应中，从而直接估计DNA分子的数量。这种分配特性使它特别适合分析DNA完整性。通过设计针对基因组不同区域或潜在片段位点的检测方法，数字PCR可以高灵敏度和高精度地推断DNA片段的存在和程度[22]。这使其特别适用于分析部分降解的样本或验证DNA的结构完整性。除了简单的片段化检测外，数字PCR的这一分配特性还增强了其检测微妙构象变化（如DNA变性）的能力[23]。以往的研究主要集中在高温下的完全DNA熔解现象上，而对部分变性行为的系统研究较少[24] [25] [26]。

在这项研究中，我们利用数字PCR系统地量化了在模拟低盐缓冲液环境和不同加热条件下的基因组DNA变性动态。通过定量PCR和液相色谱-串联质谱的正交分析，我们证明基因组DNA的总质量保持不变。为了仔细区分结构变性和化学降解，我们使用针对双链的限制性内切酶进行了构象变化的验证。此外，我们证明了这些观察结果在不同数字PCR平台上的普遍性，并确认了热处理的效果即使在预先发生片段化的基因组DNA中也是一致的。这些结果对于理解需要在精确控制缓冲液条件和热处理条件下的生化过程中的DNA稳定性具有意义。这种对DNA变性动态的改进理解将有助于优化和标准化分子生物学程序。

节选内容

细胞培养和基因组DNA制备

Jurkat细胞（人T淋巴细胞）在含有RPMI1640（Gibco，纽约州格兰德岛，#11875093）的T75培养瓶中培养，同时添加10%胎牛血清（FBS，Gibco，#26140079）和1%青霉素/链霉素（Gibco，#15140122）。根据制造商的说明书，使用DNeasy Blood & Tissue Kit（QIAGEN，德国希伦，#69504）从培养的5×10^6个细胞中提取基因组DNA。简要来说，将沉淀物重新悬浮在200 μL的PBS（Corning，纽约州，#21–040-CV）中，然后...

缓冲液离子强度对热诱导DNA变性的影响

为了评估人类基因组DNA（gDNA）的结构稳定性，我们在不同的离子强度和温度范围内监测了其物理和化学性质。从标准的1×TE（10 mM Tris和1 mM EDTA）缓冲液储存条件开始，逐步降低TE浓度并提高孵育温度。通过TapeStation电泳初步评估显示，gDNA在低于70°C的温度下仍保持视觉上的稳定性（图1A）。

讨论

我们的研究发现表明，即使在低离子强度条件下进行温和的热处理，也能仅通过数字PCR增强拷贝数浓度的增加。虽然TapeStation凝胶上条带的消失通常会被解释为DNA降解，但我们的数字PCR和qPCR数据表明情况并非如此。数字PCR定量结果约1.7倍的增加与qPCR结果保持不变形成对比，说明这种现象具有选择性。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了韩国国家研究基金会（NRF）的资助（由韩国政府（MSIT）提供，项目编号RS-2025-24533867）。同时，还得到了韩国标准科学研究院（KRISS）资助的先进生物和医疗测量技术开发项目（项目编号2025-GP2025-0007）的支持。此外，本研究还得到了韩国标准科学研究院资助的先进生物制药质量控制平台开发项目的支持（项目编号2026-…）。