《Methods》：Identification of black carbon in placental tissue using scanning electron microscopy and energy dispersive X-ray fluorescence
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加尔维塔·帕里克（Garvita Parikh）|普拉蒂克·查皮亚（Pratik Chhapia）|普拉萨恩吉特·马伊蒂（Prasenjit Maity）|布米卡·帕特尔（Bhoomika Patel）印度古吉拉特邦甘地讷格尔（Gandhinagar）国家级法医科学大学（Nati
加尔维塔·帕里克（Garvita Parikh）|普拉蒂克·查皮亚（Pratik Chhapia）|普拉萨恩吉特·马伊蒂（Prasenjit Maity）|布米卡·帕特尔（Bhoomika Patel）
印度古吉拉特邦甘地讷格尔（Gandhinagar）国家级法医科学大学（National Forensic Sciences University）药学院，邮编382007
摘要
目前，用于检测人体组织中黑碳（BC）沉积的标准化和成熟分析方法非常少，且这些方法存在一定的局限性。本文提出了一种非破坏性的、可靠的方法，以胎盘组织基质为案例研究，用于识别软生物组织中的黑碳沉积。研究从50名妊娠晚期的孕妇中获取了胎盘组织。该方法采用关联工作流程，利用扫描电子显微镜（SEM）进行疑似黑碳颗粒的高分辨率形态学筛选，并通过能量分散X射线荧光（EDXRF）技术确认特定元素成分。首先通过将木炭外嵌到两组胎盘组织中进行初步实验，证实了该方法能够基于元素分析区分外源性黑碳颗粒与原生生物基质。随后，该方法被应用于48份未经木炭外嵌处理的胎盘组织，结果在胎盘表面（尤其是胎儿侧）检测到了黑碳沉积。这种SEM-EDXRF关联方法为生物组织中黑碳的检测提供了可靠有效的框架，实验通过黑碳颗粒与原生生物基质的元素特征差异得到了验证。不过，该方法在定量分析方面仍存在局限性。
引言
黑碳（BC）是细颗粒物的主要成分之一[1]。它由碳基化合物组成，来源包括部分燃烧的植物材料以及化石燃料和生物质不完全燃烧产生的石墨化烟尘[2][3][4][5][6]。黑碳颗粒呈黑色链状球状簇，具有不规则的几何结构，是化学物质沉积的活跃位点[5][7][8][9]。其主要成分是碳，含有微量氧和氢[6][10]。与木炭或焦炭（O/C = 0.2–0.6）相比，烟尘的氧碳比（O/C < 0.2）更低，表明其碳含量超过60%，同时含有氧、氢和硫[11]。直径小于2微米的黑碳颗粒被认定为总颗粒物的更准确指标[12]，这是因为它们在气溶胶中的停留时间较长，干沉降速率为0.1厘米/秒[11]。此外，黑碳颗粒具有较高的表面积与体积比，并具有较强的非极性物质（如二噁英等）亲和力[13][14]。环境中的黑碳往往携带多种有害元素，如硝酸盐、重金属、半挥发性有机碳和多环芳烃，这些物质会对人体健康造成影响[3][6][15][16]。需要注意的是，黑碳与炭黑（CB）不同：炭黑是通过控制条件下的部分燃烧和气相热解商业生产的[17]。炭黑具有石墨结构，由于工业化生产过程的控制，其颗粒尺寸均匀且单一[17]。炭黑通常以葡萄状聚集体形式存在，由随机分枝和完全熔合的球形碳颗粒组成[18]，主要应用于橡胶制品和汽车轮胎[19][20]。
多项研究表明，吸入颗粒物不仅会影响肺部健康[21]。Maher等人（2016年）在尸检脑组织的前额皮质中发现了燃烧产生的空气污染纳米颗粒[22]；Saenen等人（2017年）在健康儿童的尿液中检测到黑碳，说明这种环境污染物广泛存在于环境中，并能影响多种器官系统[23]。黑碳还是暴露组（exposome）的重要组成部分[24]，可能对妊娠[25][26]和出生结果[27][28][29]产生不利影响，还可能与DNA甲基化和基因表达变化等分子变化相关[30][31][32]。这可能会影响婴儿日后患病的可能性。妊娠期间，胎盘作为母体与胎儿之间的复杂多功能器官，负责营养物质和废物的交换。多项研究发现，香烟中的多种成分（如多环芳烃和尼古丁[33]）以及酒精[34]能够穿透胎盘并影响胎儿发育。同样，黑碳也可能通过血管转移到胎盘，并在胎盘绒毛组织的滋养层沉积[35][36]。因此，需要开发出能够在多种组织（包括胎盘）中检测黑碳的方法。
迄今为止，仅有少数几种黑碳检测方法，例如基于飞秒脉冲激光显微镜的无标记生物相容性检测技术。该技术利用多光子激光扫描显微镜，在飞秒脉冲照明下检测黑碳发出的非发光白光，无需荧光标记即可识别生物样本中的黑碳[37][38]。许多研究人员使用该技术来检测脑组织[38]、胎盘组织[37]和人类卵巢组织[2]中的黑碳。其优势在于具有固有的三维成像能力[38]以及无需标记的优点[40]。然而，这种方法成本较高[41]，且需要复杂的光学设备，限制了其在标准生物实验室中的应用。另一种检测黑碳的技术是拉曼光谱法，这是一种振动光谱技术，通过检测振动引起的极化率变化来识别黑碳[42]。在人体肺外组织的研究中确实发现了黑碳[43]。该技术的优势在于非破坏性且样本准备简单，但存在一些局限性，如组织自发荧光可能干扰拉曼信号、拉曼谱强度较低以及需要操作人员具备较高技术水平[44]。另一种光谱技术——激光解吸/离子化质谱（LDI-MS）也被用于小鼠组织中的黑碳分析[45]。这种技术快速准确[39]，但仅能识别来自石墨烯离子化片段的低丰度碳簇[46]。因此，亟需开发新的分析方法来检测生物组织中的黑碳。本研究开发了一种利用扫描电子显微镜（SEM）检测胎盘表面黑碳沉积的方法，并通过能量分散X射线荧光（EDXRF）确认其中存在的元素。SEM是一种具有极高分辨率成像能力的表面分析技术，用于观察表面形态[47]；EDXRF则用于确认组织样本中元素的比例。EDXRF是一种非破坏性分析技术，基于每种元素独特的原子结构，在外部能量源激发下会发射特定波长的X射线[48]。
章节摘录
研究对象与数据收集
本研究旨在利用多种检测方法观察胎盘组织中的黑碳沉积情况。根据纳入和排除标准，共有50名妊娠晚期的孕妇参与了研究，她们来自艾哈迈达巴德（Ahmedabad）Byramjee Jeejeebhoy医学院及附属医院[6]。纳入/排除标准见表1。参与者根据居住区域被分为两组：暴露组（n = 25）和非暴露组
扫描电子显微镜
本研究使用了一种高分辨率场发射扫描电子显微镜（HR-FESEM，型号JEOL JSM-7900F），加速电压范围为0.01至30千伏，放大倍数介于25至1,000,000倍之间。该显微镜配备有LED（下电子探测器）和UED（上电子探测器：透镜内探测器）。将10微米厚的胎盘组织样本放置在新碳黏贴带上，然后在1千伏和2.0千伏下进行成像
结果与讨论
为了验证该关联方法的准确性，首先对含有外嵌木炭颗粒的对照胎盘组织进行了初步测试。在1千伏加速电压下使用SEM拍摄的显微图像显示，黑碳颗粒在胎盘表面呈不规则、角状、聚集的形态，与周围生物结构明显不同（见图1（a）（i）和（c）（i））
结论
本研究建立了一种可靠、非破坏性的方法，可以明确识别人体胎盘组织中的外源性黑碳沉积。该方法的优点在于结合了高分辨率形态学成像和精确的元素比例分析，能够清楚区分碳基污染物和原生生物基质。研究结果直接证明了吸入的黑碳颗粒能够转移到胎盘
资助信息
本研究未获得公共、商业或非营利部门的任何特定资助。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本文是加尔维塔·帕里克（Garvita Parikh）博士论文的一部分，将提交给印度甘地讷格尔国家级法医科学大学（National Forensic Sciences University），作者对该校提供的支持表示感谢。
数据共享声明
本手稿报告了原始临床试验数据。数据可应要求提供。
