针对α-突触核蛋白预形成纤维细胞摄取的小分子抑制筛选的高内涵成像工作流

《Methods》：A high-content imaging workflow to screen for molecules that reduce cellular uptake of α-synuclein preformed fibrils

　　

许多神经退行性疾病的典型病理特征是富含蛋白质的聚集体和包涵体的形成。在帕金森病(PD)中，α-突触核蛋白(α-syn)是构成称为路易体(Lewy bodies)的病理性包涵体的主要蛋白质成分。这些α-syn聚集体被假设通过细胞间传递以类似朊病毒的方式传播，充当模板以扩增聚集体的形成。体外生成的α-syn聚集体，通常称为预形成纤维(Preformed fibrils, PFFs)，已被用于在不同模型系统中研究与α-syn介导的病理学相关的多个方面。在此，研究人员描述了一种半自动化检测方法，用于筛选干扰PFFs细胞摄取和积累的小分子。该检测使用了由人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)衍生的多巴胺能祖细胞(Dopaminergic progenitor cells, DPCs)。在初步筛选中，研究人员测试了1520种小分子，并鉴定出几种在DPCs中强烈降低细胞内PFF负荷的分子。从这些候选分子中，研究人员在多巴胺能神经元(Dopaminergic neurons, DNs)中进行了验证，以证明该检测的实用性。该检测提供了一种稳健、可扩展且适应性强的工具，用于在hiPSC衍生细胞模型中筛选影响PFF摄取的分子。在该筛选范围内，它导致了一组具有不同注释靶点的化合物被鉴定出来，这些化合物能有效减少DPCs和DNs中α-syn聚集体的积累。

论文标题：

针对α-突触核蛋白预形成纤维细胞摄取的小分子抑制筛选的高内涵成像工作流

关键词：

神经退行性疾病|α-突触核蛋白(α-syn)|预形成纤维(PFFs)|高内涵筛选(HCS)|诱导多能干细胞(hiPSC)|多巴胺能神经元(DN)

摘要翻译：

许多神经退行性疾病的典型病理特征是富含蛋白质的聚集体和包涵体的形成。在帕金森病(Parkinson’s disease, PD)中，α-突触核蛋白(α-synuclein, α-syn)是构成称为路易体(Lewy bodies)的病理性包涵体的主要蛋白质成分。这些α-syn聚集体被假设通过细胞间传递以类似朊病毒的方式传播，充当模板以扩增聚集体的形成。体外生成的α-syn聚集体，通常称为预形成纤维(Preformed fibrils, PFFs)，已被用于在不同模型系统中研究与α-syn介导的病理学相关的多个方面。在此，研究人员描述了一种半自动化检测方法，用于筛选干扰PFFs细胞摄取和积累的小分子。该检测使用了由人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells, hiPSCs)衍生的多巴胺能祖细胞(Dopaminergic progenitor cells, DPCs)。在初步筛选中，研究人员测试了1520种小分子，并鉴定出几种在DPCs中强烈降低细胞内PFF负荷的分子。从这些候选分子中，研究人员在多巴胺能神经元(Dopaminergic neurons, DNs)中进行了验证，以证明该检测的实用性。该检测提供了一种稳健、可扩展且适应性强的工具，用于在hiPSC衍生细胞模型中筛选影响PFF摄取的分子。在该筛选范围内，它导致了一组具有不同注释靶点的化合物被鉴定出来，这些化合物能有效减少DPCs和DNs中α-syn聚集体的积累。

论文解读：

研究背景与意义

帕金森病(PD)及其他突触核蛋白病的经典病理标志是路易体(Lewy bodies, LBs)的积累，其主要成分是错误折叠和纤维化的α-突触核蛋白(α-synuclein, α-syn)。近期研究表明，α-syn聚集体可能通过类似朊病毒的机制在神经元之间传播，细胞外环境中的聚集体被邻近细胞摄取后作为种子诱导内源性α-syn的错误折叠和聚集，从而导致病变扩散。因此，干扰α-syn聚集体（特别是体外标准化的预形成纤维Preformed fibrils, PFFs）的细胞摄取和积累被认为是PD治疗中极具潜力的靶点。尽管已有研究使用永生化细胞系、原代培养物和hiPSC衍生细胞进行PFF相关研究，但针对大规模药物筛选的可扩展、稳健且生理相关性高的模型仍具挑战性。为此，本研究旨在开发一种基于hiPSC衍生细胞的高通量筛选工作流，以识别能够减少PFF摄取的小分子。

主要技术方法概述

研究人员利用健康供体来源的hiPSC系(AIW002-02)分化为腹侧中脑多巴胺能祖细胞(DPCs)及成熟多巴胺能神经元(DNs)。通过重组表达并纯化GST标签的α-syn，去除标签后经震荡诱导纤维化，超声制备PFFs，并使用Alexa Fluor荧光染料标记。细胞接种于384孔板，给予待测化合物预处理后加入荧光标记的PFFs，孵育固定后进行高内涵成像(High-content imaging)分析。图像分析软件通过识别细胞核(Hoechst染色)并扩展掩膜(mask)来量化核周区域的PFF信号强度。研究人员首先优化了PFF浓度和时间曲线，并利用已知抑制剂(肝素Heparin、Rottlerin、Tilorone)验证了检测体系。随后对包含1520种FDA/EMA批准药物的Prestwick化学库进行了初筛，阳性结果在DPCs中进行剂量反应验证，并最终在分化的DNs中进行二次确认。

研究结果

1. 多巴胺能神经祖细胞的表征

研究人员首先对用于筛选的DPCs进行了严格的质量控制。免疫荧光(IF)染色显示，超过80%的细胞表达神经前体细胞标志物Nestin、SOX1、LMX1A和TUBβ3，而不表达早期神经外胚层标志物PAX6，表明细胞处于晚期神经祖细胞阶段。qPCR分析进一步证实，干性标志物(Nanog, Oct3/4)仅在hiPSCs中高表达，而增殖标志物Ki67在DPCs中已下调。神经前体标志物(SOX1, FOXA2, Nestin)在DPCs中高表达，并在分化过程中逐渐下降；泛神经元标志物(TUBβ3, MAP2)和多巴胺能谱系标志物(TH, NURR1等)则在DPCs向DNs分化过程中持续或递增表达。这些数据证实了诱导方案产生了一个几乎完全由DPCs组成的群体，适用于评估小分子对α-syn聚集体积累的影响。

2. PFF在DPCs中积累的测定优化与分析

研究人员优化了DPCs对PFF摄取的检测参数。PFFs主要在核周区域积累。通过高内涵成像软件设定分析流程：识别Hoechst染色的细胞核，扩展掩膜至核周空间，测量该区域内的PFF总荧光强度。PBS洗涤足以去除细胞外PFF信号，无需Trypan Blue淬灭。通过比较Alexa488和Alexa633标记的PFF，发现两者摄取模式相似，最终选用Alexa488-PFF并设定浓度为80 nM，孵育时间为24小时，以获得稳健的信号且无细胞毒性迹象。

3. 工具化合物的表征

研究人员测试了三种已报道的PFF摄取抑制剂：肝素(Heparin)、Rottlerin和Tilorone。三者均能剂量依赖性地降低细胞内PFF负荷，最高剂量下减少幅度超过80%。值得注意的是，Rottlerin在高浓度下导致细胞核面积减小、核染色增强及细胞数量轻微下降，提示潜在的细胞毒性或凋亡迹象。相比之下，肝素虽在一定浓度范围内降低了细胞数量，但未改变核形态参数，推测可能是通过干扰细胞粘附而非细胞毒性起作用。Tilorone则未显著影响细胞计数和核参数。这证实了该检测方法不仅能评估PFF负荷变化，还能通过核参数反映化合物对细胞状态的影响。

4. 已知药理活性化合物库的筛选

利用优化的检测流程，研究人员筛选了包含1520种FDA/EMA批准药物的Prestwick化学库。筛选板布局包含阳性和阴性对照。结果显示，Z'值(Z-prime values)均大于0.6（最高达0.75），表明检测具有优异的动态范围和稳健性。瀑布图分析显示，约7.1%（108种）的化合物使PFF信号降低了至少50%。然而，结合细胞计数作为毒性指标进行过滤后发现，大量降低PFF信号的化合物同时也显著减少了细胞数量。这表明细胞应激和毒性是该检测中的主要干扰因素，需在后续分析中剔除假阳性。

5. DPCs中活性化合物的确认

研究人员选取了52种在初筛中使PFF降低至少50%且细胞计数影响较小的化合物进行剂量反应验证（12至0.4 μM）。在最高测试浓度下，50种化合物确认有效。综合考虑PFF降低幅度（>30%）及对细胞计数和核面积的影响，最终有17种化合物显示出浓度依赖性的抑制作用且无显著细胞毒性。这些活性化合物涵盖了多种功能类别，包括抗疟药（奎宁类）、心脏糖苷类（钠钾ATP酶抑制剂）、酪氨酸激酶抑制剂等。

6. DNs中化合物的验证

为了确认活性在更成熟的神经元中是否保留，研究人员将筛选出的12种活性化合物在分化两周的DNs中进行了测试。结果显示，所有测试的化合物在DNs中均能浓度依赖性地减少PFF积累（最大降幅60%-80%），其有效剂量范围与在DPCs中观察到的相似。特别值得注意的是，在DPCs中引起细胞计数下降的心脏糖苷类药物（如地高辛Digoxin）在DNs中并未表现出细胞毒性，这可能是因为DNs之间通过复杂的轴突网络相互稳定，防止了细胞脱落。这一结果证实了基于DPCs的筛选能够有效识别出在成熟神经元中也具有活性的分子。

结论与讨论

本研究建立了一种半自动化的高内涵成像工作流，用于量化人iPSC衍生的DPCs和DNs中PFF的积累。该工作流利用DPCs的可扩增性和操作简便性，实现了对大型化合物库的高效筛选，并通过在成熟DNs中的验证确保了结果的生理学相关性。研究发现，许多能降低PFF信号的化合物往往伴随着细胞毒性，强调了在筛选中纳入细胞健康参数（如核形态和细胞计数）的重要性。最终鉴定的活性化合物包括酪氨酸激酶抑制剂（Bosutinib, Vandetanib）、溶酶体亲嗜性药物（Chloroquine, Quinacrine）和心脏糖苷类等，其中部分分子的作用机制已在其他研究中得到印证。例如，Src和EGFR激酶的抑制已被报道可减少PFF摄取，而溶酶体功能干扰可能影响PFF的细胞内运输。尽管该检测目前仅基于终点测量，无法直接阐明化合物作用的具体步骤（如内吞、降解或胞吐），但它提供了一个强大的平台，可用于未来针对特定生物学步骤的靶向筛选，以及比较不同PD患者来源iPSC细胞系的PFF摄取差异，为PD治疗新策略的开发提供了有价值的工具。该研究发表于《Methods》期刊。