《Microbes and Infection》：Evolutionary insights and antibiogram analysis of extended-spectrum β-lactamase producing Escherichia coli from bovine subclinical mastitis in Pakistan
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古尔巴兹·安瓦尔（Gulbaz Anwar）| 穆罕默德·伊贾兹（Muhammad Ijaz）| 阿斯拉兰·艾哈迈德（Arslan Ahmed）| 穆罕默德·乌马尔·贾维德（Muhammad Umar Javed）| 玛丽亚·巴图尔（Maria Batool）| 哈姆扎·拉希德（
古尔巴兹·安瓦尔（Gulbaz Anwar）| 穆罕默德·伊贾兹（Muhammad Ijaz）| 阿斯拉兰·艾哈迈德（Arslan Ahmed）| 穆罕默德·乌马尔·贾维德（Muhammad Umar Javed）| 玛丽亚·巴图尔（Maria Batool）| 哈姆扎·拉希德（Hamza Rasheed）| 基赫克尚·沙希德（Kehkshan Shahid）| 马赫帕拉·萨夫达尔（Mahpara Safdar）| 阿什拉夫·阿里（Ashraf Ali）
巴基斯坦拉合尔市兽医与动物科学大学兽医学系，邮编54000
摘要
产生扩展谱β-内酰胺酶（ESBL）的大肠杆菌（E. coli）已经成为一个重大挑战，由于其结构适应性和日益增加的耐药性模式，限制了治疗选择。本研究旨在了解与亚临床乳腺炎（SCM）相关的产生ESBL的大肠杆菌的分子流行病学，并结合抗菌图谱分析对β-内酰胺酶进行了计算建模。共检测了84份牛奶样本以判断是否存在SCM并鉴定大肠杆菌。使用双盘协同测试（DDST）对ESBL分离株进行表型检测，随后通过分子检测确认blaTEM基因的存在。通过计算结构分析确定了β-内酰胺酶的序列和结构特征，以及其对各种抗生素的体外敏感性。共有173份样本（45.05%）检测出亚临床乳腺炎，其中43份（24.85%）的牛奶样本中确认存在大肠杆菌。此外，13份大肠杆菌分离株的DDST结果为阳性，16份（37.21%）检测到了blaTEM基因。对产生ESBL的分离株进行的系统发育分析表明，即使地理来源不同，它们之间也存在密切的遗传关联。β-内酰胺酶的计算结构分析显示了显著的序列保守性、多个高置信度的磷酸化位点以及中等程度的结构稳定性，表明β-内酰胺酶蛋白的基本功能特征得到了保留。大肠杆菌分离株对阿莫西林和四环素的耐药性最高，其次是多西环素和环丙沙星。本研究得出结论，产生ESBL的大肠杆菌是牛亚临床乳腺炎中的主要病原体，计算分析为β-内酰胺酶蛋白的功能动态提供了重要见解，为抗菌监测和控制策略提供了宝贵信息。
引言
牛乳腺炎是影响牛和水牛的最常见疾病，会通过改变牛奶的质量和数量以及增加淘汰率造成重大经济损失。乳腺炎是奶牛中最昂贵的疾病，可分为临床乳腺炎和亚临床乳腺炎（SCM）[1]。临床乳腺炎通过牛奶的明显变化来检测，而SCM则通过测定体细胞计数来确认[2],[3]。在牲畜中，SCM比临床乳腺炎更为普遍[4]。尽管如此，各种宿主和农场相关的风险因素在牛乳腺炎的流行中起着重要作用[5]。
在各种病原体中，如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）和牛棒状杆菌（Corynebacterium bovis）中，革兰氏阴性细菌约占乳腺炎病例的30–40%[6]。在各种革兰氏阴性细菌中，大肠杆菌是导致乳腺炎的重要病原体[7]。由于广泛的存在和抗菌素耐药性，大肠杆菌引起的乳腺炎已成为全球乳制品行业的一个问题，其中ESBL酶主要来自大肠杆菌[8]。由ESBL引起的广泛抗菌素耐药性（AMR）通过破坏β-内酰胺环来传递抗生素耐药性[9]。此外，在产生ESBL的大肠杆菌中广泛识别的基因是blaTEM和blaCTX-M[10]。产生ESBL的大肠杆菌对治疗细菌感染构成了重大威胁[11]。
多种感染中日益增加的抗菌素耐药性趋势是先进医疗保健面临的关键障碍[12],[13]。抗菌素耐药性使治疗细菌感染变得更加复杂，从而对全球公共卫生产生重大影响[14],[15]。对抗生素的过度使用加剧了对抗菌素耐药性的威胁，对动物、人类和环境健康构成了严重威胁[16],[17]。产生ESBL的大肠杆菌的出现不断增加，阻碍了细菌感染的治疗，导致了多重耐药性（MDR）细菌的出现[18]。
β-内酰胺酶合成的复杂遗传基础整合了多种遗传成分和基因，促进了耐药性的发展和传播[19]。计算结构分析有助于深入理解蛋白质的结构及其稳定性，从而识别β-内酰胺酶的耐药机制。本研究的目的是调查牛亚临床乳腺炎的流行情况及其相关风险因素。研究对象包括大肠杆菌中blaTEM基因的基因型鉴定以及β-内酰胺酶蛋白的计算结构建模。为了减轻抗菌素耐药性的负担和乳制品行业的经济损失，进行了抗生素敏感性试验以测量抗生素耐药性。本研究强调了特定干预措施的进步和加强措施，以应对日益严重的抗菌素耐药性问题。
章节摘录
样本量和采样技术
本研究分析了来自巴基斯坦旁遮普省卡苏尔区（Kasur）8个奶牛场（Kasur、Kot Radha Kishan、Chunian和Pattoki）的84份牛奶样本（图1）。2025年3月至2025年9月期间，每个奶牛场共收集了48份样本，采用方便的采样方法确保样本的均匀代表性[20]。同时完成了预先设计的数据收集表。
亚临床乳腺炎、E. coliTEM基因的流行情况
在收集的84份牛奶样本中，共有173份（45.05%）样本检测出亚临床乳腺炎，其中牛的患病率为90%（46.87%），水牛为83%（43.23%），基于CMT结果（图2）。培养和生化检测确认43份牛奶样本中存在大肠杆菌。PCR验证了表型阳性的大肠杆菌分离株。根据DDST结果，13份分离株被确认为产生ESBL的大肠杆菌。
讨论
在奶牛养殖中评估亚临床乳腺炎对于研究畜牧业面临的挑战至关重要。SCM会对牛奶质量产生负面影响，导致经济损失以及可能的健康风险[36]。全球SCM的流行率为42%[37]。当前研究发现，牛和水牛中SCM的流行率分别为90%（46.87%）和83%（43.23%），与之前的研究结果一致[38]。本研究的结果超过了之前的发现[39]。
结论
本研究得出结论，产生ESBL的大肠杆菌是牛亚临床乳腺炎的主要病原体，这些分离株表现出显著的抗菌素耐药性模式。这些发现突显了有效治疗和管理感染的潜在挑战。此外，该研究提供了关于β-内酰胺酶介导的耐药性的遗传多样性和可能机制的见解，为抗菌监测和控制提供了有用信息。
作者贡献声明
马赫帕拉·萨夫达尔（Mahpara Safdar）： 数据整理。基赫克尚·沙希德（Kehkshan Shahid）： 方法学。哈姆扎·拉希德（Hamza Rasheed）： 可视化。玛丽亚·巴图尔（Maria Batool）： 验证。穆罕默德·乌马尔·贾维德（Muhammad Umar Javed）： 撰写 – 审稿与编辑。阿斯拉兰·艾哈迈德（Arslan Ahmed）： 形式分析。穆罕默德·伊贾兹（Muhammad Ijaz）： 监督、概念化。古尔巴兹·安瓦尔（Gulbaz Anwar）： 初稿撰写。阿什拉夫·阿里（Ashraf Ali）： 数据整理
伦理批准
本研究中涉及动物的所有实验均符合巴基斯坦拉合尔兽医与动物科学大学（UVAS）伦理审查委员会的机构指南。
利益冲突声明
所有作者均已阅读并批准了手稿的最终版本，不存在利益冲突。
致谢
作者感谢拉合尔兽医与动物科学大学兽医学系的医学研究实验室（MRL）提供化学试剂和实验用品。
