槲皮素通过AMPK/mTOR通路调节自噬作用，从而减轻LTA诱导的乳腺上皮细胞紧密连接损伤

《Molecular Immunology》：Quercetin attenuates LTA-induced tight junction disruption in mammary epithelial cells by modulating autophagy via the AMPK/mTOR pathway

　　

梁丽 Song|李向晨|王琳楠|刘俊|肖龙飞

宁夏大学动物科学与技术学院，中国银川 750021

摘要

奶牛的乳腺炎会损害泌乳能力，并限制奶牛产业的发展。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）产生的脂壁酸（LTA）会破坏乳腺中的血乳屏障。槲皮素（quercetin）以其抗炎和抗菌特性而闻名，本研究评估了其对LTA诱导的紧密连接（TJ）损伤的保护作用。我们使用经过LTA处理的MAC-T细胞（一种乳腺上皮细胞系）和小鼠乳腺组织建立了TJ损伤模型。结果表明，LTA会破坏TJ的完整性并诱导MAC-T细胞中的自噬失调。值得注意的是，槲皮素处理能够抑制这种自噬失调，并减轻LTA引起的TJ蛋白表达紊乱。进一步的机制研究表明，槲皮素和化合物C（Compound C，一种AMPK抑制剂）都能降低自噬水平，并减轻LTA引起的关键TJ蛋白的下降，表明槲皮素在炎症应激下有助于减轻LTA引起的TJ完整性破坏，这与AMPK磷酸化和mTOR信号通路的调节变化有关。体内小鼠实验证实，槲皮素作为一种双重作用调节剂，既能调节基础信号通路，又能减轻LTA引起的TJ蛋白损伤。这一保护机制是通过调节AMPK/mTOR依赖性的自噬来实现的，从而抑制LTA引起的自噬失调。这些发现为进一步探索非抗生素的乳腺炎控制策略提供了理论基础。

引言

作为奶牛四大主要疾病之一，乳腺炎在中国乃至全球的感染率和发病率都非常高（Hu等人，2020年）。这种疾病不仅影响牛奶的成分和营养价值，还影响动物健康和卫生质量，导致与乳制品相关的巨大经济损失。据报道有超过150种病原体可引起乳腺炎（Bradley，2002年），其中金黄色葡萄球菌（S. aureus）是最常见的致病菌（Klein等人，2012年；Rana等人，2022年；Zhu等人，2024年），其产生的脂壁酸（LTA）能够破坏乳腺上皮细胞，严重扰乱免疫活性和血乳屏障（Burtchett等人，2023年；Rainard等人，2022年）。乳腺上皮细胞的紧密连接（TJ）是血乳屏障的结构基础，需要多种蛋白质的参与，其中zonula occludens-1（ZO-1）、Claudin-1和Occludin对于维持上皮细胞完整性至关重要（Tsugami等人，2020年；Visser等人，2009年；Wang等人，2023年）。多项研究表明，炎症会降低包括皮肤、乳腺和肠道在内的多种器官中的TJ蛋白表达，从而破坏TJ的结构（De Benedetto等人，2011年；Stelwagen，2001年；Vaziri等人，2012年）。

有研究表明，自噬在调节上皮细胞TJ完整性方面起着作用（Nighot和Ma，2016年）。自噬的分子调节涉及多种信号通路，通常以哺乳动物雷帕霉素靶标（mTOR）信号通路为代表。mTOR通过一种负反馈机制抑制自噬，而这种机制又受到MAPK/ERK、腺苷单磷酸活化蛋白激酶（AMPK）和PI3K/Akt等多种信号通路的调控。AMPK在纤维化调节中起着关键作用。在研究肠道中的Stenotrophomonas maltophilia通过受损的肠道和血乳屏障迁移到乳腺引起的乳腺炎时，赵琪等人（He等人，2023年）发现，抑制AMPK并激活mTOR信号通路可以保护血乳屏障，减少有毒物质或炎症因子的进入。此外，刘松奇等人（Liu等人，2021年）在研究薄荷醇治疗乳腺炎的研究中发现，薄荷醇通过激活AMPK抑制mTOR信号通路和自噬来恢复血乳屏障。总之，血乳屏障的调节机制非常复杂，需要通过对AMPK/mTOR信号通路的研究来阐明其对奶牛乳腺炎的影响。

槲皮素是一种广泛存在于各种水果、蔬菜、花卉和草药中的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗病毒、抗炎、抗纤维化、抗肿瘤等多种生物活性，具有很高的药用价值（Batiha等人，2020年；Xu等人，2019年）。据报道，槲皮素不仅可以恢复炎症性肠上皮细胞中的TJ蛋白表达，还可以通过调节肠道黏膜屏障上的TJ蛋白和自噬来改善脂多糖（LPS）诱导的十二指肠炎症（Sultana等人，2013年）。然而，目前尚不清楚槲皮素是否可以通过AMPK/mTOR信号通路在表达水平上调节TJ蛋白和自噬相关蛋白。

在这项研究中，我们使用LTA处理的MAC-T细胞（一种乳腺上皮细胞系）和小鼠乳腺组织建立了TJ损伤模型，并探讨了槲皮素减轻LTA引起的乳腺上皮细胞TJ完整性破坏的分子机制。这项研究为开发新的药物策略预防和治疗牛乳腺炎提供了理论基础。

章节摘录

主要试剂

从实验室冻存中获得的MAC-T细胞；LTA（默克化学技术有限公司，编号：L3140）；胎牛血清（Gibico，产品编号：16000–044）；胰蛋白酶、双抗体、DMEM/F-12培养基、β-actin、FITC标记的山羊抗兔IgG（武汉赛诺菲生物技术有限公司，产品编号：G4010–mL、G4003–mL、G4612–mL、GB15003–100、GB22303）；RIPA裂解液（白色鲨鱼试剂，产品编号：BL504A）；槲皮素（上海麦克莱恩生化技术有限公司，编号：

LTA对TJ和相关自噬蛋白表达的影响

为了确定LTA在MAC-T细胞中引起的TJ功能障碍的严重程度，检测了LTA处理后MAC-T细胞中的TJ蛋白表达情况。随着LTA浓度的增加，TJ蛋白（ZO-1、Occludin和Claudin-1）的表达逐渐减少（图1）。除了Claudin-1之外，ZO-1和Occludin在10 μg/mL LTA组中的蛋白表达下降最为显著。至于与自噬相关的蛋白LC3

讨论

乳腺炎是奶牛四大主要疾病之一，在中国乃至全球的感染率和发病率都非常高。金黄色葡萄球菌是最常见的致病菌，可能导致奶牛生产性能和牛奶质量显著下降。研究表明，金黄色葡萄球菌的毒力因子会破坏乳腺上皮细胞，严重扰乱免疫活性和血乳屏障。

结论

本研究利用LTA处理的MAC-T细胞和小鼠乳腺组织模型，探讨了槲皮素对乳腺紧密连接（TJ）损伤的保护作用及其机制。我们的发现表明，作为一种多靶点药物，槲皮素不仅调节基础信号状态，还能减轻LTA引起的屏障完整性和自噬通路的紊乱。因此，它通过保护乳腺紧密连接完整性来发挥其作用。

资助感谢

本研究得到了宁夏自然科学基金（资助编号：2021AAC03040）、北京农业大学传统中医兽医重点实验室开放项目（资助编号：BUAOP202310）和九江基础研究项目（资助编号：S2024KXJJ001）的支持。

CRediT作者贡献声明

梁丽：撰写 – 原初草案、数据可视化、方法学设计、实验实施、数据分析。李向晨：撰写 – 审稿与编辑、数据可视化、方法学设计。王琳楠：撰写 – 审稿与编辑、实验设计。刘俊：撰写 – 审稿与编辑、方法学设计、实验实施。肖龙飞：撰写 – 审稿与编辑、验证、实验监督、方法学设计、数据分析、概念构建。

利益冲突声明

作者声明没有可能影响研究公正性的利益冲突。