以耐石油的革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌为食的Colpoda aspera的生命周期可塑性

《Journal of Eukaryotic Microbiology》：Life Cycle Plasticity of Colpoda aspera Fed With Petroleum Tolerant Gram-Positive and Gram-Negative Bacteria

　　摘要

土壤在受到污染后恢复取决于存活的微生物群落重建微生物食物网的能力。纤毛虫Colpoda aspera和Brevundimonas sp.、根瘤菌Rhizobium sp1、Rhizobium sp2（革兰氏阴性）、芽孢杆菌Bacillus sp1、Bacillus sp2以及Microbacterium sp.（革兰氏阳性）在受到轻质石油污染后仍能保持活性。我们使用相位对比显微镜观察了将65个囊肿放入含有0.5% LNA培养基的培养皿中，并加入100 μL来自受污染土壤的5.2 × 10^8个细菌接种物的情况下，C. aspera的脱囊时间和囊肿产生情况。C. aspera的脱囊过程每小时被记录三次，持续72小时。结果显示，当以革兰氏阴性细菌（特别是Rhizobium sp2和Brevundimonas sp.）为食时，脱囊速度更快且产生的囊肿数量更多。相比之下，当以Microbacterium sp.为食时，C. aspera只产生两个子细胞，从而减少了繁殖的数量和速度。这种繁殖行为可能允许其他捕食性纤毛虫在Microbacterium sp.在土壤中占优势时共同生存。了解纤毛虫的进食偏好和营养价值对于理解资源分配以及制定促进微生物群落恢复的策略至关重要。

1 引言

土壤在受到污染后的恢复依赖于存活的微生物群落来代谢污染物并恢复微生物食物网，以支持植物的生长和生产力（Mondragón-Camarillo等人，2020年；Jia等人，2023年）。植物的生产力依赖于能够提供可吸收形式的氮、磷、铁和其他多种代谢物的促生长细菌（Rodríguez和Fraga，1999年；Egamberdiyeva和H?flich，2004年；Berg，2009年；Naqqash等人，2020年；Hawxhurst等人，2023年）。植物间接依赖于食细菌的生物体，这些生物体释放出被细菌生物量捕获的营养物质，从而产生腐殖质有机物并提高土壤肥力（Clarholm，1985年；Griffiths，1986年；Rodríguez和Fraga，1999年；Egamberdiyeva和H?flich，2004年；Berg，2009年；Naqqash等人，2020年；Hawxhurst等人，2023年）。在食细菌的生物体中，纤毛虫对细菌的反应速度比其他食细菌的生物体更快。纤毛虫的捕食活动刺激了细菌的生长，这通过释放氮和磷等必需营养物质形成了一个正反馈循环，这些营养物质对植物来说更容易被吸收（Bamforth，1995年；Acosta-Mercado和Lynn，2004年；Hines等人，2020年；Martínez-Reyes等人，2022年）。原生动物食细菌者将微生物生产者与更高层次的土壤食物网联系起来，形成了微生物组与土壤中型动物之间的强大纽带（Foissner，2014年；Jousset等人，2017年；Asiloglu等人，2021年）。总体而言，植物的生长和土壤肥力取决于土壤食物网的结构，包括细菌和真菌分解者（Bamforth，1995年；Acosta-Mercado和Lynn，2004年；Hines等人，2020年）。食细菌的纤毛虫对细菌种类有一定的选择性——从几乎可以食用任何细菌（包括色素细菌）到仅食用少数几种细菌的特化纤毛虫（Foissner，2016年）。细菌数量的迅速增加通常伴随着以这些细菌为食的纤毛虫数量的增长。当水分有限时，纤毛虫通常会形成囊肿，且较少的活跃细菌会附着在囊肿周围的胶状物上。原生动物种类在土壤系统中的重要性与其囊肿的数量相关（Bamforth，2001年；Foissner，2016年；Hines等人，2020年；Li等人，2024年）。Colpodidae科约占土壤中活跃和休眠纤毛虫的55%（Bamforth，2001年），而Colpoda属在各种土壤中非常丰富，包括森林和耕作区，在受烃类和重金属污染的土壤中尤为明显（Campbell等人，1997年；Bamforth，2001年；Li等人，2010年；Mondragón-Camarillo等人，2020年）。Colpoda aspera在其生命周期中既形成抵抗性囊肿也形成繁殖性囊肿，是少数在暴露于轻质原油后仍能保持活性的纤毛虫之一（Mondragón-Camarillo等人，2020年）。在活跃消耗细菌之后，滋养体形成四细胞囊肿，产生四个子细胞。此外，在食物有限或其他不利条件下也会形成抵抗性囊肿。囊肿的形成过程已有广泛记录（Yamasaki等人，2004年；Müller等人，2010年；Matsuoka，2021年）；然而，Colpoda的激活过程则鲜有报道。我们观察到，来自受石油污染土壤的C. aspera囊肿总是附着有细菌菌株，这使得无法在无菌条件下培养C. aspera。我们的目的是确定这些附着在囊肿上的细菌菌株是否能够触发C. aspera的脱囊，以及这些细菌菌株是否影响囊肿的产生，特别是因为已知其中一些菌株可以促进植物生长。

2 材料与方法

2.1 C. aspera的分离与培养条件

C. aspera是从含有50,000 ppm轻质原油的污染土壤中分离出来的。使用0.5%的LNA培养基（胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 5 g）来培养C. aspera，直到其形成囊肿，这通常发生在7天后。囊肿通过低速离心（3000 rpm）进行浓缩，并在清洗溶液中（1 mM Tris–HCl，pH 7.2，100 μg/mL Amikacin）中保存3小时（Funadani等人，2016年）。附着在囊肿凝胶上的细菌通过两次离心（0.1 mM CaCl2 1% [w/v]、Tween 80% [NP-40] 和 1 mM Tris–HCl [pH 7.2]）洗除，以确保获得无细菌的C. aspera囊肿。从同一污染土壤中分离出三种革兰氏阳性和三种革兰氏阴性细菌菌株，并将其保存在LNA琼脂平板上。首先根据菌落形态的不同进行分离，然后进行16S rDNA鉴定。按照Doyle和Doyle（1987年）的协议提取细菌DNA，并通过1%琼脂糖凝胶电穿孔在100 V电压下电泳30分钟来纯化DNA。随后使用通用引物FD1（5′ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′）和RD1（5′ AAGGAGGTGATCCAGCC 3′）（Weisburg等人，1991年）来扩增16S rDNA。每个菌株的PCR混合物由50 ng模板DNA、0.2 μM dNTP、2.5 mM MgCl2和1.25 U Taq聚合酶组成，最终体积调整为50 μL。然后使用Thermo-Scientific Piko Thermal Cycler进行PCR反应：初始步骤为5分钟95°C，接着是25个循环：变性（30秒，95°C）、退火（40秒，57°C）和聚合（2分钟，72°C）。最后一步为5分钟72°C。所有PCR产物按照制造商说明在Gel Extraction Kit和Clean UP（PureDirex）中在100 V电压下电泳30分钟。这些产物在韩国首尔的Macrogen公司进行测序。随后使用BioEdit程序编辑序列，并与NCBI-BLAST中的序列进行比对。C. aspera通过形态学特征进行鉴定（Foissner，1993年）。

2.2 实验设置

每种细菌菌株都在0.5% LNA培养基中培养。通过比色法测定细菌浓度，将100 μL培养基接种到20 mL新鲜培养基中，并调整至最终浓度为5.2 × 10^8个细菌/mL。之后，接种65个C. aspera囊肿，并在相位对比显微镜（Nikon Eclipse 80i）下40倍放大率下观察1小时以观察脱囊情况。随后每小时观察一次培养物，持续6小时以确定脱囊时间。在C. aspera首次脱囊后的14、18、24、48和72小时分别测定细菌浓度。这一过程对每种细菌菌株重复三次。在24°C下培养72小时后，通过使用相位对比显微镜计算每个细菌菌株引起的C. aspera的世代时间，方法是使用Vater–Dobberstein和Hilfrich公式（Petz等人，1985年）：

其中g表示分裂次数；N1和N2分别表示t1和t2时的细胞数量；c表示每个囊肿的“出生”率；r表示单位时间的分裂率；t表示两次计数之间的时间（t2 - t1）；d表示世代时间。

2.3 统计分析

进行单因素方差分析（one-way ANOVA）以评估C. aspera的世代时间和囊肿产生情况。此外，还进行了独立样本t检验，以比较以革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌为食的细胞之间的脱囊时间。

3 结果

革兰氏阳性细菌菌株鉴定为Bacillus sp1、Bacillus sp2和Microbacterium sp.，三种革兰氏阴性细菌分别为Rhizobium sp1、Rhizobium sp2和Brevundimonas sp.。与C. aspera共培养14小时后，Brevundimonas sp.表现出最大的种群增长，而Bacillus sp2的增长最低。48小时后，革兰氏阴性细菌达到最大生长量，其中Rhizobium sp1最为丰富。相比之下，革兰氏阳性细菌Bacillus sp2和Microbacterium sp.的增长持续到72小时，而所有其他菌株的数量从48小时的水平下降（图1A）。

（A）与C. aspera共培养72小时的六种细菌菌株的种群大小。所有菌株在时间零点（T0）的初始种群大小为5.2 × 10^8 CFU/mL（菌落形成单位）。在C. aspera脱囊后的14、18、24、48和72小时分别对菌株进行计数。（B）C. aspera与每种细菌菌株共培养时的脱囊时间（小时）。（C）C. aspera以不同细菌菌株为食时的世代时间（小时）。（D）C. aspera以六种细菌菌株为食后的囊肿产生率。C. aspera在以革兰氏阴性细菌为食时产生了更多的休眠囊肿。数据为三次重复实验的平均值，误差条表示标准偏差。C. aspera在以革兰氏阴性细菌（如Rhizobium sp2和Brevundimonas sp.）为食时脱囊速度更快，尽管这些菌株之间的脱囊时间没有统计学差异（p < 0.207，大约16小时）。相比之下，以Bacillus sp1和Rhizobium sp1为食时脱囊较慢（18小时），而以Bacillus sp2和Microbacterium sp.为食时介于两者之间（17小时；图1B）。C. aspera以Rhizobium sp1（0.42 ± 0.01小时）和Brevundimonas sp.（0.44 ± 0.01小时）为食时的世代时间较短（p < 0.32），但以Microbacterium sp.为食时世代时间较长（0.47 ± 0.05小时；图1C）。C. aspera在以革兰氏阴性细菌为食时产生的囊肿数量多于革兰氏阳性细菌；然而，这种差异不显著（p < 0.063）。C. aspera以Rhizobium sp1为食时产生的囊肿最多，其次是Brevundimonas sp.和Rhizobium sp2（图1D）。C. aspera的生命周期根据提供的细菌菌株不同而表现出两种不同的繁殖囊肿形态。当以Bacillus sp1、Bacillus sp2、Brevundimonas sp.、Rhizobium sp1和Rhizobium sp2为食时，C. aspera表现出典型的四分裂繁殖囊肿（图2A），一旦脱囊，四个滋养体会立即开始消耗细菌。然而，当以Microbacterium sp.为食时，C. aspera首先生成四细胞繁殖囊肿（图2B），之后每个滋养体分裂产生两个新的滋养体（图2C）。以Microbacterium sp.为食时也产生四细胞囊肿，但分为两个步骤完成。

4 讨论

纤毛虫在土壤条件不利时会形成囊肿并进入休眠状态，直到土壤条件再次变得适宜。Colpoda属物种在以活跃生长的细菌为食时形成繁殖囊肿。据推测，脱囊是由细菌释放的肽或蛋白质激活的，并被原生动物感知到的（Yamasaki等人，2004年；Matsuoka，2021年）。关于这些信号的功能及其在不同物种间的特异性，目前的信息不足。革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌之间的信号存在显著差异，其中Colpodidae对革兰氏阴性细菌的反应更快。在本研究中，都是革兰氏阴性的Rhizobium sp2和Brevundimonas sp.引发了C. aspera更快的脱囊反应。然而，Brevundimonas sp.需要比Rhizobium sp2更高的种群密度才能诱导C. aspera脱囊，表明需要更高的信号浓度才能达到C. aspera检测到囊肿的阈值。同样，C. aspera需要比Brevundimonas sp.更高的Bacillus sp1（革兰氏阳性）和Rhizobium sp1（革兰氏阴性）种群密度才能触发脱囊（图1A,B）。此外，这一过程所需的时间更长，尽管它们的种群密度高于Microbacterium sp.和Bacillus sp2。这些差异表明细菌产生了多种化学信号，每种细菌可能具有独特的信号通信方式。这使得信号受体能够检测到生物膜内或围绕C. aspera囊泡的特定细菌种类的存在。然而，化学信号仅仅是C. aspera进行捕食过程的一个方面；还需要其他条件来触发这些原生动物的出囊。必须检测到其他类型的次级代谢产物的产生、细胞壁结构以及与革兰氏染色无关的化合物（Chandarana等人，2022年）。越来越多的证据表明，原生动物对革兰氏阴性细菌有更强的偏好。例如，Tetrahymena pyriformis对Xanthomonas retroflexus和Stenotrophomonas rhizophila表现出显著的亲和力，这两种细菌都是革兰氏阴性的（Raghupathi等人，2018年）。此外，像Tetrahymena sp.和Chilodonella sp.这样的纤毛虫可以消耗由Pseudomonas sp.（革兰氏阴性）或Serratia plymuthica（革兰氏阳性）组成的生物膜。然而，这两种纤毛虫都更喜欢只含有Pseudomonas sp.的生物膜，这表明它们利用水中的化学信号来定位和区分革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌（Dopheide等人，2011年）。自由生活的土壤变形虫也表现出对革兰氏阴性细菌的强烈偏好。在Dictyostellium discoideum的情况下，它对Pseudomonas fluorescens的偏好归因于这种细菌产生的高水平cAMP，这是一种对变形虫有强烈吸引力的化学物质（Rashidi和Ostromski，2019年）。运动能力和细胞大小也会影响原生动物对革兰氏阴性细菌的偏好（Dopheide等人，2011年）。Colpoda aspera与其他原生动物一样，对革兰氏阴性细菌有很强的偏好，并且在仅以Rhizobium sp1或Brevundimonas sp.为食时，其世代时间更短（图1C,D），这表明C. aspera可以从这些细菌中获取细胞生长和繁殖所需的所有营养。这证实了这些纤毛虫几乎可以在土壤湿润后立即适应这些细菌的快速繁殖，解释了它们在严重受干扰的土壤中丰富的原因（Mondragón-Camarillo等人，2020年）。在72小时内，革兰氏阴性细菌的繁殖速率高于革兰氏阳性细菌，从而为C. aspera提供了更多的细菌生物量，实验结束后产生的囊泡数量也更多。在自然系统中，这种捕食行为可能通过释放生物膜中固定的营养物质并腾出空间来促进细菌的生长（Risse-Buhl等人，2012年）。之前已有报道指出细菌存在于原生动物囊泡内部，例如在Dictyostelium和Acanthamoeba属中。这些观察结果的生态学意义仍有争议，因为变形虫可能会将这些细菌作为额外的食物来源，而细菌甚至可能产生保护变形虫免受病原体或竞争者侵害的化合物，从而获得生态优势（DiSalvo等人，2014年；Shi等人，2021年）。细菌经常被困在纤毛虫囊泡周围的黏液中，在纤毛虫出囊后成为食物来源（Verni和Rosati，2011年；Li等人，2022年）。对于C. aspera来说，细菌既存在于囊泡周围也存在于囊泡内部。这种现象可能反映了一种策略，有利于两种生物在不利环境条件下的生存和持续存在，表明在受污染的环境中纤毛虫与细菌之间存在着更复杂和更有弹性的生态关系。

4.1 C. aspera的生命周期

C. aspera与这一属的所有其他成员一样，形成了一个四倍体的生殖囊泡，通过无性繁殖产生四个子细胞（Lüftenegger等人，1985年）。有时，也会形成二倍体（两个子细胞）或八倍体（八个子细胞）的囊泡（Padnos等人，1954年）。尽管观察到了这种变异性，但没有解释为什么会出现这些变化。在我们的研究中，仅用五种细菌中的每一种喂养C. aspera都为纤毛虫提供了足够的营养来产生四倍体囊泡。然而，当只以Microbacterium sp.（革兰氏阳性）为食时，C. aspera的繁殖策略发生了变化。它没有形成四倍体囊泡，而只形成了二倍体囊泡，其中每个子细胞再次分裂，最终产生四个子细胞。我们将这种繁殖策略的变化归因于摄入的Microbacterium sp.消化不良或缺乏营养。Microbacterium sp.中缺失的营养物质或分子可能是形成四倍体囊泡所必需的，导致C. aspera只能形成二倍体细胞，因此需要两个步骤来完成这一过程。C. aspera的这种替代繁殖形式比常见的四倍体形式效率较低。因此，使用Microbacterium sp.产生的囊泡数量比使用其他革兰氏阳性细菌产生的囊泡数量少，尽管使用Microbacterium sp.产生的囊泡数量与使用Bacillus sp1和Bacillus sp2产生的囊泡数量没有显著差异（p > 0.94）。纤毛虫可以摄取各种类型的土壤细菌，从而拥有非常多样化的饮食，而不是专门的饮食。通过摄取不同的细菌种类，C. aspera可以获得繁殖所需的多种营养。土壤污染会改变细菌种类组成，根据污染的严重程度，会消除敏感细菌并促进耐药细菌的生长。污染改变了细菌种类的组成，从而减少了对于恢复食物网至关重要的原生动物多样性。C. aspera在受污染土壤中的重要性在于它能够耐受污染，消耗繁茂的土壤细菌，并通过其捕食活动刺激微生物食物网的恢复。无论细菌的可消化性或营养价值如何，C. aspera都会调整其无性繁殖模式并提高繁殖效率以适应污染。

5 结论

C. aspera在以革兰氏阴性的Rhizobium sp2和Brevundimonas sp.为食时，形成的囊泡更快，繁殖速率也更高，相比之下，使用革兰氏阳性的Microbacterium sp.或Bacillus时则不然。与细菌营养含量相关的化学信号似乎起到了作用，因为C. aspera需要更高的革兰氏阳性细菌种群密度才能出囊。C. aspera表现出一种变异的生殖囊泡形式，当仅以Microbacterium sp.为食时，它产生的子细胞数量减少到两对，而不是四对，这表明当这种细菌在土壤中占主导地位时，其他纤毛虫可能会占据优势。为了更好地理解土壤纤毛虫与微生物食物网动态之间的资源分配，需要进一步研究纤毛虫的进食偏好和革兰氏阳性细菌的营养价值。

我们还要感谢PAPIIT IN222618项目的支持。

数据可用性声明

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